反义RNA技术及其应用
作者：汤 郡 张 莉 郭辉玉
单位：汤 郡 张 莉 广州医学院，广州 510182；郭辉玉 中山医科大学，广州 510089
关键词：反义RNA
广州医学院学报990232 中图分类号 Q78
反义RNA(antisense RNA)是一类能与特异mRNA互补的小分子量、可扩散的DNA转录物，它能够从翻译水平、转录水平和核酸复制水平上高度特异地抑制靶基因表达。由于反义RNA能够选择性地关闭特定基因，因而它己成为一种极有价值的研究工具，是被科学家们广泛用来同病毒性疾病、恶性肿瘤、寄生虫感染和遗传性疾病等作斗争的最引人注目的新武器，也是科学家们用来调节基因表达和观察基因表达的有效手段和方法。随着天然反义RNA的发现，人工构建反义RNA来调节基因表达的策略应运而生，并已经取得了较大进展。本文拟就反义RNA作用原理、反义RNA设计和表达载体构建及其在抗病毒、抗肿瘤作用中的应用等进行综述。
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1 反义RNA的作用机理
反义RNA调节作用机理概括起来有以下几点[1，2]：
(1)互补于特定mRNA的非编码区，如SD序列(Shine-Dalgarno序列)上游区，影响核糖体结合，间接抑制翻译；
(2)互补于特定mRNA的SD序列和/或编码区，直接抑制翻译或使mRNA易被核酸酶降解；
(3)作用于靶mRNA的5’端，阻止帽子结构的形成，影响靶mRNA的成熟；
(4)作用于Poly A形成位点，阻止靶mRNA的成熟及向胞浆内转运；
(5)作用于外显子和内含子的连接区，阻止mRNA前体的剪接；
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(6)阻止特定基因的转录。如tic RNA(翻译抑制互补RNA)被认为结合到crpmRNA的5’末端，形成特殊二级结构，并能被RNA聚合酶识别，类似于不依赖Rho蛋白的转录终止信号结构，使转录无法进行。
(7)复制水平的调节作用。例如，大肠杆菌中ColEl质粒的复制，受到一种反义RNA(RNA I)的调节。由于反义的RNA I与引物前体RNA Ⅱ结合后掩蔽了前体分子中RNase H的水解位点，阻止复制引物的产生，使质粒DNA不能复制。
2 人工反义RNA的设计与反义表达载体构建
利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止子之间反向插入一段靶基因，人工构建反义RNA表达载体(病毒表达载体或质粒表达载体)，然后转染细胞并使之在其中稳定表达反义RNA，该反义RNA分子能有效地抑制靶基因表达。设计高效、稳定、特异性强的反义RNA表达载体一般可以考虑以下几个方面：
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2.1 选择特异性靶序列[3，4]
一般认为，在原核细胞中，反义RNA针对靶mRNA的SD序列和AUG区域比针对编码区有更强的调节作用，而互补于编码区不同片段的反义RNA，其抑制程度也各异。在真核系统中，靶序列的选择较复杂。在HSV-TK实验中发现，一个互补于TK mRNA(+50～+1415)序列的反义RNA能抑制TK基因表达约4～5倍；互补于TK mRNA(-80～+343)序列的反义RNA亦有相似的抑制作用。后来发现，互补于5’端非翻译区52nt的反义RNA也能有效地抑制TK基因表达，甚至比一个较长的互补于TK编码区的反义RNA有更强的抑制活性。Volloch等分析了不同靶位反义RNA在体外对mRNA前体剪接的影响，发现互补于mRNA前体剪接部位外显子序列或内含子序列的反义RNA均能强烈抑制mRNA前体的剪接。另据报道，一个只含有225bP TK基因编码区3’片段的反义质粒能有效抑制TK活性。在其转染的细胞株中，95%的TK mRNA局限在胞核内，而在亲本细胞中，大部分TK mRNA在胞浆内。这表明这种反义转录物阻止了TK mRNA向胞浆的转运。此外，有人报道互补于t-PA mRNA 3’末端非编码区的反义RNA注入鼠卵母细胞能阻止靶RNA的多聚腺苷酸化及其翻译。综上所述，在真核细胞中反义RNA靶序列的选择是：(1)互补于前体mRNA的5’末端，能阻止加“帽”反应及翻译：(2)互补于外显子-内含子交界部位，能阻止剪接；(3)互补于3’末端，能阻止mRNA的加“尾”及其由胞核内向胞浆的转运；(4)互补于编码区，能直接阻止核糖体与mRNA的结合与延伸，从而影响翻译。
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2.2 设计高效、稳定的结构
为了增强反义RNA的稳定性，在构建反义RNA表达载体时，有人在反义RNA3’端加上茎环结构、CUUCGG发夹结构或氯霉素乙酰转移酶(CAT)[5]等结构基因，这样产生的反义RNA不仅半衰期长、效果也增强。也有报道，将反义序列以嵌合基因的形式克隆在表达载体中，结果所表达出的反义RNA能更好地发挥抑制作用[6]。
核酶(Ribozyme)的发现，为人工构建高效、特异的反义RNA提供了新的途径。核酶是一类具有酶催化活性、能切割特异RNA序列的RNA分子。它能在GUC或CUC位点切割与它杂交的RNA分子。如果知道mRNA中GUC或CUC的位置。即可将核酶的编码基因插入反义RNA表达载体的适当位置，其转录产生的含核酶的反义RNA就可以与靶mRNA结合，在GUC或CUC位点切割mRNA，达到反义抑制和核酶切割靶mRNA的双重功能，从而加强了对靶基因表达的抑制作用。这也是目前改造反义RNA表达载体的研究重点之一。例如，有人构建了一个含核酶结构的反义CAT RNA的表达载体，所表达出的反义RNA对靶CAT基因表达的抑制作用显著高于不含核酶的反义CAT RNA[7]。Sarver等[8]构建了一个能产生反义gag ribozyme顺序的表达载体，能使被其转染的HeLa细胞兔遭HIV-l感染。
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2.3 提高反义RNA表达水平
为了提高细胞内反义RNA表达的水平，在构建反义表达载体时可使用强的、高效启动子如某些病毒的启动子；也可以在高效表达载体外源基因插入部位克隆进重复的两个或两个以上反义基因；也可以构建反义基因与二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的嵌合体，这种嵌合体基因在转染细胞后，可通过向培养基中加入氨甲碟呤，使反义基因与DHFR基因一起扩增，从而增加细胞内反义RNA水平。此外，有人构建了一个能表达C-ets-2、C-myc及N-ras三个癌基因联合反义RNA的重组逆转录病毒载体。结果显示转化细胞中有较高水平的联合反义RNA表达，细胞生长速率、致瘤能力均明显下降[9]。
2.4 选用新型的真核表达载体系统
随着基因治疗研究工作的开展，各种真核表达性载体层出不穷，如逆转录病毒载体、腺病毒或腺相关病毒载体、痘苗病毒载体等。近来又发展了EB病毒(Epstein-Barr Virus)游离体表达性载体，这种真核表达性载体可以在宿主细胞内以游离体形式存在，并扩增和表达。该载体不仅拷贝数多，而且可避免随机整合进宿主细胞染色体中而造成对宿主细胞基因或反义基因表达的影响[10]。Whitesell等[11]构建反义N-myc RNA的游离体表达载体，转染细胞后能有效地抑制神经母细脆瘤中N-myc基因的表达。而通常的质粒表达载体即使在强启动子下也很难奏效。
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除此以外，在构建反义表达载体时，可选择一些对温度、激素或金属离子敏感的条件表达启动子来控制细胞内反义RNA水平。如地塞米松可诱导真核细胞的小鼠乳腺癌病毒长末端重复序列(MMTV—LTR)启动子下游的基因表达；人金属硫蛋白-IIA(HMT-IIA)基因的启动子可被培养基中所加的Zn2+等二价离子诱导表达。
3 反义RNA的抗病毒作用
病毒是对人和动植物危害极大的病原体，然而对病毒引起的疾病的治疗，目前尚无特效药物与方法。反义RNA却能特异性阻断病毒基因表达和抑制病毒的复制，从而激起许多科学工作者去探索反义RNA治疗病毒性疾病的有效方法。抗病毒反义RNA技术是将特定的病毒基因反向插入到表达险载体中，以构建反义RNA表达载体，再将重组体导入真核细胞(病毒宿主细胞)中表达特异性反义RNA，从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制。文献报道，运用反义RNA技术己经成功地抑制疱疹病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)等对培养的组织细胞的侵袭。用针对植物病毒的反义RNA已培育出具有抗病毒能力的植物。另据报道，针对HIV tat基因的反义RNA和针对gag基因的ribozyme反义RNA表达性载体[8]亦均成功地抑制了HIV在细胞内的增殖，尤以ribozyme反义RNA的抑制效果更强，有可能应用于人类的基因治疗。1987年Chang等报道，用与Rous肉瘤病毒(RSV)5’端非编码区及env基因编码区互补的反义RNA，能够特异地抑制病毒的复制及翻译。1991年Sczakiet等[12]报道，在人T细胞中稳定表达的反义RNA能特异性抑制HIV-1的复制。1994年美国NIH(国立卫生研究院)Chuah等人[13]构建了针对HIV-1 TAR元件(Tat activation response element)的反义TAR逆转录病毒表达载体和反义Tat表达载体进行比较研究发现，反义TAR能显著抑制HIV-1复制，比反义Tat效果更强。并认为反义TAR逆转录病毒载体用于临床HIV-1感染病人的基因治疗可能有发展前景。我国预防医科院病毒所赵小侠等构建了表达HBsAg反义RNA的痘苗病毒重组载体，将此重组体转染到能分泌HBsAg并己被痘苗病毒感染的细胞，观察到HBsAg的合成被特异性地抑制，抑制率最高达95%以上。
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4 反义RNA的抗肿瘤作用
肿瘤的发生是多因素引起的，其中细胞癌基因或/和某些病毒癌基因的异常激活和过度表达是导致细胞恶变的原因之一。如何控制细胞有害基因的表达而在基因水平上治疗恶性肿瘤呢?在目前基因治疗的众多方案中，反义RNA技术是最具吸引力的手段之一。可以设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及某些肿瘤相关病毒的癌基因反义RNA，以阻断这些有害基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。许多证据表明，反义RNA可使肿瘤细胞的表型逆转，形态变化，增殖速度减慢，生存期缩短，软琼脂中克隆能力下降及体内成瘤能力减弱等，而不影响细胞生存所必需的其它基因的表达[1]。
Trojan等[14]利用EB病毒游离体表达载体克隆胰岛素样生长因子(IGF)反义基因，将此重组体转染大鼠C6细胞系，在大鼠模型上实现了胶质母细胞瘤的基因治疗和预防。Yokoyama等报道，利用反义C-myc RNA能使人早幼粒细胞性白血病细胞HL-60生长减慢，呈单核细胞分化。Prockownik等用反义C-myc RNA表达载体转染弗氏鼠红白血病细胞，能加速二甲基亚砜诱导的红细胞样分化。我国学者赵晓航等[15]报道互补于C-myc基因第二外显子及其两侧序列的反义RNA能特异性诱发人食管癌细胞程序性死亡。黄贤明等[9]利用C-ets-2、C-myc和N-ras三个癌基因联合反义RNA能使人肝癌细胞株SMMC-7721生长速率下降约70%，软琼脂集落形成能力及裸鼠致瘤能力显著下降，提示针对多个癌基因的联合反义RNA可能给肿瘤基因治疗提供新的途径。
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ras基因的点突变及ras P21水平升高见于多种肿瘤细胞中。反义Ki-ras RNA能特异性抑制人肺癌细胞中突变的Ki-ras mRNA翻译，而对H-ras和N-ras的表达没有影响。反义H-ras ribozyme在人膀胱癌EJ细胞中表达，能使癌细胞生长受抑，在裸鼠中的致瘤性和转移性降低。路桂荣等[16]用反义C-Ha-ras上游区及exon I反义RNA能使经C-Ha-ras转化的恶性细胞系生长速率减慢，裸鼠中致瘤性降低及肺转移率下降和肿瘤分化程度增加。
胰岛素样生长因子受体(IGF-1 R)对细胞恶性转化表型的建立及维持至关重要[17]。有报道，表达IGF-1 R反义RNA的C6大鼠恶性胶质瘤细胞在同源大鼠中的致瘤性丧失，并能显著抑制对侧接种的野生型肿瘤生长。最近又报道，表达IGF-1 R反义RNA的人黑色素瘤细胞中受体数目显著减少，该细胞的裸鼠致瘤性明显减弱，甚至丧失[18]。
, 百拇医药 最近He等[19]报道，人乳头瘤病毒(HPV)16型E7基因反义RNA不仅能抑制HPV DNA阳性C3小鼠肿瘤生长和诱导肿瘤细胞凋亡，而且能诱导小鼠产生较强的抗肿瘤免疫应答。当把E7反义基因与小鼠IL-12细胞因子基因共同导入小鼠，则后者能增强前者诱导的抗肿瘤免疫应答，使肿瘤完全消退。
在骨分化阶段，前成骨细胞会表达一种T1受体。最近Werenskild等[20]研究表明，成骨骨肉瘤细胞也合成T1受体，利用反义RNA抑制T1受体的表达，则可阻止骨肉瘤细胞成骨作用。表达T1反义RNA的肿瘤细胞在体内发生退行变，体外培养不能表达成骨细胞特有的基因产物，如1型胶原蛋白、碱性磷酸酶及骨钙素等。但抑制Tl受体合成并不影响骨细胞必需的特异性转录因子AML3/CBFA1的表达。
参考文献
1 许风娣，金志军.肿瘤的反义核酸治疗.国外医学生理.病理科学与临床分册，1995；15(3)：149～151
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2 Okamoto K,et al.Mechanism for the autogenous control of the crp operon:transcriptional inhibition by a divergent RNA transcipt.Proc Natl Acad.Sci USA,1986；83(14):5000～5004
3 Hirashima A,et al.Engineering of the mRNA-interfering complementary RNA immune system against viral infection.Proc Natl Acad.Sci USA,1986；83(20):7726～7730
4 Volloch V,et al.Inhibition of pre-mRNA splicing by antisense RNA in vitro:effect of RNA containing sequences complementary to introns.Biochem Biophy Res Commun,1991；179(3):1600～1605
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5 Narayanan BA,et al.Antisense RNA to the putative tumor-suppressor gene DCC transforms Rat-1 fibroblasts.Oncogene,1992；7(3):553～561
6 Sullenger BA,et al.Expression of chimeric tRNA-driven antisense transcripts renders NIH 3T3 cells highly resistant to Moloney murine leukemia virus replication.Mol Cell Biol，1990；10(12):6512～6523
7 Cameron FH,et al.Multiple domains in a ribozymes construct confer increased suppressive activity in monkey cells.Antisense Res Development，1994；4(2):87～94
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8 Sarver N,et al.Ribozymes as potential anti-HⅣ therapeutic agents.Science，1990；247(4947):1222～1225
9 黄贤明，魏曙光，王琳芳等.C-efs-2、C-myc、N-ras三个癌基因联合反义RNA对肝癌细胞恶性表型的逆转.中华肿瘤杂志，1994；16(4)：243
10 Margoiskee RE.Epstein-Barr Virus based expression Vectors.Curr Top Microbiol Immunol,1992；158:67～95
11 Whitesell L,et al.Episome-generated N-myc antisense RNA restricts the differentiation potential of primitive neuroectodennal cell lines.Mol Cell Biol,1991；11(3):1360～1371
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12 Sczakiel G.et al.Inhibition of human immunodeficiency virus type-1 replication in human T cells stably expressing antisense RNA.J Virol，1991；65(1):468～472
13 Chuah MK,et al.Inhibition of human imniunodeficiency virus type-1 by retroviral victors expressing antisense-TAR.Hum Gene Ther,1994；5(12):1467～1475
14 Trojan J,et al.Treatment and prevention of rat glioblastoma by immunogenic C6 cells expressing antisense insulin-like growth factor 1 RNA.Science,1993；259(5091):94～97
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15 赵晓航，王秀琴，彭仁玲等.C-myc反义RNA特异性诱发人食管癌细胞程序性死亡.中国科学(B辑)，1993；23(11)：1185
16 路桂荣，武纯静，柯杨等.C-Ha-ras反义RNA对细胞恶性表型逆转作用的研究.中国科学(B辑)，1991；21(1)：67
17 Sell C,et al .A functional Insulin-like growth factor 1 receptor is required for the mitogenic and transforming activities of the epidermal growth factor receptor.Mel Cell Biol，1994；14(7)4588～4595
18 Resnicoff M,et al.Growth inhibition of human melanoma cells in nude mice by antisense-strategies to the type 1 insulin-like growth factor receptor.Cancer Res，1994；54(18):4848～4850
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19 He YK，et al.Potentiation of E7 antisense RNA-induced antitumor immunity by co-delivery of IL-12 gene in HPV16 DNA-positive mouse tumor.Gene Ther，1998；5(11):1462～1471
20 Werenskiold AK,et al.Suppression of T1-receptor expression by antisense RNA abrogates differentiation of osteogenic osteosarcoma cells.Lab Invest，1999；79(5):529～536
(收稿：1999-03-22), 百拇医药
单位：汤 郡 张 莉 广州医学院，广州 510182；郭辉玉 中山医科大学，广州 510089
关键词：反义RNA
广州医学院学报990232 中图分类号 Q78
反义RNA(antisense RNA)是一类能与特异mRNA互补的小分子量、可扩散的DNA转录物，它能够从翻译水平、转录水平和核酸复制水平上高度特异地抑制靶基因表达。由于反义RNA能够选择性地关闭特定基因，因而它己成为一种极有价值的研究工具，是被科学家们广泛用来同病毒性疾病、恶性肿瘤、寄生虫感染和遗传性疾病等作斗争的最引人注目的新武器，也是科学家们用来调节基因表达和观察基因表达的有效手段和方法。随着天然反义RNA的发现，人工构建反义RNA来调节基因表达的策略应运而生，并已经取得了较大进展。本文拟就反义RNA作用原理、反义RNA设计和表达载体构建及其在抗病毒、抗肿瘤作用中的应用等进行综述。
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1 反义RNA的作用机理
反义RNA调节作用机理概括起来有以下几点[1，2]：
(1)互补于特定mRNA的非编码区，如SD序列(Shine-Dalgarno序列)上游区，影响核糖体结合，间接抑制翻译；
(2)互补于特定mRNA的SD序列和/或编码区，直接抑制翻译或使mRNA易被核酸酶降解；
(3)作用于靶mRNA的5’端，阻止帽子结构的形成，影响靶mRNA的成熟；
(4)作用于Poly A形成位点，阻止靶mRNA的成熟及向胞浆内转运；
(5)作用于外显子和内含子的连接区，阻止mRNA前体的剪接；
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(6)阻止特定基因的转录。如tic RNA(翻译抑制互补RNA)被认为结合到crpmRNA的5’末端，形成特殊二级结构，并能被RNA聚合酶识别，类似于不依赖Rho蛋白的转录终止信号结构，使转录无法进行。
(7)复制水平的调节作用。例如，大肠杆菌中ColEl质粒的复制，受到一种反义RNA(RNA I)的调节。由于反义的RNA I与引物前体RNA Ⅱ结合后掩蔽了前体分子中RNase H的水解位点，阻止复制引物的产生，使质粒DNA不能复制。
2 人工反义RNA的设计与反义表达载体构建
利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止子之间反向插入一段靶基因，人工构建反义RNA表达载体(病毒表达载体或质粒表达载体)，然后转染细胞并使之在其中稳定表达反义RNA，该反义RNA分子能有效地抑制靶基因表达。设计高效、稳定、特异性强的反义RNA表达载体一般可以考虑以下几个方面：
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2.1 选择特异性靶序列[3，4]
一般认为，在原核细胞中，反义RNA针对靶mRNA的SD序列和AUG区域比针对编码区有更强的调节作用，而互补于编码区不同片段的反义RNA，其抑制程度也各异。在真核系统中，靶序列的选择较复杂。在HSV-TK实验中发现，一个互补于TK mRNA(+50～+1415)序列的反义RNA能抑制TK基因表达约4～5倍；互补于TK mRNA(-80～+343)序列的反义RNA亦有相似的抑制作用。后来发现，互补于5’端非翻译区52nt的反义RNA也能有效地抑制TK基因表达，甚至比一个较长的互补于TK编码区的反义RNA有更强的抑制活性。Volloch等分析了不同靶位反义RNA在体外对mRNA前体剪接的影响，发现互补于mRNA前体剪接部位外显子序列或内含子序列的反义RNA均能强烈抑制mRNA前体的剪接。另据报道，一个只含有225bP TK基因编码区3’片段的反义质粒能有效抑制TK活性。在其转染的细胞株中，95%的TK mRNA局限在胞核内，而在亲本细胞中，大部分TK mRNA在胞浆内。这表明这种反义转录物阻止了TK mRNA向胞浆的转运。此外，有人报道互补于t-PA mRNA 3’末端非编码区的反义RNA注入鼠卵母细胞能阻止靶RNA的多聚腺苷酸化及其翻译。综上所述，在真核细胞中反义RNA靶序列的选择是：(1)互补于前体mRNA的5’末端，能阻止加“帽”反应及翻译：(2)互补于外显子-内含子交界部位，能阻止剪接；(3)互补于3’末端，能阻止mRNA的加“尾”及其由胞核内向胞浆的转运；(4)互补于编码区，能直接阻止核糖体与mRNA的结合与延伸，从而影响翻译。
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2.2 设计高效、稳定的结构
为了增强反义RNA的稳定性，在构建反义RNA表达载体时，有人在反义RNA3’端加上茎环结构、CUUCGG发夹结构或氯霉素乙酰转移酶(CAT)[5]等结构基因，这样产生的反义RNA不仅半衰期长、效果也增强。也有报道，将反义序列以嵌合基因的形式克隆在表达载体中，结果所表达出的反义RNA能更好地发挥抑制作用[6]。
核酶(Ribozyme)的发现，为人工构建高效、特异的反义RNA提供了新的途径。核酶是一类具有酶催化活性、能切割特异RNA序列的RNA分子。它能在GUC或CUC位点切割与它杂交的RNA分子。如果知道mRNA中GUC或CUC的位置。即可将核酶的编码基因插入反义RNA表达载体的适当位置，其转录产生的含核酶的反义RNA就可以与靶mRNA结合，在GUC或CUC位点切割mRNA，达到反义抑制和核酶切割靶mRNA的双重功能，从而加强了对靶基因表达的抑制作用。这也是目前改造反义RNA表达载体的研究重点之一。例如，有人构建了一个含核酶结构的反义CAT RNA的表达载体，所表达出的反义RNA对靶CAT基因表达的抑制作用显著高于不含核酶的反义CAT RNA[7]。Sarver等[8]构建了一个能产生反义gag ribozyme顺序的表达载体，能使被其转染的HeLa细胞兔遭HIV-l感染。
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2.3 提高反义RNA表达水平
为了提高细胞内反义RNA表达的水平，在构建反义表达载体时可使用强的、高效启动子如某些病毒的启动子；也可以在高效表达载体外源基因插入部位克隆进重复的两个或两个以上反义基因；也可以构建反义基因与二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的嵌合体，这种嵌合体基因在转染细胞后，可通过向培养基中加入氨甲碟呤，使反义基因与DHFR基因一起扩增，从而增加细胞内反义RNA水平。此外，有人构建了一个能表达C-ets-2、C-myc及N-ras三个癌基因联合反义RNA的重组逆转录病毒载体。结果显示转化细胞中有较高水平的联合反义RNA表达，细胞生长速率、致瘤能力均明显下降[9]。
2.4 选用新型的真核表达载体系统
随着基因治疗研究工作的开展，各种真核表达性载体层出不穷，如逆转录病毒载体、腺病毒或腺相关病毒载体、痘苗病毒载体等。近来又发展了EB病毒(Epstein-Barr Virus)游离体表达性载体，这种真核表达性载体可以在宿主细胞内以游离体形式存在，并扩增和表达。该载体不仅拷贝数多，而且可避免随机整合进宿主细胞染色体中而造成对宿主细胞基因或反义基因表达的影响[10]。Whitesell等[11]构建反义N-myc RNA的游离体表达载体，转染细胞后能有效地抑制神经母细脆瘤中N-myc基因的表达。而通常的质粒表达载体即使在强启动子下也很难奏效。
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除此以外，在构建反义表达载体时，可选择一些对温度、激素或金属离子敏感的条件表达启动子来控制细胞内反义RNA水平。如地塞米松可诱导真核细胞的小鼠乳腺癌病毒长末端重复序列(MMTV—LTR)启动子下游的基因表达；人金属硫蛋白-IIA(HMT-IIA)基因的启动子可被培养基中所加的Zn2+等二价离子诱导表达。
3 反义RNA的抗病毒作用
病毒是对人和动植物危害极大的病原体，然而对病毒引起的疾病的治疗，目前尚无特效药物与方法。反义RNA却能特异性阻断病毒基因表达和抑制病毒的复制，从而激起许多科学工作者去探索反义RNA治疗病毒性疾病的有效方法。抗病毒反义RNA技术是将特定的病毒基因反向插入到表达险载体中，以构建反义RNA表达载体，再将重组体导入真核细胞(病毒宿主细胞)中表达特异性反义RNA，从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制。文献报道，运用反义RNA技术己经成功地抑制疱疹病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)等对培养的组织细胞的侵袭。用针对植物病毒的反义RNA已培育出具有抗病毒能力的植物。另据报道，针对HIV tat基因的反义RNA和针对gag基因的ribozyme反义RNA表达性载体[8]亦均成功地抑制了HIV在细胞内的增殖，尤以ribozyme反义RNA的抑制效果更强，有可能应用于人类的基因治疗。1987年Chang等报道，用与Rous肉瘤病毒(RSV)5’端非编码区及env基因编码区互补的反义RNA，能够特异地抑制病毒的复制及翻译。1991年Sczakiet等[12]报道，在人T细胞中稳定表达的反义RNA能特异性抑制HIV-1的复制。1994年美国NIH(国立卫生研究院)Chuah等人[13]构建了针对HIV-1 TAR元件(Tat activation response element)的反义TAR逆转录病毒表达载体和反义Tat表达载体进行比较研究发现，反义TAR能显著抑制HIV-1复制，比反义Tat效果更强。并认为反义TAR逆转录病毒载体用于临床HIV-1感染病人的基因治疗可能有发展前景。我国预防医科院病毒所赵小侠等构建了表达HBsAg反义RNA的痘苗病毒重组载体，将此重组体转染到能分泌HBsAg并己被痘苗病毒感染的细胞，观察到HBsAg的合成被特异性地抑制，抑制率最高达95%以上。
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4 反义RNA的抗肿瘤作用
肿瘤的发生是多因素引起的，其中细胞癌基因或/和某些病毒癌基因的异常激活和过度表达是导致细胞恶变的原因之一。如何控制细胞有害基因的表达而在基因水平上治疗恶性肿瘤呢?在目前基因治疗的众多方案中，反义RNA技术是最具吸引力的手段之一。可以设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及某些肿瘤相关病毒的癌基因反义RNA，以阻断这些有害基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。许多证据表明，反义RNA可使肿瘤细胞的表型逆转，形态变化，增殖速度减慢，生存期缩短，软琼脂中克隆能力下降及体内成瘤能力减弱等，而不影响细胞生存所必需的其它基因的表达[1]。
Trojan等[14]利用EB病毒游离体表达载体克隆胰岛素样生长因子(IGF)反义基因，将此重组体转染大鼠C6细胞系，在大鼠模型上实现了胶质母细胞瘤的基因治疗和预防。Yokoyama等报道，利用反义C-myc RNA能使人早幼粒细胞性白血病细胞HL-60生长减慢，呈单核细胞分化。Prockownik等用反义C-myc RNA表达载体转染弗氏鼠红白血病细胞，能加速二甲基亚砜诱导的红细胞样分化。我国学者赵晓航等[15]报道互补于C-myc基因第二外显子及其两侧序列的反义RNA能特异性诱发人食管癌细胞程序性死亡。黄贤明等[9]利用C-ets-2、C-myc和N-ras三个癌基因联合反义RNA能使人肝癌细胞株SMMC-7721生长速率下降约70%，软琼脂集落形成能力及裸鼠致瘤能力显著下降，提示针对多个癌基因的联合反义RNA可能给肿瘤基因治疗提供新的途径。
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ras基因的点突变及ras P21水平升高见于多种肿瘤细胞中。反义Ki-ras RNA能特异性抑制人肺癌细胞中突变的Ki-ras mRNA翻译，而对H-ras和N-ras的表达没有影响。反义H-ras ribozyme在人膀胱癌EJ细胞中表达，能使癌细胞生长受抑，在裸鼠中的致瘤性和转移性降低。路桂荣等[16]用反义C-Ha-ras上游区及exon I反义RNA能使经C-Ha-ras转化的恶性细胞系生长速率减慢，裸鼠中致瘤性降低及肺转移率下降和肿瘤分化程度增加。
胰岛素样生长因子受体(IGF-1 R)对细胞恶性转化表型的建立及维持至关重要[17]。有报道，表达IGF-1 R反义RNA的C6大鼠恶性胶质瘤细胞在同源大鼠中的致瘤性丧失，并能显著抑制对侧接种的野生型肿瘤生长。最近又报道，表达IGF-1 R反义RNA的人黑色素瘤细胞中受体数目显著减少，该细胞的裸鼠致瘤性明显减弱，甚至丧失[18]。
, 百拇医药 最近He等[19]报道，人乳头瘤病毒(HPV)16型E7基因反义RNA不仅能抑制HPV DNA阳性C3小鼠肿瘤生长和诱导肿瘤细胞凋亡，而且能诱导小鼠产生较强的抗肿瘤免疫应答。当把E7反义基因与小鼠IL-12细胞因子基因共同导入小鼠，则后者能增强前者诱导的抗肿瘤免疫应答，使肿瘤完全消退。
在骨分化阶段，前成骨细胞会表达一种T1受体。最近Werenskild等[20]研究表明，成骨骨肉瘤细胞也合成T1受体，利用反义RNA抑制T1受体的表达，则可阻止骨肉瘤细胞成骨作用。表达T1反义RNA的肿瘤细胞在体内发生退行变，体外培养不能表达成骨细胞特有的基因产物，如1型胶原蛋白、碱性磷酸酶及骨钙素等。但抑制Tl受体合成并不影响骨细胞必需的特异性转录因子AML3/CBFA1的表达。
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(收稿：1999-03-22), 百拇医药