鼻良恶性病变P53基因表达及DNA倍体相关性研究
作者：张志钢
单位：广州医学院附属市二人民医院耳鼻咽喉科，广州 510150
关键词：鼻鳞癌；鼻良性病变；DNA倍体；流式细胞术；P53单克隆抗体
广州医学院学报990205
提要 目的：研究P53基因在鼻良恶性病变的表达。方法：应用流式细胞术和细胞免疫荧光染色技术，对鼻炎性增生组织17例、乳头状瘤9例和鼻鳞癌组织35例的P53基因蛋白表达进行定量研究，结果显示：1.鼻良性病变P53表达量明显低于鼻鳞癌；2.P53表达阳性率和表达量与鼻鳞癌病理组织学分级密切相关；3.P53表达量与鼻鳞癌DNA倍体相关，非整倍体肿瘤P53表达量高于二倍体肿瘤。结论：P53基因蛋白表达能区分鼻良恶性肿瘤及鼻恶性肿瘤病理组织学分级，同时还与DNA倍体相关。
, http://www.100md.com
中图分类号 R739.62
A Study of Correlation Between P53 Gene Expression and
DNA Ploidy in Benign and Malignant Nasal Diseases
Zhang Zhigang
(Department of Otolaryngology,the Affiliated Second People′s
Hospital,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510150)
Objectives:To study the expression of P53 gene in tissues of benign and malignant nasal diseases.Methods:The protein expressions of P53 gene were quantitatively analyzed by using flow cytometry and cellular immunofluorescence staining technique,in tissue samples from 17 cases of nasal inflammatory proliferation,9 cases of nasal papilloma,35 cases of nasal squamous cancer and 10 cases of normal nasal mucosa tissues. Results:(1)The expression level of P53 gene in benign nasal disease tissues was lower than that in nasal squamous cancer tissues. (2) The rate of positive expression of P53 and the expression quantity were correlated to the histopathologic grading of nasal squamous cancer. (3) The quantity of P53 protein expression was associated with DNA ploidy in nasal squamous cancer；that in aneuploid tumors was higher than that in diploid ones. Conclusion:P53 protein expression might be hopeful to become a parameter for distinguishing benign from malignant nasal tumors,and the histopathologic grading of nasal squamous cancer is probably correlated to the DNA ploidy of the cancer cells.
, 百拇医药
Key words Nasal squamous cancer；Nasal benign disease；DNA ploidy；Flow cytometry；Monoclonal antibody of P53
随着生物分子技术的快速发展和应用，人们发现了与肿瘤发生发展密切相关的两类基因即癌基因和抗癌基因。P53基因就是一个具有抗癌作用的基因，它对于细胞的分化增殖具有重要的调控作用。近年来研究发现大部分恶性肿瘤存在P53基因突变，且进一步证实，突变后的P53基因蛋白产物发生构型上的改变，半衰期延长，稳定性增强，在细胞内发生堆积。本文应用流式免疫方法和抗P53基因蛋白单克隆抗体，定量研究鼻良性病变和鼻鳞癌组织中P53蛋白表达，探讨其与病理特性和DNA倍体之间的关系。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 取石醋包埋鼻鳞癌组织35例、鼻炎性增生17例、乳头状瘤9例和正常鼻腔粘膜组织10例作对照。鼻鳞癌组织按Broder氏病理组织学分级法，I级8例、Ⅱ级18例、Ⅲ级9例。
1.2 方法
1.2.1 DNA倍体检测的样品制备
每例石蜡组织块在切片机上切取40μm厚的组织片，按文献[1]中的方法：a.二甲苯脱蜡；b.梯度酒精水化；c.0.5%盐酸胃蛋白酶消化；d.以溴化乙烷(E.B)对细胞DNA进行荧光染色。
1.2.2 P53基因蛋白免疫荧光染色样品的制备
按文献[1]中的方法：a.制备单细胞样品；b.用鼠抗人P53蛋白单克隆抗体和单抗鼠FITC-IgG(军事医学科学院微生物研究所生产，批号91091)，进行间接免疫荧光标记。荧光免疫染色后的细胞发绿色荧光，主要分布在胞核内。
, 百拇医药
1.2.3 流式细胞检测方法
采用美国生产的流式细胞仪FACS-420型，激发光源为2W氩离激光器，激发波长为488nm，输出功率为300mW由于FITC和EB两种荧光染料具有相同的激发波长，故可采用同一个激发波长488nm的光。FITC发绿色荧光，以520nm的带通滤片，EB发红色荧光，以590nm的长通滤片用于荧光检测，测量的数据和图形输入计算机，应用相应的软件程序进行资料处理。
1.3 测量资料的分析方法[1]
依据DNA指数值(DNA Index,DI)作为判断DNA倍体的标准。
如：DI＝1.0±CV 为二倍体肿瘤
, http://www.100md.com DI≠1.0±2CV 为非整倍体肿瘤
1.3.2 P53基因蛋白表达的定量分析
按照Morkvo等[2]提出的分析方法及判断标准，以荧光指数(Fluorescence Index,FI)表示P53表达的相对含量，公式为：
如：FI>1.00 为P53表达阳性；FI≤1.00 为P53表达阴性
1.4 统计学处理方法
配对资料用t检验，其他资料用
检验。
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2 结果
2.1 鼻良性病变和鼻鳞癌DNA倍体分析结果见表1。
表1 鼻良性病变和鼻鳞癌DNA倍体分析 病变类型
例数
DNA倍体(例数)
P值
二倍体
非整倍体
炎性增生
17
17
0
, 百拇医药
>0.05
乳头状瘤
9
9
0
<0.005
鼻鳞癌
35
15
20
35例鼻鳞癌，DNA非整倍体的出现率在Ⅰ、Ⅱ级与Ⅲ级之间有显著相关性(P<0.001)，分化I级4/8(50.00%)，Ⅱ级7/18(38.89%)，Ⅲ级9/9(100%)。
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2.2 良性病变和鼻鳞癌P53蛋白表达与病理特性的关系
在正常鼻腔组织中，P53表达均为阴性。26例良性病变中，P53表达量(FI值)范围在0.82～1.16(0.99±0.19)，其中4例P53表达阳性，对其4例良性病变的组织切片仔细观察，发现有不典型鳞状上皮增生Ⅱ～Ⅲ级。35例鼻鳞癌P53表达量(FI值)在0.64～2.68(1.7±0.71)，P53表达阳性的鼻鳞癌21例，占60.00%，良性病变与癌P53表达量之间有显著统计学差异(P<0.05)。鼻鳞癌P53蛋白表达阳性率和表达量(FI值)与组织学分级有明显相关性(见表2)。表2 鼻鳞癌病理组织分级与P53蛋白表达关系 组织分级
例数
, http://www.100md.com
FI值(
±s)
P53表达(%)
Ⅰ
8
1.22±0.47
3(37.50)
Ⅱ
18
1.56±0.80
10(55.56)
Ⅲ
, 百拇医药
9
2.12±0.50
8(88.89)
2.3 鼻鳞癌DNA倍体与P53表达的关系见表3。表3 鼻鳞癌DNA倍体与P53表达 DNA倍体
例数
FI值(±s)
P53表达(%)
二倍体
15
1.19±0.49
, 百拇医药
5(33.33)
非整倍体
20
1.94±0.67
16(80.00)
表3中显示出非倍整体肿瘤P53表达量和P53阳性表达率明显高于二倍体肿瘤。
3 讨论
已有研究表明，P53基因突变是许多人类肿瘤最常见的基因改变之一，其中头颈部肿瘤的P53基因研究也进展很快[3、4]，自Grawford等[5]首先报道P53基因与人乳癌有关，并发现在人体中存在抗P53基因蛋白的循环抗体。许多研究者应用抗P53多克隆、单克隆抗体对多种人类肿瘤进行研究，均检出异常P53蛋白表达。本文应用流式细胞术，并结合抗P53单抗对鼻良性病变和鼻鳞癌组织中P53蛋白表达进行定量检测，结果发现正常鼻腔组织P53蛋白表达均为阴性，在良性病变中有4例表达阳性，经病理组织学证实为鳞状上皮不典型增生Ⅱ～Ⅲ级，说明P53突变蛋白的过量表达在鼻腔细胞转化-癌变过程中起直接参与作用。Nigro等[6]研究认为，P53突变发生于肿瘤形成过程中，P53突变蛋白的产物可使野生型(wild-type)P53蛋白对细胞增殖的负调控作用丧失,细胞表现为更明显的生长失控。本研究还发现良性病变P53表达量明显低于鼻鳞癌，提示P53蛋白表达在肿瘤的发生、发展过程中，其稳定性逐渐增强，含量增高。P53突变蛋白的表达将有可能作为癌变早期诊断的一个标志物。
, 百拇医药
本文对35例鼻鳞癌的研究表明，P53表达阳性率和表达量(FI值)与肿瘤组织分化程度存在显著相关性(表2)，同时还发现P53表达阳性率和表达量与鼻鳞癌DNA倍体密切相关(表2)，非整倍体鼻鳞癌P53表达量明显高于二倍体肿瘤。Angelis等[7]对直肠癌研究结果也表明了这一结论。总之，P53基因蛋白异常表达在鼻良性病变的鉴别及鼻鳞癌病理组织学分级中可成为一新的辅助参数。
参考文献
1 左连富主编.流式细胞样品制备技术.第一版.北京：华夏出版社，1991：14～19
2 Morkve O,Leaerum OD, Flow cytometry measurement of P53 protien expression and DNA content in paraffin embeded tissue trom bronchial carcinoma. Cytometry,1991；12:438
, http://www.100md.com
3 Somers KD,Merrick MA,Lopez ME,et al: Frequent P53 mutations in head and neck cancer. Cancer Res,1992；52:5997
4 Sakai E,Rikimaru K,Ueda M,et al. The P53 tumor-suppressor gene and ras oncoegene mutation in oral squamous-cell carcinoma. Int J Cancer,1992；52:867
5 Crawford LV,Pim DC,Bulbrook RD. Detection of antibody the cellular protein P53 in sera from patient with breast cancer. Int J Cancer,1982；30:403
, http://www.100md.com
6 Nigo JM,Saker SJ,Preisinger AC,et al. Mutation in the P53 gene occur in diverse human tumour type. Nature,1989；342:705
7 Angelis PD,Stokke T,Smedskammer L,et al.P53 protien expression correlates with DNA aneupoid in colorec carcinomas. Cytometry,1993；6:2348
(收稿：1998-12-23), http://www.100md.com
单位：广州医学院附属市二人民医院耳鼻咽喉科，广州 510150
关键词：鼻鳞癌；鼻良性病变；DNA倍体；流式细胞术；P53单克隆抗体
广州医学院学报990205
提要 目的：研究P53基因在鼻良恶性病变的表达。方法：应用流式细胞术和细胞免疫荧光染色技术，对鼻炎性增生组织17例、乳头状瘤9例和鼻鳞癌组织35例的P53基因蛋白表达进行定量研究，结果显示：1.鼻良性病变P53表达量明显低于鼻鳞癌；2.P53表达阳性率和表达量与鼻鳞癌病理组织学分级密切相关；3.P53表达量与鼻鳞癌DNA倍体相关，非整倍体肿瘤P53表达量高于二倍体肿瘤。结论：P53基因蛋白表达能区分鼻良恶性肿瘤及鼻恶性肿瘤病理组织学分级，同时还与DNA倍体相关。
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中图分类号 R739.62
A Study of Correlation Between P53 Gene Expression and
DNA Ploidy in Benign and Malignant Nasal Diseases
Zhang Zhigang
(Department of Otolaryngology,the Affiliated Second People′s
Hospital,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510150)
Objectives:To study the expression of P53 gene in tissues of benign and malignant nasal diseases.Methods:The protein expressions of P53 gene were quantitatively analyzed by using flow cytometry and cellular immunofluorescence staining technique,in tissue samples from 17 cases of nasal inflammatory proliferation,9 cases of nasal papilloma,35 cases of nasal squamous cancer and 10 cases of normal nasal mucosa tissues. Results:(1)The expression level of P53 gene in benign nasal disease tissues was lower than that in nasal squamous cancer tissues. (2) The rate of positive expression of P53 and the expression quantity were correlated to the histopathologic grading of nasal squamous cancer. (3) The quantity of P53 protein expression was associated with DNA ploidy in nasal squamous cancer；that in aneuploid tumors was higher than that in diploid ones. Conclusion:P53 protein expression might be hopeful to become a parameter for distinguishing benign from malignant nasal tumors,and the histopathologic grading of nasal squamous cancer is probably correlated to the DNA ploidy of the cancer cells.
, 百拇医药
Key words Nasal squamous cancer；Nasal benign disease；DNA ploidy；Flow cytometry；Monoclonal antibody of P53
随着生物分子技术的快速发展和应用，人们发现了与肿瘤发生发展密切相关的两类基因即癌基因和抗癌基因。P53基因就是一个具有抗癌作用的基因，它对于细胞的分化增殖具有重要的调控作用。近年来研究发现大部分恶性肿瘤存在P53基因突变，且进一步证实，突变后的P53基因蛋白产物发生构型上的改变，半衰期延长，稳定性增强，在细胞内发生堆积。本文应用流式免疫方法和抗P53基因蛋白单克隆抗体，定量研究鼻良性病变和鼻鳞癌组织中P53蛋白表达，探讨其与病理特性和DNA倍体之间的关系。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 取石醋包埋鼻鳞癌组织35例、鼻炎性增生17例、乳头状瘤9例和正常鼻腔粘膜组织10例作对照。鼻鳞癌组织按Broder氏病理组织学分级法，I级8例、Ⅱ级18例、Ⅲ级9例。
1.2 方法
1.2.1 DNA倍体检测的样品制备
每例石蜡组织块在切片机上切取40μm厚的组织片，按文献[1]中的方法：a.二甲苯脱蜡；b.梯度酒精水化；c.0.5%盐酸胃蛋白酶消化；d.以溴化乙烷(E.B)对细胞DNA进行荧光染色。
1.2.2 P53基因蛋白免疫荧光染色样品的制备
按文献[1]中的方法：a.制备单细胞样品；b.用鼠抗人P53蛋白单克隆抗体和单抗鼠FITC-IgG(军事医学科学院微生物研究所生产，批号91091)，进行间接免疫荧光标记。荧光免疫染色后的细胞发绿色荧光，主要分布在胞核内。
, 百拇医药
1.2.3 流式细胞检测方法
采用美国生产的流式细胞仪FACS-420型，激发光源为2W氩离激光器，激发波长为488nm，输出功率为300mW由于FITC和EB两种荧光染料具有相同的激发波长，故可采用同一个激发波长488nm的光。FITC发绿色荧光，以520nm的带通滤片，EB发红色荧光，以590nm的长通滤片用于荧光检测，测量的数据和图形输入计算机，应用相应的软件程序进行资料处理。
1.3 测量资料的分析方法[1]
依据DNA指数值(DNA Index,DI)作为判断DNA倍体的标准。
如：DI＝1.0±CV 为二倍体肿瘤
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1.3.2 P53基因蛋白表达的定量分析
按照Morkvo等[2]提出的分析方法及判断标准，以荧光指数(Fluorescence Index,FI)表示P53表达的相对含量，公式为：
如：FI>1.00 为P53表达阳性；FI≤1.00 为P53表达阴性
1.4 统计学处理方法
配对资料用t检验，其他资料用
检验。, http://www.100md.com
2 结果
2.1 鼻良性病变和鼻鳞癌DNA倍体分析结果见表1。
表1 鼻良性病变和鼻鳞癌DNA倍体分析 病变类型
例数
DNA倍体(例数)
P值
二倍体
非整倍体
炎性增生
17
17
0
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>0.05
乳头状瘤
9
9
0
<0.005
鼻鳞癌
35
15
20
35例鼻鳞癌，DNA非整倍体的出现率在Ⅰ、Ⅱ级与Ⅲ级之间有显著相关性(P<0.001)，分化I级4/8(50.00%)，Ⅱ级7/18(38.89%)，Ⅲ级9/9(100%)。
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2.2 良性病变和鼻鳞癌P53蛋白表达与病理特性的关系
在正常鼻腔组织中，P53表达均为阴性。26例良性病变中，P53表达量(FI值)范围在0.82～1.16(0.99±0.19)，其中4例P53表达阳性，对其4例良性病变的组织切片仔细观察，发现有不典型鳞状上皮增生Ⅱ～Ⅲ级。35例鼻鳞癌P53表达量(FI值)在0.64～2.68(1.7±0.71)，P53表达阳性的鼻鳞癌21例，占60.00%，良性病变与癌P53表达量之间有显著统计学差异(P<0.05)。鼻鳞癌P53蛋白表达阳性率和表达量(FI值)与组织学分级有明显相关性(见表2)。表2 鼻鳞癌病理组织分级与P53蛋白表达关系 组织分级
例数
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FI值(
±s)P53表达(%)
Ⅰ
8
1.22±0.47
3(37.50)
Ⅱ
18
1.56±0.80
10(55.56)
Ⅲ
, 百拇医药
9
2.12±0.50
8(88.89)
2.3 鼻鳞癌DNA倍体与P53表达的关系见表3。表3 鼻鳞癌DNA倍体与P53表达 DNA倍体
例数
FI值(
±s)P53表达(%)
二倍体
15
1.19±0.49
, 百拇医药
5(33.33)
非整倍体
20
1.94±0.67
16(80.00)
表3中显示出非倍整体肿瘤P53表达量和P53阳性表达率明显高于二倍体肿瘤。
3 讨论
已有研究表明，P53基因突变是许多人类肿瘤最常见的基因改变之一，其中头颈部肿瘤的P53基因研究也进展很快[3、4]，自Grawford等[5]首先报道P53基因与人乳癌有关，并发现在人体中存在抗P53基因蛋白的循环抗体。许多研究者应用抗P53多克隆、单克隆抗体对多种人类肿瘤进行研究，均检出异常P53蛋白表达。本文应用流式细胞术，并结合抗P53单抗对鼻良性病变和鼻鳞癌组织中P53蛋白表达进行定量检测，结果发现正常鼻腔组织P53蛋白表达均为阴性，在良性病变中有4例表达阳性，经病理组织学证实为鳞状上皮不典型增生Ⅱ～Ⅲ级，说明P53突变蛋白的过量表达在鼻腔细胞转化-癌变过程中起直接参与作用。Nigro等[6]研究认为，P53突变发生于肿瘤形成过程中，P53突变蛋白的产物可使野生型(wild-type)P53蛋白对细胞增殖的负调控作用丧失,细胞表现为更明显的生长失控。本研究还发现良性病变P53表达量明显低于鼻鳞癌，提示P53蛋白表达在肿瘤的发生、发展过程中，其稳定性逐渐增强，含量增高。P53突变蛋白的表达将有可能作为癌变早期诊断的一个标志物。
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本文对35例鼻鳞癌的研究表明，P53表达阳性率和表达量(FI值)与肿瘤组织分化程度存在显著相关性(表2)，同时还发现P53表达阳性率和表达量与鼻鳞癌DNA倍体密切相关(表2)，非整倍体鼻鳞癌P53表达量明显高于二倍体肿瘤。Angelis等[7]对直肠癌研究结果也表明了这一结论。总之，P53基因蛋白异常表达在鼻良性病变的鉴别及鼻鳞癌病理组织学分级中可成为一新的辅助参数。
参考文献
1 左连富主编.流式细胞样品制备技术.第一版.北京：华夏出版社，1991：14～19
2 Morkve O,Leaerum OD, Flow cytometry measurement of P53 protien expression and DNA content in paraffin embeded tissue trom bronchial carcinoma. Cytometry,1991；12:438
, http://www.100md.com
3 Somers KD,Merrick MA,Lopez ME,et al: Frequent P53 mutations in head and neck cancer. Cancer Res,1992；52:5997
4 Sakai E,Rikimaru K,Ueda M,et al. The P53 tumor-suppressor gene and ras oncoegene mutation in oral squamous-cell carcinoma. Int J Cancer,1992；52:867
5 Crawford LV,Pim DC,Bulbrook RD. Detection of antibody the cellular protein P53 in sera from patient with breast cancer. Int J Cancer,1982；30:403
, http://www.100md.com
6 Nigo JM,Saker SJ,Preisinger AC,et al. Mutation in the P53 gene occur in diverse human tumour type. Nature,1989；342:705
7 Angelis PD,Stokke T,Smedskammer L,et al.P53 protien expression correlates with DNA aneupoid in colorec carcinomas. Cytometry,1993；6:2348
(收稿：1998-12-23), http://www.100md.com