人绒毛膜促性腺激素对小鼠颌下腺、血清表皮生长因子的影响*
作者：何为民 陈奕权 高学勇 王世鄂 周瑞祥
单位：福建医科大学组织胚胎学教研室，福建省生殖医学中心(福州 350004)
关键词：人绒毛膜促性腺激素；表皮生长因子；颌下腺；小鼠
福建医科大学学报990212 目的 探讨人绒毛膜促性腺激素(HCG)与颌下腺、血清表皮生长因子(EGF)之间的相互调节机制，为内分泌免疫调节网络提供实验依据。方法 ICR雄性小鼠切除颌下腺和给予HCG前后应用放射免疫方法测定颌下腺和血清EGF。结果 假手术给药组颌下腺EGF含量与假手术组相比明显升高
(P<0.05)，去颌下腺组血清EGF与假手术组相比差别无显著性，去颌下腺给药组血清EGF与去颌下腺组相比明显上升(P<0.05)，假手术给药组血清EGF与假手术组相比明显上升(P<0.05)。结论 颌下腺分泌的EGF是血清EGF的来源之一；HCG可促进小鼠颌下腺和其他相关组织合成释放EGF入血。
, 百拇医药
The Effects of Human Choriogonadotropin Treatment on Epidermal Growth Factor Level in Mouse Submandibular Gland and Serum
He Weimin Chen Yiquan Gao Xueyong, et al
(Department of Histology and Embryology,Fujian Medical University,Fuzhou,350004)
Objective Investigation into the joint modulating mechanism between human choriogonadotropin(HCG) and serum epidermal growth factor(EGF) in submandibular gland and serum for offering experimental evidence for endocrine-immunity regulating network.Methods The submandibular and EGF level of ICR mice before and after sialoadenectomy and HCG injection were observed with radioimmunoassay.Results Submandibular concentrations of EGF was significantly higher in mice with sham operation and HCG replenishment than in those with sham operation(P<0.05).There were no difference in serum content of EGF between sham operation group and sialoadenectomized group(P>0.05).Marked increase in serum levels of EGF was observed in sialoadenectomized mice after HCG administration(P<0.05).Serum concentration of EGF was significantly higher in mice with sham operation and HCG replenishment than in those with sham operation(P<0.05).Conclusion Submandibular gland is one of the sources producing and secreting EGF into serum;HCG can increase EGF synthesis in submandibular gland and other related tissues and their EGF releasing into blood.
, 百拇医药
Key words human choriogonadotropin;epidermal growth factor;submaxillary gland;mice
神经-内分泌-免疫网络对机体的共同调节作用已得到人们的共识，如激素可增强或抑制免疫应答或细胞因子的分泌，而细胞因子又可调节激素分泌。人绒毛膜促性腺激素(HCG)可存在多种肿瘤、良性疾病乃至正常人体中，它与免疫调节的关系日益被人们重视[1]。表皮生长因子(EGF)是颌下腺分泌的细胞因子，研究发现EGF具有广泛生物学效应，如刺激多种组织细胞增殖，与肿瘤发生有关等[2]。已有报道，EGF对内分泌腺有调节作用，但是从活体角度研究HCG对EGF调节的报道尚少。本研究在生理和去颌下腺状态下，探讨颌下腺、HCG对血清EGF的影响以及HCG调节颌下腺EGF的机制。
1 材料和方法
1.1 动物实验 选用12～13周龄清洁级ICR雄性性成熟小鼠(购于中科院上海实验动物中心),体重35～42g。实验动物分成4组，每组8只：(1)假手术组；(2)去颌下腺组；(3)去颌下腺给药组；(4)假手术给药组。用10%氨基甲酸乙酯(100～120mg/100g体重)经腹腔麻醉后，手术切除双侧颌下腺并经石蜡切片染色显微镜下观察证实。假手术组仅分离双侧颌下腺，不切除。给药组在术后立即及每2日下午5时腹腔注射HCG(购于上海生物化学公司)10U至术后35天。
, 百拇医药
手术后35天，用10%氨基甲酸乙酯经腹腔麻醉，摘除眼球，滴取眼窝积血。取颌下腺经分析天平称重,计算脏器系数(mg/100g体重)。公式为：脏器系数=脏器重量(mg)×100÷体重(g)。将颌下腺入液氮保存。
1.2 组织样品制备
留血于预冷的Eppendorf管中，3000r/min离心15min，取上清液置-20℃冰箱中保存。切碎颌下腺，加10倍体积提取液(50mmol/L Tris-HCl，pH7.4，1mmol/L EDTA，1mmol/L EGTA)，用超声击碎组织，匀浆以20000g 4℃离心20min，取上清液，-20℃保存。
1.3 表皮生长因子放免测定
采用顺序饱和加样法。放免测定试剂盒购自北京北方生物技术研究所，批内变异<5%，批间变异<10%。总反应体积为800μl：不同浓度EGF标准品100μl(0.1,0.3,0.9,2.7,8.1ng/ml)、待测血清样品或匀浆上清液100μl、零标准管(S0)和NSB管各加“0”标准液100μl。各管加125I-EGF 100μl，充分摇匀后NSB管加蒸馏水100μl，其余各管加抗EGF100μl。其余步骤按试剂盒说明书进行。
, 百拇医药
1.4 统计处学理
以上所有测定值均以均值±标准误表示。采用SPSS软件包对以上全部数据进行单因素方差分析处理，以P<0.05为有显著性意义。
2 结 果
2.1 假手术给药组颌下腺EGF含量与假手术组相比明显升高(P<0.05)。去颌下腺组血清EGF与假手术组差别无显著性。去颌下腺给药组血清EGF与去颌下腺组相比明显上升(P<0.05)。假手术给药组血清EGF与假手术组相比明显上升(P<0.05)。去颌下腺给药组的血清EGF与假手术给药组相比显著增高(P<0.05,附表)。
附表 小鼠颌下腺、血清的表皮生长因子含量 分
组
颌下腺脏器系数
, 百拇医药
(mg/100gWT)
EGF(ng/ml)
血 清
颌下腺
1
364.9±17.6
0.171±0.016
3.702±0.630
2
0.185±0.024
3
1.959±0.307*+
, 百拇医药
4
372.6±23.9*
1.014±0.185*+#
5.933±0.751*
1.假手术组;2.去颌下腺组;3.去颌下腺给药组;4.假手术给药组.与1组相比，*:P<0.05；与2组相比，+:P<0.05；与3组相比，#:P<0.05.
2.2 假手术组血清EGF和颌下腺EGF的相关系数为0.7415，二者不相关的概率P=0.11(P<0.05)。假手术给药组血清EGF和颌下腺EGF的相关系数为0.1524，二者不相关的概率P=0.719(P>0.05)。
3 讨 论
, 百拇医药
颌下腺EGF由颗粒曲管上皮细胞合成，颌下腺EGF合成与释放受性激素调控。同龄雌性、雄性小鼠相比，雄性颗粒曲管发育较雌性好，其颗粒曲管上皮抗EGF免疫反应较雌性强[3]。成年雄性小鼠颌下腺EGF比雌性多10倍[4]。雄性小鼠EGF和EGF前体mRNA水平明显高于雌性小鼠，反应了性激素对EGF合成的调节作用。雄激素促进颌下腺EGF的合成与释放，雌激素抑制颌下腺EGF的合成与释放[6]。本实验结果显示给予HCG后颌下腺重量增加，颌下腺及血清EGF显著升高，笔者认为HCG促进睾丸合成并释放睾酮，后者作用于颌下腺颗粒曲管上皮及其他能分泌EGF的组织如肾、胃、小肠、睾丸、前列腺、肝脏等[7]，增强它们合成储存EGF并促进其释放EGF入血。睾酮加强颌下腺合成和分泌EGF的作用具有特异性，它不能增加肾、尿EGF含量[6]。睾酮可能通过调控颌下腺EGF基因表达，实现对EGF的调节，它可增加颌下腺EGF mRNA的水平[8]。
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通过比较成年雄性小鼠各组织EGF及EGF前体mRNA的相对含量，颌下腺含量最高[9]。血清EGF是否主要来源于颌下腺，迄今说法不一。Tsutsumi在摘除小鼠颌下腺21天其血清EGF降至测不出[4]。因为小鼠生精周期为34.5天[5]，本文在摘除小鼠颌下腺35天取材。实验结果表明摘除颌下腺后，血清EGF水平不降低，其原因可能是除颌下腺之外，其他组织器官如肾、胃、睾丸、前列腺、肝脏也可以合成EGF[7]，这些组织器官在切除颌下腺后的较长时间内代偿性合成EGF。假手术组颌下腺EGF水平与血清EGF含量呈正相关，说明在正常生理状态下，颌下腺能释放EGF入血，是血EGF的来源之一。给予HCG后颌下腺EGF含量增高，血清EGF水平也增高，表明HCG可促进颌下腺EGF的合成及释放入血，但是颌下腺EGF和血清EGF无明显相关性，推测HCG促进其他组织合成分泌EGF的数量超过了颌下腺EGF的分泌入血量。摘除颌下腺后给予HCG，小鼠血清EGF仍升高且明显高于假手术给药组，提示：(1)HCG可能通过睾酮介导增强其他组织合成分泌EGF并促进释放入血，所以此时血清EGF并不完全依赖于颌下腺；(2)在颌下腺存在的前提下，颌下腺产生的EGF抑制了HCG促其他组织分泌EGF，摘除颌下腺后，其抑制作用被消除，故去颌下腺给药组血清EGF比假手术给药组高。笔者认为颌下腺是血清EGF的部分来源。
, 百拇医药
颌下腺释放EGF入血的机制可能通过以下二个途径：(1)内分泌EGF直接入血[10]；(2)外分泌EGF间接入血。有学者报道，给予促唾液腺分泌的药物后，小鼠颌下腺唾液内含大量EGF；电镜观察对照组颗粒曲管上皮细胞顶浆部分布许多分泌颗粒而基底部甚少，给药组顶浆部分泌颗粒因降解排入导管腔内而明显减少[11]。给小鼠口服EGF可诱导其眼睑早开[12]。颌下腺分泌EGF随唾液进入消化道，可由胃肠吸收，通过门脉血管输送循环。
*:福建省卫生厅青年基金资助课题(9624)
参考文献
1 潘菊芬,邱香果,刘炳仁,等.绒毛膜促性腺激素的免疫调节作用及其机理的探讨.中国免疫学杂志，1990;6(4):32
2 Carpenter G.Epidermal growth factor.J Bio Chem，1990;265:7709
, http://www.100md.com
3 王文青,柳 川,杨静漪,等.不同性别和发育阶段的小鼠颌下腺颗粒曲管的上皮生长因子免疫组化和体视学研究.解剖学杂志，1996;19:338
4 Tsutsumi O,Kurachi H,Oka T,et al.A physiological role of epidermal growth factor in male reproductive function.Science，1986;233:975
5 Oakberg EF.Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the somniferous epithelium.Am J Anat，1956b;99:391
6 Tuometa T,Miettinen P,Pesonen K,et al.Epidermal growth factor in mice: Effects of estradiol,testosterone and dexamethasone,Acta Endocrinologica，1990;123:211
, 百拇医药
7 Kasselberg AG,Orth DN,Gray ME,et al.Immunocytochemical localization of human epidermal growth factor/urogastrone in several human tissues.J Histochemist Cytochemist，1985:3:315
8 Sheflin LG.Increased EGF expression produced by testosterone in the submaxillary gland of female-mice is accompanied by changes in poly-A tail length and periodicity.Endocrinology,1996;137:2085
9 吕宝璋.受体学概论.北京：科学出版社，1991：224～232
, http://www.100md.com
10 成令忠.组织学.第4版.北京：人民卫生出版社，1994：1055～1056
11 Murphy RA,Watson AY,Metz J,et al.The mouse submandibular gland:an exocrine organ for growth factors.J Histochemist Cytochemist，1980;28:890
12 Taylor JM,Cohen S,Mitchell WM,et al.Epidermal growth factor:physical and chemical properties.J Biol Chem,1972;247:5928
(收稿：1999-09-15 修回：1999-03-8), 百拇医药
单位：福建医科大学组织胚胎学教研室，福建省生殖医学中心(福州 350004)
关键词：人绒毛膜促性腺激素；表皮生长因子；颌下腺；小鼠
福建医科大学学报990212 目的 探讨人绒毛膜促性腺激素(HCG)与颌下腺、血清表皮生长因子(EGF)之间的相互调节机制，为内分泌免疫调节网络提供实验依据。方法 ICR雄性小鼠切除颌下腺和给予HCG前后应用放射免疫方法测定颌下腺和血清EGF。结果 假手术给药组颌下腺EGF含量与假手术组相比明显升高
(P<0.05)，去颌下腺组血清EGF与假手术组相比差别无显著性，去颌下腺给药组血清EGF与去颌下腺组相比明显上升(P<0.05)，假手术给药组血清EGF与假手术组相比明显上升(P<0.05)。结论 颌下腺分泌的EGF是血清EGF的来源之一；HCG可促进小鼠颌下腺和其他相关组织合成释放EGF入血。
, 百拇医药
The Effects of Human Choriogonadotropin Treatment on Epidermal Growth Factor Level in Mouse Submandibular Gland and Serum
He Weimin Chen Yiquan Gao Xueyong, et al
(Department of Histology and Embryology,Fujian Medical University,Fuzhou,350004)
Objective Investigation into the joint modulating mechanism between human choriogonadotropin(HCG) and serum epidermal growth factor(EGF) in submandibular gland and serum for offering experimental evidence for endocrine-immunity regulating network.Methods The submandibular and EGF level of ICR mice before and after sialoadenectomy and HCG injection were observed with radioimmunoassay.Results Submandibular concentrations of EGF was significantly higher in mice with sham operation and HCG replenishment than in those with sham operation(P<0.05).There were no difference in serum content of EGF between sham operation group and sialoadenectomized group(P>0.05).Marked increase in serum levels of EGF was observed in sialoadenectomized mice after HCG administration(P<0.05).Serum concentration of EGF was significantly higher in mice with sham operation and HCG replenishment than in those with sham operation(P<0.05).Conclusion Submandibular gland is one of the sources producing and secreting EGF into serum;HCG can increase EGF synthesis in submandibular gland and other related tissues and their EGF releasing into blood.
, 百拇医药
Key words human choriogonadotropin;epidermal growth factor;submaxillary gland;mice
神经-内分泌-免疫网络对机体的共同调节作用已得到人们的共识，如激素可增强或抑制免疫应答或细胞因子的分泌，而细胞因子又可调节激素分泌。人绒毛膜促性腺激素(HCG)可存在多种肿瘤、良性疾病乃至正常人体中，它与免疫调节的关系日益被人们重视[1]。表皮生长因子(EGF)是颌下腺分泌的细胞因子，研究发现EGF具有广泛生物学效应，如刺激多种组织细胞增殖，与肿瘤发生有关等[2]。已有报道，EGF对内分泌腺有调节作用，但是从活体角度研究HCG对EGF调节的报道尚少。本研究在生理和去颌下腺状态下，探讨颌下腺、HCG对血清EGF的影响以及HCG调节颌下腺EGF的机制。
1 材料和方法
1.1 动物实验 选用12～13周龄清洁级ICR雄性性成熟小鼠(购于中科院上海实验动物中心),体重35～42g。实验动物分成4组，每组8只：(1)假手术组；(2)去颌下腺组；(3)去颌下腺给药组；(4)假手术给药组。用10%氨基甲酸乙酯(100～120mg/100g体重)经腹腔麻醉后，手术切除双侧颌下腺并经石蜡切片染色显微镜下观察证实。假手术组仅分离双侧颌下腺，不切除。给药组在术后立即及每2日下午5时腹腔注射HCG(购于上海生物化学公司)10U至术后35天。
, 百拇医药
手术后35天，用10%氨基甲酸乙酯经腹腔麻醉，摘除眼球，滴取眼窝积血。取颌下腺经分析天平称重,计算脏器系数(mg/100g体重)。公式为：脏器系数=脏器重量(mg)×100÷体重(g)。将颌下腺入液氮保存。
1.2 组织样品制备
留血于预冷的Eppendorf管中，3000r/min离心15min，取上清液置-20℃冰箱中保存。切碎颌下腺，加10倍体积提取液(50mmol/L Tris-HCl，pH7.4，1mmol/L EDTA，1mmol/L EGTA)，用超声击碎组织，匀浆以20000g 4℃离心20min，取上清液，-20℃保存。
1.3 表皮生长因子放免测定
采用顺序饱和加样法。放免测定试剂盒购自北京北方生物技术研究所，批内变异<5%，批间变异<10%。总反应体积为800μl：不同浓度EGF标准品100μl(0.1,0.3,0.9,2.7,8.1ng/ml)、待测血清样品或匀浆上清液100μl、零标准管(S0)和NSB管各加“0”标准液100μl。各管加125I-EGF 100μl，充分摇匀后NSB管加蒸馏水100μl，其余各管加抗EGF100μl。其余步骤按试剂盒说明书进行。
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1.4 统计处学理
以上所有测定值均以均值±标准误表示。采用SPSS软件包对以上全部数据进行单因素方差分析处理，以P<0.05为有显著性意义。
2 结 果
2.1 假手术给药组颌下腺EGF含量与假手术组相比明显升高(P<0.05)。去颌下腺组血清EGF与假手术组差别无显著性。去颌下腺给药组血清EGF与去颌下腺组相比明显上升(P<0.05)。假手术给药组血清EGF与假手术组相比明显上升(P<0.05)。去颌下腺给药组的血清EGF与假手术给药组相比显著增高(P<0.05,附表)。
附表 小鼠颌下腺、血清的表皮生长因子含量 分
组
颌下腺脏器系数
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(mg/100gWT)
EGF(ng/ml)
血 清
颌下腺
1
364.9±17.6
0.171±0.016
3.702±0.630
2
0.185±0.024
3
1.959±0.307*+
, 百拇医药
4
372.6±23.9*
1.014±0.185*+#
5.933±0.751*
1.假手术组;2.去颌下腺组;3.去颌下腺给药组;4.假手术给药组.与1组相比，*:P<0.05；与2组相比，+:P<0.05；与3组相比，#:P<0.05.
2.2 假手术组血清EGF和颌下腺EGF的相关系数为0.7415，二者不相关的概率P=0.11(P<0.05)。假手术给药组血清EGF和颌下腺EGF的相关系数为0.1524，二者不相关的概率P=0.719(P>0.05)。
3 讨 论
, 百拇医药
颌下腺EGF由颗粒曲管上皮细胞合成，颌下腺EGF合成与释放受性激素调控。同龄雌性、雄性小鼠相比，雄性颗粒曲管发育较雌性好，其颗粒曲管上皮抗EGF免疫反应较雌性强[3]。成年雄性小鼠颌下腺EGF比雌性多10倍[4]。雄性小鼠EGF和EGF前体mRNA水平明显高于雌性小鼠，反应了性激素对EGF合成的调节作用。雄激素促进颌下腺EGF的合成与释放，雌激素抑制颌下腺EGF的合成与释放[6]。本实验结果显示给予HCG后颌下腺重量增加，颌下腺及血清EGF显著升高，笔者认为HCG促进睾丸合成并释放睾酮，后者作用于颌下腺颗粒曲管上皮及其他能分泌EGF的组织如肾、胃、小肠、睾丸、前列腺、肝脏等[7]，增强它们合成储存EGF并促进其释放EGF入血。睾酮加强颌下腺合成和分泌EGF的作用具有特异性，它不能增加肾、尿EGF含量[6]。睾酮可能通过调控颌下腺EGF基因表达，实现对EGF的调节，它可增加颌下腺EGF mRNA的水平[8]。
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通过比较成年雄性小鼠各组织EGF及EGF前体mRNA的相对含量，颌下腺含量最高[9]。血清EGF是否主要来源于颌下腺，迄今说法不一。Tsutsumi在摘除小鼠颌下腺21天其血清EGF降至测不出[4]。因为小鼠生精周期为34.5天[5]，本文在摘除小鼠颌下腺35天取材。实验结果表明摘除颌下腺后，血清EGF水平不降低，其原因可能是除颌下腺之外，其他组织器官如肾、胃、睾丸、前列腺、肝脏也可以合成EGF[7]，这些组织器官在切除颌下腺后的较长时间内代偿性合成EGF。假手术组颌下腺EGF水平与血清EGF含量呈正相关，说明在正常生理状态下，颌下腺能释放EGF入血，是血EGF的来源之一。给予HCG后颌下腺EGF含量增高，血清EGF水平也增高，表明HCG可促进颌下腺EGF的合成及释放入血，但是颌下腺EGF和血清EGF无明显相关性，推测HCG促进其他组织合成分泌EGF的数量超过了颌下腺EGF的分泌入血量。摘除颌下腺后给予HCG，小鼠血清EGF仍升高且明显高于假手术给药组，提示：(1)HCG可能通过睾酮介导增强其他组织合成分泌EGF并促进释放入血，所以此时血清EGF并不完全依赖于颌下腺；(2)在颌下腺存在的前提下，颌下腺产生的EGF抑制了HCG促其他组织分泌EGF，摘除颌下腺后，其抑制作用被消除，故去颌下腺给药组血清EGF比假手术给药组高。笔者认为颌下腺是血清EGF的部分来源。
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颌下腺释放EGF入血的机制可能通过以下二个途径：(1)内分泌EGF直接入血[10]；(2)外分泌EGF间接入血。有学者报道，给予促唾液腺分泌的药物后，小鼠颌下腺唾液内含大量EGF；电镜观察对照组颗粒曲管上皮细胞顶浆部分布许多分泌颗粒而基底部甚少，给药组顶浆部分泌颗粒因降解排入导管腔内而明显减少[11]。给小鼠口服EGF可诱导其眼睑早开[12]。颌下腺分泌EGF随唾液进入消化道，可由胃肠吸收，通过门脉血管输送循环。
*:福建省卫生厅青年基金资助课题(9624)
参考文献
1 潘菊芬,邱香果,刘炳仁,等.绒毛膜促性腺激素的免疫调节作用及其机理的探讨.中国免疫学杂志，1990;6(4):32
2 Carpenter G.Epidermal growth factor.J Bio Chem，1990;265:7709
, http://www.100md.com
3 王文青,柳 川,杨静漪,等.不同性别和发育阶段的小鼠颌下腺颗粒曲管的上皮生长因子免疫组化和体视学研究.解剖学杂志，1996;19:338
4 Tsutsumi O,Kurachi H,Oka T,et al.A physiological role of epidermal growth factor in male reproductive function.Science，1986;233:975
5 Oakberg EF.Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the somniferous epithelium.Am J Anat，1956b;99:391
6 Tuometa T,Miettinen P,Pesonen K,et al.Epidermal growth factor in mice: Effects of estradiol,testosterone and dexamethasone,Acta Endocrinologica，1990;123:211
, 百拇医药
7 Kasselberg AG,Orth DN,Gray ME,et al.Immunocytochemical localization of human epidermal growth factor/urogastrone in several human tissues.J Histochemist Cytochemist，1985:3:315
8 Sheflin LG.Increased EGF expression produced by testosterone in the submaxillary gland of female-mice is accompanied by changes in poly-A tail length and periodicity.Endocrinology,1996;137:2085
9 吕宝璋.受体学概论.北京：科学出版社，1991：224～232
, http://www.100md.com
10 成令忠.组织学.第4版.北京：人民卫生出版社，1994：1055～1056
11 Murphy RA,Watson AY,Metz J,et al.The mouse submandibular gland:an exocrine organ for growth factors.J Histochemist Cytochemist，1980;28:890
12 Taylor JM,Cohen S,Mitchell WM,et al.Epidermal growth factor:physical and chemical properties.J Biol Chem,1972;247:5928
(收稿：1999-09-15 修回：1999-03-8), 百拇医药