制备电镜超薄切片的技巧
作者：钟秀容 陈莲云 陈文列
单位：福建医科大学电子显微镜室(福州 350004)
关键词：超薄切片，电镜技术
福建医科大学学报990246 超薄切片是电镜技术中基本而关键的步骤，想获得一张完美的切片，要在实际工作中不断摸索、总结并提高。初学者在实际操作中常遇到种种困难。为此，笔者将工作实践中掌握的一些操作技巧予以介绍。
1 切片前的准备工作
1.1 包埋块制备 迅速准确地取材及固定是制样中首要步骤；利用戊二醛固定效果好，多聚甲醛穿透力强的特点，采用混合固定液以达到互补作用。对致密、难浸透的组织，在包埋中采用振荡、延长试剂作用时间可取得良好包埋效果。对不易成团的单细胞，离心弃上清后，加入10%牛血清白蛋白混匀，再离心吸去多余液体，沿管壁加入固定液使之成团。
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1.2 半薄切片定位 为准确观察所需部位的超微结构，多数组织要半薄切片定位后再超薄切片。定位时可根据半薄切片的形态特征，如组织形状、切片边缘、刀痕、小破洞等与包埋块对应。若在解剖镜直视下不易辨别，可将包埋块适当倾斜一定角度，通过反光看清切面，修去非需要部分。对无特殊要求的组织周围包埋介质应尽量修去，使整个切面有均匀的密度。对有游离缘组织，如管腔器官粘膜面、角膜上皮等，修块时在游离缘外要保留适量树脂，以保证电镜下能观察到所需部分。对组织游离缘与包埋树脂界线平直如角膜上皮、植物叶片等标本，修块时梯形的上下边不要与组织游离缘平行，最好倾斜成一定角度或垂直，使切片中不因组织与树脂密度明显不匀而出现交替切片、厚薄不匀现象。
1.3 铜网准备 若切片面积小，宜用有膜载网；对切片面积大者可用300目无膜载网，免去制膜，使切片反差好，皱纹易展平，少污染。无论用过的旧铜网还是新铜网，都要先用浓硫酸经超声波清洗30s(时间不能太长，以免破损严重)，自来水洗净后，用丙酮洗2遍，用小镊子把铜网移到另一小瓶丙酮中并保存(尽量不把瓶底的铜颗粒带过去，以免在电镜下出现铜网网格周边高密度大小均匀的圆形铜颗粒污染)。切片前，将铜网沾0.5%火棉胶液，并马上放滤纸上吸干，使表面不成膜。经上述处理的铜网，在捞片时不易出现疏水现象，染色时基本上不易掉片。
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2 超薄切片中的技巧
2.1 对刀 是切片中关键步骤，对切片结果有很大影响。为了使组织达到最大的切面积，要求切面与切缘位置在垂直和水平两个方向上都要有较高的准确度。使用LKB-5型超薄切片机对刀时，先用粗调使刀与切面距离约0.5cm，然后调组织切面的反光，当反光消失，再继续往前调少许，可基本上使组织面垂直；将手指垫在刀与组织块之间，使黑色的组织块与近白色的手指间形成明显反差，易将刀与切面间距离调成近乎是一条细线。然后左右移刀座，对刀口左右高低相差明显者，能明显看出线是变细还是变粗，反映组织块与刀间的距离，可粗略判定刀的左右高低，确定刀的使用方向。
2.2 预修 调好刀与组织块后，一般先在最左边刀口预修。这时为判断组织面是否切全及平整性，可把体视镜往操作者方向倾30～40°，弥散灯也调低，可清楚观察切面情况。若切面未切全，可将刀座稍后退一点，再略调切面的垂直，最终将切面修全。
2.3 移刀口 对刀口相对平直者，移刀时先把刀座向左移动少许，试探性预切。若未切到组织，说明这把刀由左到右是从高到低，即可大胆向左移刀座；若切到，说明刀是从低到高，此时应后退刀座，把样品块移到刀的中部，重新对刀预修后，向右移刀座切片。通过上述试刀，就可掌握后面用刀方向，移刀时不易出现组织块卡刀现象。因玻璃刀口并非均匀平直，但有一定规律性，故制刀时应按顺序摆放，便于掌握使用。
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2.4 切片 有时因观察需要，切面比常规大几倍，切片时难以一次切全，往往只切全半边，此时可等这半边切够所需切片后，不移动刀口，只用双手小心地将刀座向未切全的另半边切面移动少许，再用中调进刀1～2μm，即可切全。该操作要非常轻微，以免调整过头。对软硬不同的组织块应将硬侧放下边，从硬侧切到软侧。
3 染液配制
配制Reynolds铅染液时，为使柠檬酸钠与硝酸铅反应充分，经持续振摇片刻后，放入超声波仪中助溶，并分3～4次加入新配1mol/L的NaOH液，边加液边调pH为12。关键在超声波中助溶的实际作用时间不超过1min，以免瓶内空气中的CO2与铅离子在超声波作用下快速形成碳酸铅沉淀而使染液变浑浊。配好的铅染液，再用孔经2.2μm微孔滤膜快速过滤，表面加少许液体石蜡隔绝空气。另外，要用分析纯NaOH，以减少其碳酸根离子含量。
(收稿:1998-10-06), 百拇医药
单位：福建医科大学电子显微镜室(福州 350004)
关键词：超薄切片，电镜技术
福建医科大学学报990246 超薄切片是电镜技术中基本而关键的步骤，想获得一张完美的切片，要在实际工作中不断摸索、总结并提高。初学者在实际操作中常遇到种种困难。为此，笔者将工作实践中掌握的一些操作技巧予以介绍。
1 切片前的准备工作
1.1 包埋块制备 迅速准确地取材及固定是制样中首要步骤；利用戊二醛固定效果好，多聚甲醛穿透力强的特点，采用混合固定液以达到互补作用。对致密、难浸透的组织，在包埋中采用振荡、延长试剂作用时间可取得良好包埋效果。对不易成团的单细胞，离心弃上清后，加入10%牛血清白蛋白混匀，再离心吸去多余液体，沿管壁加入固定液使之成团。
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1.2 半薄切片定位 为准确观察所需部位的超微结构，多数组织要半薄切片定位后再超薄切片。定位时可根据半薄切片的形态特征，如组织形状、切片边缘、刀痕、小破洞等与包埋块对应。若在解剖镜直视下不易辨别，可将包埋块适当倾斜一定角度，通过反光看清切面，修去非需要部分。对无特殊要求的组织周围包埋介质应尽量修去，使整个切面有均匀的密度。对有游离缘组织，如管腔器官粘膜面、角膜上皮等，修块时在游离缘外要保留适量树脂，以保证电镜下能观察到所需部分。对组织游离缘与包埋树脂界线平直如角膜上皮、植物叶片等标本，修块时梯形的上下边不要与组织游离缘平行，最好倾斜成一定角度或垂直，使切片中不因组织与树脂密度明显不匀而出现交替切片、厚薄不匀现象。
1.3 铜网准备 若切片面积小，宜用有膜载网；对切片面积大者可用300目无膜载网，免去制膜，使切片反差好，皱纹易展平，少污染。无论用过的旧铜网还是新铜网，都要先用浓硫酸经超声波清洗30s(时间不能太长，以免破损严重)，自来水洗净后，用丙酮洗2遍，用小镊子把铜网移到另一小瓶丙酮中并保存(尽量不把瓶底的铜颗粒带过去，以免在电镜下出现铜网网格周边高密度大小均匀的圆形铜颗粒污染)。切片前，将铜网沾0.5%火棉胶液，并马上放滤纸上吸干，使表面不成膜。经上述处理的铜网，在捞片时不易出现疏水现象，染色时基本上不易掉片。
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2 超薄切片中的技巧
2.1 对刀 是切片中关键步骤，对切片结果有很大影响。为了使组织达到最大的切面积，要求切面与切缘位置在垂直和水平两个方向上都要有较高的准确度。使用LKB-5型超薄切片机对刀时，先用粗调使刀与切面距离约0.5cm，然后调组织切面的反光，当反光消失，再继续往前调少许，可基本上使组织面垂直；将手指垫在刀与组织块之间，使黑色的组织块与近白色的手指间形成明显反差，易将刀与切面间距离调成近乎是一条细线。然后左右移刀座，对刀口左右高低相差明显者，能明显看出线是变细还是变粗，反映组织块与刀间的距离，可粗略判定刀的左右高低，确定刀的使用方向。
2.2 预修 调好刀与组织块后，一般先在最左边刀口预修。这时为判断组织面是否切全及平整性，可把体视镜往操作者方向倾30～40°，弥散灯也调低，可清楚观察切面情况。若切面未切全，可将刀座稍后退一点，再略调切面的垂直，最终将切面修全。
2.3 移刀口 对刀口相对平直者，移刀时先把刀座向左移动少许，试探性预切。若未切到组织，说明这把刀由左到右是从高到低，即可大胆向左移刀座；若切到，说明刀是从低到高，此时应后退刀座，把样品块移到刀的中部，重新对刀预修后，向右移刀座切片。通过上述试刀，就可掌握后面用刀方向，移刀时不易出现组织块卡刀现象。因玻璃刀口并非均匀平直，但有一定规律性，故制刀时应按顺序摆放，便于掌握使用。
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2.4 切片 有时因观察需要，切面比常规大几倍，切片时难以一次切全，往往只切全半边，此时可等这半边切够所需切片后，不移动刀口，只用双手小心地将刀座向未切全的另半边切面移动少许，再用中调进刀1～2μm，即可切全。该操作要非常轻微，以免调整过头。对软硬不同的组织块应将硬侧放下边，从硬侧切到软侧。
3 染液配制
配制Reynolds铅染液时，为使柠檬酸钠与硝酸铅反应充分，经持续振摇片刻后，放入超声波仪中助溶，并分3～4次加入新配1mol/L的NaOH液，边加液边调pH为12。关键在超声波中助溶的实际作用时间不超过1min，以免瓶内空气中的CO2与铅离子在超声波作用下快速形成碳酸铅沉淀而使染液变浑浊。配好的铅染液，再用孔经2.2μm微孔滤膜快速过滤，表面加少许液体石蜡隔绝空气。另外，要用分析纯NaOH，以减少其碳酸根离子含量。
(收稿:1998-10-06), 百拇医药