输血后肝炎患者、血透患者及非甲～戊型肝炎患者中庚型肝炎病毒感染的调查
作者：徐建英 唐正运
单位：广州医学院第二附属医院传染病科，广州 510260
关键词：庚型肝炎病毒；庚型肝炎；输血史；血透
广州医学院学报990207
提要 目的：确定广州地区输血后肝炎患者、血透患者、急性非甲～戊型肝炎患者及对照组中庚型肝炎病毒(HGV)的感染状况。方法：根据HGV感染者5′-非编码区的核苷酸序列设计引物，应用逆转录套式聚合酶链反应(RT-nested-PCR)对庚型肝炎病毒核糖核酸(HGV-RNA)进行检测。结果：共检测360份标本，上述各组中HGV感染率分别为22.6%、14.8%、4.0%及2.5%。结论：输血后肝炎患者、血透患者及急性非甲～戊肝炎患者中HGV感染率显著高于对照(P值均<0.005)；有血液接触史者高于无血液接触史者(P值<0.005)；HGV-RNA与抗-HGV无平行关系。
, 百拇医药
中图分类号 R511.6
An Investigation of Hepatitis G Virus Infection
in Patients with Post-transfusion Hepatitis,Hemodialysis and Non A-E Hepatitis
Xu Jianying,Tang Zhengyun
(Department of Infectious Diseases,the Second Affiliated
Hospital,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510260)
Objectives:To investigate the situation of hepatitis G virus (HGV) infection amo ng patients with post-transfusion hepatitis,hemodialysis,non A-E hepatitis and n ormal control in Guangzhou area.Methods:A set of reversenestedpolymerase cha in reaction(RT-nested-PCR)was conducted by using primers designed according to t he 5′-noncoding sequence in patients with HGV infection,to detect the RNA of HGV (HGV-RNA).Results:Totally 360 samples were assayed,the infection rates of HGV in the above groups were 22.6%,14.8%,and 2.5%,respectively.Conclusion:The i nfecti on rates of HGV in patients of post-transfusion hepatitis,hemodialysis and acut e non A-E hepatitis were higher than that in the control (P<0.005)；That in p atients with the history of blood exposure was obviously higher than that in patients without the history(P<0.005)；There appeared to be no parallel relationship between levels of HGV-RNA and anti-HGV.
, 百拇医药
Key words Hepatitis G Virus；Hepatitis G；History of transfusion；Hemodialysis
1995年下半年和1996年初Simons JN及Linnen J等分别报道了一种新的人类肝炎病毒，分别命名为GBV-C及HGV，暂称为庚型肝炎病毒。以后迅速建立了敏感、特异的逆转录套式聚合酶链反应检测HGV-RNA，现已能对HGV感染状况进行研究。本研究应用该方法对输血后肝炎，血透和急性非甲～戊型肝炎患者中的HGV感染状况进行了研究。
1 材料与方法
1.1 研究对象 病例和血清标本：①输血后肝炎患者(已排除甲～戊型肝炎病毒感染者)124例；②血透患者(含HBV和HCV标志物阳性者)81例；③急性非甲～戊型肝炎患者(无血液接触史者)75例；④对照组80例(无血液接触史的健康体检者)。上述病例血清标本采自我科住院病人和血液透析中心，-20℃冻存。全部标本共360例，其中男243例，女117例，年龄17～75岁。根据1996年武汉全国病毒性肝炎会议标准建立诊断。
, 百拇医药
1.2 5′-非编码区引物RT-nested-PCR检测HGV-RNA引物由第一军医大学南方医院基因室提供，引物来源于HGV5′非编码区，引物序列：外引物(正链110～129)5′-GTGGTGGATGGGTGATGACA；(负链356～337)5′-AGAGACATTGAAG-GGCGTG；内引物(正链133～155)5′GTAAATCCCGGTCACCTTGGTAG；(负链337～308)5′-CCTGGGCGTCGTTTGCCCAG。RT-nestea-PCR：取血清标本100μl用异硫氰酸胍法裂解[4]，酚/氯仿抽提，异丙醇沉淀RNA，逆转录后用外引物进行第一次PCR循环：92℃30s，53℃30s，70℃40s，30循环后于70℃延伸2min，取第一次PCK产物1μl用内引物于同上条件进行第二次PCR循环，反应体积为30μl。第二次循环结束后，取产物10μl于2%琼脂糖凝胶(含EB 0.05%)电泳，紫外光下观察结果，有预期205bp扩增带为阳性。
1.3 抗-HGV的检测 抗-HGV(ELISA)诊断试剂盒由沈阳惠民医药试剂研究所提供。以HGV的NS5非结构区的合成多肽为包被扩增。待测标本以1∶15稀释，37℃30min，洗涤5次，加酶标二抗，37℃30min，洗涤5次后加底物TMB，450波长下测OD值，临界值＝0.15+阴性对照平均值，样品OD值大于临界值为阳性。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 率的比较使用卡方检验或用精确概率直接计算。
2 结果
2.1 输血后肝炎患者、血透患者及急性非甲～戊型肝炎患者HGV感染状况的比较。
输血后肝炎患者、血透患者及急性非甲～戊型肝炎患者HGV-RNA的阳性率分别为22.6%、14.8%、4.0%，均高于对照组的2.5%。输血后肝炎患者、血透患者中HGV-RNA的阳性率显著高于无血液接触史的急性非甲～戊型肝炎患者(P<0.005),说明HGV感染与血液接触史密切相关，见表1。
表1 输血后肝炎患者、血透患者及非甲～戊型肝炎患者与对照组HBV感染状况的比较
HGV-RNA(+)
例数
, 百拇医药
例数
%
P*
P**
输血后肝炎患者
124
28
22.6
<0.005
<0.005
血透患者
81
12
, 百拇医药
14.8
<0.005
0.010
急性非甲～戊型肝炎患者
75
3
4.0
0.50
对照组
80
2
2.5
合 计
, 百拇医药
360
45
12.5
*表示各组患者与对照组HGV感染状况比较的P值
**表示输血后肝炎患者、血透患者分别与非甲～戊型肝炎患者之间的比较2.2 HGV-RNA与抗HGV之间的关系研究。
为了明确HGV-RNA与抗-HGV的关系，我们对本研究中280例患者标本同时检测了抗-HGV，经配对研究发现抗-HGV(+)患者中HGV-RNA的阳性率为8.3%，而抗-HGV(-)患者中的阳性率为18.4%，说明HGV-RNA与抗-HGV同时阳性的比较少，见表2。
表2 抗-HGV与HGV-RNA之间的关系
, 百拇医药
例数
HGV-RNA
阳性率
(+)
(-)
抗-HGV(+)
84
7
77
8.3
抗-HGV(-)
196
36
, 百拇医药
160
18.4
合 计
280
43
237
15.4
注：总符合率59.6%
3 讨论
庚型肝炎病毒是一种新近发现的人类肝炎病毒，国内外已广泛应用PCR法检测HGV-RNA来确定HGV感染。报道较多的引物位于核苷酸序列相对稳定的5′非编码区，NS3区，NS5区[1，2，3]。常绵红等的研究提示HGV的NS5区序列比较保守，可在此设计引物进行中国人HGV-RNA的RCR检测，能显著提高检测的灵敏度和特异性[5]。本研究应用5′非编码区的两对引物，建立RT-nested-PCR法检测HGV-RNA，发现输血后肝炎患者、血透患者及急性非甲～戊型肝炎患者中HGV感染率分别为22.6%、14.8%及4.0%。进一步证实HGV感染在我国的广泛存在，并且占有较重要的位置，应引起高度重视。已有资料证实，HGV的传播途径与HBV和HCV相似[6]，即主要经血和肠道外途径传播。本研究提示有血液接触史或血透史的HGV感染率显著高于无血液接触史。说明血液接触史是HGV的一个主要传播途径。所以为了减少庚型肝炎的感染率，一方面应对献血员进行HGV筛选；另一方面应严格掌握输血、血浆及其他血制品的适应症。
, http://www.100md.com
Linnen J等报道急性非甲～戊型肝炎患者HGV-RNA的检出率为13.0%[2]，Fiordalisi G为35.0%[7]，我们的结果是无血液接触为4.0%，与有血液接触史联合起来的检出率是15.6%，提示HGV可能是急性非甲～戊型肝炎的病源之一，但不是主要病源，可能还有其他致人类发病的病源存在，也可能与其他非病源性因素排除不够有关。
目前对HGV感染的诊断主要依靠对感染者HGV-RNA的监控，因为HGV基因全序列了解不多，对HGV各种抗原的研究刚刚起步，所以用ELISA法检测HGV抗体来诊断HGV感染尚缺乏说服力。我们也发现HGV-RNA与抗-HGV的二者符合率仅为59.6%，抗-HGV(+)的血清标本中仅有8.3%能检出HGV-RNA，而抗-HGV(-)患者血清标本中的HGV-RNA检出率为18.4%，所以目前检测抗-HGV暂时难以作为临床指标，其意义有待进一步的研究。
参考文献
, 百拇医药
1 Simon J N,Leaty T P,Daqson G J,et al.Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis.Nature Medicine,1995；1:456
2 Linnen J,Wags J,Zhang-Keck Z Y,et al.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent.Science,1996；271:505
3 Leaty T P,Muergiff A S,Simons J N,et al.Sequence and genomic organization of GBV-C:a novel member of the Flaviviridae associated with human non-A-e hepatitis.Journal of Medical Virology,1996；48:60
, 百拇医药
4 Chomczynski P,Saccki N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol -chloroform extraction.Anal Biochem,1987；162:256
5 常锦红，魏来，陶其敏.庚型肝炎病毒非结构基因(NS)5区部分序列的一级结构及其变异.中华医学杂志，1997；77：178
6 Madziyannis S J,Dawson G J,Vrettou E et al.Infection with the novel GB-C virus in Multiply Transfused patients and in various forms of chronic liver.Disease Hepatology,1995；22(4):218A
7 Firordalisi G,Zanella-I,Mantero-G et al.High prevalence of GB virus C infection in a group of ltalian patients with hepatitis of unknown eticlogy.J Infect Dis,1996；174(1):181～183
(收稿：1999-01-12), 百拇医药
单位：广州医学院第二附属医院传染病科，广州 510260
关键词：庚型肝炎病毒；庚型肝炎；输血史；血透
广州医学院学报990207
提要 目的：确定广州地区输血后肝炎患者、血透患者、急性非甲～戊型肝炎患者及对照组中庚型肝炎病毒(HGV)的感染状况。方法：根据HGV感染者5′-非编码区的核苷酸序列设计引物，应用逆转录套式聚合酶链反应(RT-nested-PCR)对庚型肝炎病毒核糖核酸(HGV-RNA)进行检测。结果：共检测360份标本，上述各组中HGV感染率分别为22.6%、14.8%、4.0%及2.5%。结论：输血后肝炎患者、血透患者及急性非甲～戊肝炎患者中HGV感染率显著高于对照(P值均<0.005)；有血液接触史者高于无血液接触史者(P值<0.005)；HGV-RNA与抗-HGV无平行关系。
, 百拇医药
中图分类号 R511.6
An Investigation of Hepatitis G Virus Infection
in Patients with Post-transfusion Hepatitis,Hemodialysis and Non A-E Hepatitis
Xu Jianying,Tang Zhengyun
(Department of Infectious Diseases,the Second Affiliated
Hospital,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510260)
Objectives:To investigate the situation of hepatitis G virus (HGV) infection amo ng patients with post-transfusion hepatitis,hemodialysis,non A-E hepatitis and n ormal control in Guangzhou area.Methods:A set of reversenestedpolymerase cha in reaction(RT-nested-PCR)was conducted by using primers designed according to t he 5′-noncoding sequence in patients with HGV infection,to detect the RNA of HGV (HGV-RNA).Results:Totally 360 samples were assayed,the infection rates of HGV in the above groups were 22.6%,14.8%,and 2.5%,respectively.Conclusion:The i nfecti on rates of HGV in patients of post-transfusion hepatitis,hemodialysis and acut e non A-E hepatitis were higher than that in the control (P<0.005)；That in p atients with the history of blood exposure was obviously higher than that in patients without the history(P<0.005)；There appeared to be no parallel relationship between levels of HGV-RNA and anti-HGV.
, 百拇医药
Key words Hepatitis G Virus；Hepatitis G；History of transfusion；Hemodialysis
1995年下半年和1996年初Simons JN及Linnen J等分别报道了一种新的人类肝炎病毒，分别命名为GBV-C及HGV，暂称为庚型肝炎病毒。以后迅速建立了敏感、特异的逆转录套式聚合酶链反应检测HGV-RNA，现已能对HGV感染状况进行研究。本研究应用该方法对输血后肝炎，血透和急性非甲～戊型肝炎患者中的HGV感染状况进行了研究。
1 材料与方法
1.1 研究对象 病例和血清标本：①输血后肝炎患者(已排除甲～戊型肝炎病毒感染者)124例；②血透患者(含HBV和HCV标志物阳性者)81例；③急性非甲～戊型肝炎患者(无血液接触史者)75例；④对照组80例(无血液接触史的健康体检者)。上述病例血清标本采自我科住院病人和血液透析中心，-20℃冻存。全部标本共360例，其中男243例，女117例，年龄17～75岁。根据1996年武汉全国病毒性肝炎会议标准建立诊断。
, 百拇医药
1.2 5′-非编码区引物RT-nested-PCR检测HGV-RNA引物由第一军医大学南方医院基因室提供，引物来源于HGV5′非编码区，引物序列：外引物(正链110～129)5′-GTGGTGGATGGGTGATGACA；(负链356～337)5′-AGAGACATTGAAG-GGCGTG；内引物(正链133～155)5′GTAAATCCCGGTCACCTTGGTAG；(负链337～308)5′-CCTGGGCGTCGTTTGCCCAG。RT-nestea-PCR：取血清标本100μl用异硫氰酸胍法裂解[4]，酚/氯仿抽提，异丙醇沉淀RNA，逆转录后用外引物进行第一次PCR循环：92℃30s，53℃30s，70℃40s，30循环后于70℃延伸2min，取第一次PCK产物1μl用内引物于同上条件进行第二次PCR循环，反应体积为30μl。第二次循环结束后，取产物10μl于2%琼脂糖凝胶(含EB 0.05%)电泳，紫外光下观察结果，有预期205bp扩增带为阳性。
1.3 抗-HGV的检测 抗-HGV(ELISA)诊断试剂盒由沈阳惠民医药试剂研究所提供。以HGV的NS5非结构区的合成多肽为包被扩增。待测标本以1∶15稀释，37℃30min，洗涤5次，加酶标二抗，37℃30min，洗涤5次后加底物TMB，450波长下测OD值，临界值＝0.15+阴性对照平均值，样品OD值大于临界值为阳性。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 率的比较使用卡方检验或用精确概率直接计算。
2 结果
2.1 输血后肝炎患者、血透患者及急性非甲～戊型肝炎患者HGV感染状况的比较。
输血后肝炎患者、血透患者及急性非甲～戊型肝炎患者HGV-RNA的阳性率分别为22.6%、14.8%、4.0%，均高于对照组的2.5%。输血后肝炎患者、血透患者中HGV-RNA的阳性率显著高于无血液接触史的急性非甲～戊型肝炎患者(P<0.005),说明HGV感染与血液接触史密切相关，见表1。
表1 输血后肝炎患者、血透患者及非甲～戊型肝炎患者与对照组HBV感染状况的比较
HGV-RNA(+)
例数
, 百拇医药
例数
%
P*
P**
输血后肝炎患者
124
28
22.6
<0.005
<0.005
血透患者
81
12
, 百拇医药
14.8
<0.005
0.010
急性非甲～戊型肝炎患者
75
3
4.0
0.50
对照组
80
2
2.5
合 计
, 百拇医药
360
45
12.5
*表示各组患者与对照组HGV感染状况比较的P值
**表示输血后肝炎患者、血透患者分别与非甲～戊型肝炎患者之间的比较2.2 HGV-RNA与抗HGV之间的关系研究。
为了明确HGV-RNA与抗-HGV的关系，我们对本研究中280例患者标本同时检测了抗-HGV，经配对研究发现抗-HGV(+)患者中HGV-RNA的阳性率为8.3%，而抗-HGV(-)患者中的阳性率为18.4%，说明HGV-RNA与抗-HGV同时阳性的比较少，见表2。
表2 抗-HGV与HGV-RNA之间的关系
, 百拇医药
例数
HGV-RNA
阳性率
(+)
(-)
抗-HGV(+)
84
7
77
8.3
抗-HGV(-)
196
36
, 百拇医药
160
18.4
合 计
280
43
237
15.4
注：总符合率59.6%
3 讨论
庚型肝炎病毒是一种新近发现的人类肝炎病毒，国内外已广泛应用PCR法检测HGV-RNA来确定HGV感染。报道较多的引物位于核苷酸序列相对稳定的5′非编码区，NS3区，NS5区[1，2，3]。常绵红等的研究提示HGV的NS5区序列比较保守，可在此设计引物进行中国人HGV-RNA的RCR检测，能显著提高检测的灵敏度和特异性[5]。本研究应用5′非编码区的两对引物，建立RT-nested-PCR法检测HGV-RNA，发现输血后肝炎患者、血透患者及急性非甲～戊型肝炎患者中HGV感染率分别为22.6%、14.8%及4.0%。进一步证实HGV感染在我国的广泛存在，并且占有较重要的位置，应引起高度重视。已有资料证实，HGV的传播途径与HBV和HCV相似[6]，即主要经血和肠道外途径传播。本研究提示有血液接触史或血透史的HGV感染率显著高于无血液接触史。说明血液接触史是HGV的一个主要传播途径。所以为了减少庚型肝炎的感染率，一方面应对献血员进行HGV筛选；另一方面应严格掌握输血、血浆及其他血制品的适应症。
, http://www.100md.com
Linnen J等报道急性非甲～戊型肝炎患者HGV-RNA的检出率为13.0%[2]，Fiordalisi G为35.0%[7]，我们的结果是无血液接触为4.0%，与有血液接触史联合起来的检出率是15.6%，提示HGV可能是急性非甲～戊型肝炎的病源之一，但不是主要病源，可能还有其他致人类发病的病源存在，也可能与其他非病源性因素排除不够有关。
目前对HGV感染的诊断主要依靠对感染者HGV-RNA的监控，因为HGV基因全序列了解不多，对HGV各种抗原的研究刚刚起步，所以用ELISA法检测HGV抗体来诊断HGV感染尚缺乏说服力。我们也发现HGV-RNA与抗-HGV的二者符合率仅为59.6%，抗-HGV(+)的血清标本中仅有8.3%能检出HGV-RNA，而抗-HGV(-)患者血清标本中的HGV-RNA检出率为18.4%，所以目前检测抗-HGV暂时难以作为临床指标，其意义有待进一步的研究。
参考文献
, 百拇医药
1 Simon J N,Leaty T P,Daqson G J,et al.Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis.Nature Medicine,1995；1:456
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3 Leaty T P,Muergiff A S,Simons J N,et al.Sequence and genomic organization of GBV-C:a novel member of the Flaviviridae associated with human non-A-e hepatitis.Journal of Medical Virology,1996；48:60
, 百拇医药
4 Chomczynski P,Saccki N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol -chloroform extraction.Anal Biochem,1987；162:256
5 常锦红，魏来，陶其敏.庚型肝炎病毒非结构基因(NS)5区部分序列的一级结构及其变异.中华医学杂志，1997；77：178
6 Madziyannis S J,Dawson G J,Vrettou E et al.Infection with the novel GB-C virus in Multiply Transfused patients and in various forms of chronic liver.Disease Hepatology,1995；22(4):218A
7 Firordalisi G,Zanella-I,Mantero-G et al.High prevalence of GB virus C infection in a group of ltalian patients with hepatitis of unknown eticlogy.J Infect Dis,1996；174(1):181～183
(收稿：1999-01-12), 百拇医药