口腔粘性放线菌菌毛的初步制备
作者：关为群 刘正
单位：福建医科大学附属协和医院口腔科(福州 350001)
关键词：粘性放线菌；菌毛超声震荡；透射电镜
福建医科大学学报990244 口腔粘性放线菌是口腔常见病牙周病、根面龋、放线菌病的重要病源之一,80年代起对其胞壁的成分观察研究证实，粘放菌的致病力与表面菌毛的有无、菌毛的类型密切相关[1～3]。但究竟是菌毛的哪些分子结构在发挥作用至今尚不清楚，问题解决的关键在于如何获得较为纯净的菌毛。本研究针对该难题进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 细菌的选择 国际标准参考株T14v(表面含大量的Ⅰ、Ⅱ型菌毛)和其突变株147菌(表面不含任何菌毛)由上海市口腔研究所提供；上述菌株经形态、染色、生化鉴定后纳入实验菌株。
, 百拇医药
1.2 细菌的培养和收集 将粘性放线菌T14v和147菌接种在含0.25%葡萄糖的TSB培养基中，微需氧条件下，37℃培养48h，离心30min(3000r/min，4℃)，收集细菌，用4℃生理盐水振荡洗涤2次后，再用无菌蒸馏水洗涤一次，收集沉淀细菌。
1.3 细菌菌毛的制备及观察 按每4g细菌中加入0.01mol/L磷酸缓冲液100ml(pH 7.0)将细菌制备成悬浊液，取8个玻璃杯，4个分别装入T14v悬浊液，另4个装入147菌悬浊液，每个杯子中加入适量的玻璃珠。每种菌株分别利用超声震荡器高速头全速震荡4,5,6,7min，整个过程均用冰浴使之保持在4℃状态下，用少量的水洗净玻璃珠，提取液和洗净液合并收集。
1.4 简易正染法 各取不同时间超声震荡后的不同细菌悬液一滴于铜网上，静置数分种，滤纸略吸干，加1滴1%醋酸铀染料，静置1～2min，用滤纸充分吸干，所有制片均在透射电镜下观察[4]。
, http://www.100md.com
1.5 菌毛的收集 将超声后的菌悬浊液4℃下离心20min(10000r/min)收集上清液，将含菌毛的上清液在不断搅拌下用0.015μm的硝酸纤维膜进行过滤。过滤液在10000r/min下再次离心以去除污染的细胞碎片和细菌。收集上清液，取1滴上清液电镜下观察，其余的边搅拌边缓慢加入硫酸铵使之最终浓度为33%，收集沉淀物[5]。取微量收集物电镜下观察。
2 结 果
粘性放线菌T14v在微需氧条件下培养48h时镜下见菌体周边含有大量的长短不一的菌毛(图1)，而147菌则周边光滑，未见菌毛。T14v菌经超声震荡4min后电镜下观察,可见T14v周边菌毛数量较未震荡前减少且菌毛长度有所缩短，但胞壁完整性尚存在，147菌亦未见破裂等改变；超声震荡5min时，T14v周边菌毛数量明显减少，许多胞壁上残存的菌毛长度较上一组更加缩短，T14v菌和147菌胞壁完整性仍存在(图2)；超声震荡6min，T14v菌残余的周边菌毛数量和长度没有明显改变，但T14v菌和147菌均出现部分菌体胞壁完整性发生破坏；超声震荡7min，大多数菌体完整性受到破坏，出现许多大小不一的胞壁碎片。
, 百拇医药
图1 粘性放线菌T14v培养48h时菌体菌毛
简易醋酸铀染色 ×40000
图2 粘性放线菌T14v培养48h经超声震荡5min后菌体菌毛
简易醋酸铀染色 ×40000
将超声后的菌悬浊液离心后，上清液在电镜下观察均为长短不一的菌毛，但镜下菌毛密度较稀；经二次饱和硫酸铵盐析法处理后，电镜下观察菌毛密度增高。
3 讨 论
细菌致病的第一步是细菌的粘附，细菌粘附并定殖于组织器官是致病菌引发疾病的重要开端，粘性放线菌亦如此。大量研究现已证实粘性放线菌表面菌毛分为Ⅰ、Ⅱ型，Ⅰ型调节细菌吸附于牙齿硬组织表面，参与牙菌斑形成的早期阶段，Ⅱ型菌毛则主要调节粘性放线菌与后继菌之间的共凝集反应，参与牙菌斑形成的成熟阶段。因此有效地对菌毛进行分离纯化，分析不同型菌菌毛化学成分的差别，对进一步揭示其致病机制至关重要。
, 百拇医药
本研究选用同一口腔原型株T14v及其突变株147菌，在分组情况下，采用超声震荡法加简易醋酸铀染色电镜观察，在电镜下直接观察如何有效地获得菌毛又不损伤细菌胞壁，导致其破裂。通过几组对照分析，认为高速超声震荡5min对口腔粘性放线菌表面菌毛大部分能分离而又不至于破坏胞壁，而超过5min则产生胞壁破坏，导致胞内容物的溢出，将对以后的成分分析产生影响。以往判断胞壁是否破裂往往采用半胱氨酸-硫酸法通过检测核苷酸的呈色反应来加以鉴定，设备要求较高，操作复杂，时间较长[5]。简易醋酸铀染色观察法则操作简便，快捷，值得借鉴。菌毛制备后仍须进一步的纯化，本研究通过硝酸纤维滤膜和硫酸铵盐析法，对其初步纯化，在电镜下得到证实，当然仍需电泳、离子交换柱过滤等进一步纯化处理，并深入其化学成分的分析才能揭示其致病性；同时也可利用纯化的菌毛制备菌毛疫苗，这对口腔疾病的防治也具重要意义。
参考文献
1 Wheeler TT,Clark WB.Fibril-mediated adherence of actinomyces viscosus to saliva-treated hydroxyapatite.Infect Immun,1980;28:577
, 百拇医药
2 Cisar JO,Vatter AE,Clark WB.et al.Mutants of actinomyces viscosus T14v lacking type 1,type 2 or both types of fimbriae.Infect Immun,1988;56:2984
3 关为群,刘 正.粘性放线菌T14v突变株粘附机制的探讨.中华口腔医学杂志,1995;30:329
4 关为群,刘 正.口腔粘性放线菌菌毛的电镜下观察.口腔医学纵横，1995;11:73
5 贾文祥,杜 艳,尹致英,等.霍乱弧菌0139的培养及其菌毛提取.中华微生物和免疫学杂志，1998;18:335
(收稿:1998-12-15 修回:1999-03-08), 百拇医药
单位：福建医科大学附属协和医院口腔科(福州 350001)
关键词：粘性放线菌；菌毛超声震荡；透射电镜
福建医科大学学报990244 口腔粘性放线菌是口腔常见病牙周病、根面龋、放线菌病的重要病源之一,80年代起对其胞壁的成分观察研究证实，粘放菌的致病力与表面菌毛的有无、菌毛的类型密切相关[1～3]。但究竟是菌毛的哪些分子结构在发挥作用至今尚不清楚，问题解决的关键在于如何获得较为纯净的菌毛。本研究针对该难题进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 细菌的选择 国际标准参考株T14v(表面含大量的Ⅰ、Ⅱ型菌毛)和其突变株147菌(表面不含任何菌毛)由上海市口腔研究所提供；上述菌株经形态、染色、生化鉴定后纳入实验菌株。
, 百拇医药
1.2 细菌的培养和收集 将粘性放线菌T14v和147菌接种在含0.25%葡萄糖的TSB培养基中，微需氧条件下，37℃培养48h，离心30min(3000r/min，4℃)，收集细菌，用4℃生理盐水振荡洗涤2次后，再用无菌蒸馏水洗涤一次，收集沉淀细菌。
1.3 细菌菌毛的制备及观察 按每4g细菌中加入0.01mol/L磷酸缓冲液100ml(pH 7.0)将细菌制备成悬浊液，取8个玻璃杯，4个分别装入T14v悬浊液，另4个装入147菌悬浊液，每个杯子中加入适量的玻璃珠。每种菌株分别利用超声震荡器高速头全速震荡4,5,6,7min，整个过程均用冰浴使之保持在4℃状态下，用少量的水洗净玻璃珠，提取液和洗净液合并收集。
1.4 简易正染法 各取不同时间超声震荡后的不同细菌悬液一滴于铜网上，静置数分种，滤纸略吸干，加1滴1%醋酸铀染料，静置1～2min，用滤纸充分吸干，所有制片均在透射电镜下观察[4]。
, http://www.100md.com
1.5 菌毛的收集 将超声后的菌悬浊液4℃下离心20min(10000r/min)收集上清液，将含菌毛的上清液在不断搅拌下用0.015μm的硝酸纤维膜进行过滤。过滤液在10000r/min下再次离心以去除污染的细胞碎片和细菌。收集上清液，取1滴上清液电镜下观察，其余的边搅拌边缓慢加入硫酸铵使之最终浓度为33%，收集沉淀物[5]。取微量收集物电镜下观察。
2 结 果
粘性放线菌T14v在微需氧条件下培养48h时镜下见菌体周边含有大量的长短不一的菌毛(图1)，而147菌则周边光滑，未见菌毛。T14v菌经超声震荡4min后电镜下观察,可见T14v周边菌毛数量较未震荡前减少且菌毛长度有所缩短，但胞壁完整性尚存在，147菌亦未见破裂等改变；超声震荡5min时，T14v周边菌毛数量明显减少，许多胞壁上残存的菌毛长度较上一组更加缩短，T14v菌和147菌胞壁完整性仍存在(图2)；超声震荡6min，T14v菌残余的周边菌毛数量和长度没有明显改变，但T14v菌和147菌均出现部分菌体胞壁完整性发生破坏；超声震荡7min，大多数菌体完整性受到破坏，出现许多大小不一的胞壁碎片。
, 百拇医药
图1 粘性放线菌T14v培养48h时菌体菌毛
简易醋酸铀染色 ×40000
图2 粘性放线菌T14v培养48h经超声震荡5min后菌体菌毛
简易醋酸铀染色 ×40000
将超声后的菌悬浊液离心后，上清液在电镜下观察均为长短不一的菌毛，但镜下菌毛密度较稀；经二次饱和硫酸铵盐析法处理后，电镜下观察菌毛密度增高。
3 讨 论
细菌致病的第一步是细菌的粘附，细菌粘附并定殖于组织器官是致病菌引发疾病的重要开端，粘性放线菌亦如此。大量研究现已证实粘性放线菌表面菌毛分为Ⅰ、Ⅱ型，Ⅰ型调节细菌吸附于牙齿硬组织表面，参与牙菌斑形成的早期阶段，Ⅱ型菌毛则主要调节粘性放线菌与后继菌之间的共凝集反应，参与牙菌斑形成的成熟阶段。因此有效地对菌毛进行分离纯化，分析不同型菌菌毛化学成分的差别，对进一步揭示其致病机制至关重要。
, 百拇医药
本研究选用同一口腔原型株T14v及其突变株147菌，在分组情况下，采用超声震荡法加简易醋酸铀染色电镜观察，在电镜下直接观察如何有效地获得菌毛又不损伤细菌胞壁，导致其破裂。通过几组对照分析，认为高速超声震荡5min对口腔粘性放线菌表面菌毛大部分能分离而又不至于破坏胞壁，而超过5min则产生胞壁破坏，导致胞内容物的溢出，将对以后的成分分析产生影响。以往判断胞壁是否破裂往往采用半胱氨酸-硫酸法通过检测核苷酸的呈色反应来加以鉴定，设备要求较高，操作复杂，时间较长[5]。简易醋酸铀染色观察法则操作简便，快捷，值得借鉴。菌毛制备后仍须进一步的纯化，本研究通过硝酸纤维滤膜和硫酸铵盐析法，对其初步纯化，在电镜下得到证实，当然仍需电泳、离子交换柱过滤等进一步纯化处理，并深入其化学成分的分析才能揭示其致病性；同时也可利用纯化的菌毛制备菌毛疫苗，这对口腔疾病的防治也具重要意义。
参考文献
1 Wheeler TT,Clark WB.Fibril-mediated adherence of actinomyces viscosus to saliva-treated hydroxyapatite.Infect Immun,1980;28:577
, 百拇医药
2 Cisar JO,Vatter AE,Clark WB.et al.Mutants of actinomyces viscosus T14v lacking type 1,type 2 or both types of fimbriae.Infect Immun,1988;56:2984
3 关为群,刘 正.粘性放线菌T14v突变株粘附机制的探讨.中华口腔医学杂志,1995;30:329
4 关为群,刘 正.口腔粘性放线菌菌毛的电镜下观察.口腔医学纵横，1995;11:73
5 贾文祥,杜 艳,尹致英,等.霍乱弧菌0139的培养及其菌毛提取.中华微生物和免疫学杂志，1998;18:335
(收稿:1998-12-15 修回:1999-03-08), 百拇医药