马齿苋水提物对氧自由基清除作用的研究
作者：曾小玲
单位：无机分析化学教研室 长沙 410078
关键词：氧自由基；马齿苋*；分光光度测定法
湖南医科大学学报990213 提 要 采用连苯三酚在碱性溶液中自氧化反应产生超氧阴离子自由基(
)，用邻二氮菲-Fe(Ⅱ)/H2O2体系产生羟自由基(.OH)，用分光光度法(波长为322nm和536nm)监测鲜马齿苋水提物和经沸水处理后的马齿苋水提物对和.OH的作用。结果表明：鲜马齿苋水提物对的生成有明显的促进作用，对.OH具有清除作用；沸水处理后的马齿苋水提物对和.OH均有显著的清除作用。
, http://www.100md.com
A study of scavenging action of purslane aquenous extracts
on oxygen free radical
Zeng Xiaoling
(Department of Chemistry, Hunan Medical University, Changsha 410078)
Auto-oxidation in alkalcsent solution with the help of pyrogallol can generate, and the system of 1, 10-phenathroline-Fe(Ⅱ)/H2O2 can produce .OH. Spectropholometry (wave length 322nm and 536nm) was used to observe the effect of fresh purslane aqueous extracts and the purslane aquenous extracts processed by boiling water upon and *OH. The results showed that fresh purslane aqueous extracts could obviously help generate and reduce .OH, and the aqueous extracts of purslane processed by boiling water had a scavenging action on and .OH greatly.
, 百拇医药
Key words oxygen free radical; purslane*; spectrophotometry
马齿苋(portulaca oleracea L)又名瓜子菜，为马齿苋科马齿苋属植物，我国从南到北均有生长，其资源极为丰富。祖国医学认为，它有散血消肿、清热解毒、止痢杀虫之功效，民间早已用于治疗肠道或皮肤粘膜等局部感染、腮腺炎、疔疮疖肿、痢疾等。治疗时或用鲜草捣烂外敷，或用干品煎水内服[1]。其干品是将鲜马齿苋经沸水烫过后晒干而成[2]。近年来马齿苋用于治疗高血脂、老年性冠心病及动脉硬化等，收到很好效果[3]。但至今尚未见文献报道马齿苋对氧自由基清除作用的研究。为此，本文对鲜马齿苋水提物和经沸水烫过后的马齿苋水提物，分别在碱性溶液中对连苯三酚(邻苯三酚)氧自由化产生的超氧阴离子自由基和由 邻二氮菲-Fe(Ⅱ)/H2O2体系产生的羟自由基(.OH)的清除作用进行了初步探讨。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 鲜马齿苋采自长沙地区。试剂包括连苯三酚、硫酸亚铁铵、过氧化氢、邻二氮菲、磷酸氢钾、磷 酸二氢钾及氢氧化钠，均为国产分析纯。 pH7.40的磷酸缓冲液(PBS)用磷酸二氢钾和氢氧化钠配制。pH8.34的磷酸缓冲液(PBS)用磷酸二氢钾和磷酸氢钾配制。VIS-723型分光光度计系上海仪器三厂生产。
1.2 实验方法
1.2.1 水提物制备 取鲜马齿苋全草切碎捣烂，加水浸泡，过滤，得水提物Ⅰ。另取鲜马齿苋用沸水烫过后，切碎捣烂，加水浸泡，过滤，得水提物Ⅱ。以上水提物均含鲜马齿苋200mg.ml-1。
1.2.2的生成及清除率的测定 利用清除剂能使连苯三酚自氧化产物在λ=322nm处的吸收峰受到抑制这一特点，进行光化学方法监测，间接测得生成及的清除率。按参考文献[4]的方法，采用如下实验方案：25℃，总体积9.00ml，pH8.34的PBS 50mmol.L-1，连苯三酚0.2mmol.L-1，加入一定量水提物，测定反应启动后第10s时的A322值(用同浓度同一水提物作为参比，以消除试样本身在322nm处的吸收)。另取试剂同上，不加水提物以作对照，测反应启动后第10s时的A322值(用pH8.34的PBS作为参比)。清除率按下式计算：清除率S%=(A空-A样)÷A空×100%
, 百拇医药
1.2.3生成的抑制率测定 反应体系同上。用动态方法测定生成的反应初速率VO(A.min)。反应启动后每30s测一相应A322值，至4.5min止。将所得A322值与时间t(min)进行回归分析，其斜率为VO。抑制率按下式计算：抑制率I%=(VO空-VO样)÷VO空×100%
1.2.4 .OH的生成及清除率的测定 按参考文献[5]的方法，采用如下的反应体系和步骤：邻二氮菲0.75mmol.L-1，FeSO4 0.75mmol.L-1，pH7.40的PBS 150mmol.L-1，加0.01% H2O2(损)或不加H2O2(未损)，37℃保温60min，分别测λ=536nm时的A值，得A损与A未损。邻二氮菲0.75mmol.L-1，FeSO4 0.75mmol.L-1，PBS 150mmol.L-1(pH7.40)，H2O2 0.01%，加入水提物(含马齿苋8mg.ml-1)，以同浓度水提物作参比，测A536，即A样。.OH清除率按下式计算：
, 百拇医药
.OH清除率S%=(A样-A损)÷(A未损-A损)×100%
1.3 统计学处理 数据以
±s表示。统计采用方差分析、线性相关和回归分析。
2 结果
2.1 水提物对的清除作用 由于连苯三酚自氧化过程有和有色中间产物产生，而该中间产物在322nm处有一特征吸收，故在本实验条件下，可据A322值的变化观察水提物对的清除作用。当加入水提物后，若体系在322nm处的A值增大，表示该水提物对连苯三酚自氧化过程和的生成有促进作用(故其对的清除率用负值表示)；若加入水提物后，体系的A322值减小，则表明该水提物对连苯三酚自氧化过程有抑制作用，对具有清除作用(其清除率用正值表示)。本实验结果见表1。表1示，加入各水提物后，A322值均有显著变化(P<0.01)，说明二试样对的生成均有影响。加入水提物Ⅰ后，测得A322显著增大，表明水提物Ⅰ对的生成有明显的促进作用(P<0.01)，故水提物Ⅰ对的清除率为负值。当水提物Ⅰ的浓度增大时，A322显著增大(P<0.01)，提示该促进作用与水提物Ⅰ的浓度呈正相关。加入水提物Ⅱ后A322显著减小，表明水提物Ⅱ对具有明显的清除作用(P<0.01)，且该作用也随其浓度的增加而显著增大(P<0.01)。
, 百拇医药
表1 水提物对的清除作用(±s,n=5) 试样(ml)
A322清除率(%)
对 照
0.521±0.001
0.0
水提物Ⅰ(0.50)
0.586±0.004①
-12.4±0.7
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水提物Ⅰ(1.00)
0.607±0.006①
-16.5±1.1
水提物Ⅱ(0.50)
0.476±0.005①
8.7±0.9
水提物Ⅱ(1.00)
0.438±0.006①
15.9±1.1
①与对照比较P<0.01
2.2 水提物对生成的抑制作用 用动态方法测得反应的初速率VO(A.min-1)。本实验回归的相关系数在0.9969～0.9992之间(表2)。加入水提物后，体系中产生速率均有显著变化(P<0.01)。加入水提物Ⅰ后，生成速率VO显著增大(P<0.01)，表明水提物Ⅰ不仅不能减缓的生成速率(其抑制率为负值)，反而能加速的生成。且VO加快的程度随其用量增加而增加(P<0.05)。加入水提物Ⅱ后VO值明显减小，提示水提物Ⅱ可显著抑制的生成速率(抑制率为正值)，其用量增大时抑制能力显著增强(P<0.01)。
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表2 水提物对的抑制作用(±s,n=5) 试样(ml)
VO(A.min-1)抑制率(%)
对 照
0.0632±0.0001
-
水提物Ⅰ(0.50)
0.0702±0.0002①
, 百拇医药
-11.2±0.4
水提物Ⅰ(1.00)
0.0739±0.0008①
-16.9±1.8
水提物Ⅱ(0.50)
0.0586±0.0009①
8.0±1.5
水提物Ⅱ(1.00)
0.0537±0.0001①
10.2±5.3
①与对照比较P<0.01
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2.3 水提物对.OH的清除作用 在本实验条件下，由A536的测定值观察水提物对.OH的清除效应。测得A未损为0.528±0.001，其它数值见表3。水提物Ⅰ和Ⅱ在60min时对.OH的清除率分别为15.6%和41.7%，表明二者均具有清除.OH的作用，且水提物Ⅱ的清除作用明显大于水提物Ⅰ(P<0.01)。
表3 水提物对.OH的清除作用(±s,n=5) 试样(ml)
A536
, 百拇医药 .OH清除率(%)
对照(损)
0.317±0.001
0.0
水提物Ⅰ
0.350±0.012①
15.6±5.6
水提物Ⅱ
0.405±0.004①
41.7±2.1
①与对照比较P<0.01
, 百拇医药
3 讨论
本文在测定的生成和清除率时改用了pH8.34的PBS，比文献中的Tris-HCl缓冲液成本低，且A与t之间的直线范围宽。
随着自由基研究的不断深入，氧自由基造成的组织损伤已为人们所关注[6]。它能破坏脂类、细胞膜、核酸及染色体，影响蛋白质性质及酶的活性。实验证明，细胞的死亡与有关，可利用杀死细菌。本文表明未经处理的马齿苋水提物能促进的生成。当机体感染细菌后，若体内不能产生足量的，则不能杀死细菌，故鲜马齿苋常用于治疗痈疖、痢疾等。本实验还发现沸水处理后，马齿苋水提物对和.OH的清除作用显著增强。由于和.OH都是很强的氧化剂，能使许多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，能降低胶原和透明质酸，从而使缺血组织受到损伤。当机体及.OH过多时，会产生大量脂质过氧化物(LPO)，损伤细胞膜，引起高血脂、冠心病等[7]。因沸水处理后的马齿苋能清除及.OH，故可用于防治心血管疾病。
, 百拇医药
马齿苋含有多种化学成分，其中主要是三萜类，黄酮类，维生素C，维生素E，多种氨基酸、各种有机酸(如苹果酸、柠檬酸)的钾盐、钙盐及丰富的n-3多价不饱和脂肪酸[8～10]。研究表明[11]，n-3多价不饱和脂肪酸有降血脂作用，对心血管疾病(包括亚洲人的脑血管病)有防治作用。故笔者认为，马齿苋的沸水提物是良好的氧自由基清除剂，因它含有清除氧自由基作用的三萜，黄酮，维生素C，维生素E及n-3多价不饱和脂肪酸。马齿苋在我国资源丰富，且具有多种潜在的药用价值，但目前市场上尚缺乏以马齿苋为原料的制剂，故有待今后大力开发利用。不同处理方法引起的马齿苋水提物对的作用的差异，也许能解释马齿苋临床使用上的差异，如新鲜草药用于皮肤及肠道感染，沸水处理过的制剂可望用于防治心血管病。
中国图书分类号 R282
参考文献
, 百拇医药
[1]湖南中医药研究所.湖南药物志(第二辑).第一版，长沙：湖南人民出版社，1972：90-91
[2]南京药学院《中草药学》编写组.中草药学(中册).第一版，南京：江苏人民出版社，1976：197-198
[3]郑大文.马齿苋的新用途.中药材，1996，19(9)：485
[4]邹国林，桂兴芬，钟晓凌，等.一种SOD的测活方法.生物化学与生物物理进展，1986，13(4)：71-73
[5]金鸣，蔡亚欣，李金荣，等.邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由基.生物化学与生物物理进展，1996，23(6)：553-555
[6]莫简主编.医用自由基生物学导论.第一版，北京：人民卫生出版社，1989：80-85
, 百拇医药
[7]陈顺志.过氧化脂质与疾病.锦州医学院学报，1987，8(3)：283
[8]江苏新医学院.中药大辞典(上册).第一版，上海：上海人民出版社，1977：289-290
[9]Simopulos MD. Purslane: A terrestrial source of omega-3 fatty acids. New Engl J Med, 1986,315(13):833
[10]刘宗林.马齿苋药理作用与临床作用.安徽医学，1997，18(4)：57-58
[11]Alexader L, Weber PC. Cardiovascular effects of n-3 fatty acids. New Engl J Med, 1990,318(9):549
收稿日期：1998-09-30, 百拇医药
单位：无机分析化学教研室 长沙 410078
关键词：氧自由基；马齿苋*；分光光度测定法
湖南医科大学学报990213 提 要 采用连苯三酚在碱性溶液中自氧化反应产生超氧阴离子自由基(
)，用邻二氮菲-Fe(Ⅱ)/H2O2体系产生羟自由基(.OH)，用分光光度法(波长为322nm和536nm)监测鲜马齿苋水提物和经沸水处理后的马齿苋水提物对和.OH的作用。结果表明：鲜马齿苋水提物对的生成有明显的促进作用，对.OH具有清除作用；沸水处理后的马齿苋水提物对和.OH均有显著的清除作用。, http://www.100md.com
A study of scavenging action of purslane aquenous extracts
on oxygen free radical
Zeng Xiaoling
(Department of Chemistry, Hunan Medical University, Changsha 410078)
Auto-oxidation in alkalcsent solution with the help of pyrogallol can generate
, and the system of 1, 10-phenathroline-Fe(Ⅱ)/H2O2 can produce .OH. Spectropholometry (wave length 322nm and 536nm) was used to observe the effect of fresh purslane aqueous extracts and the purslane aquenous extracts processed by boiling water upon and *OH. The results showed that fresh purslane aqueous extracts could obviously help generate and reduce .OH, and the aqueous extracts of purslane processed by boiling water had a scavenging action on and .OH greatly., 百拇医药
Key words oxygen free radical; purslane*; spectrophotometry
马齿苋(portulaca oleracea L)又名瓜子菜，为马齿苋科马齿苋属植物，我国从南到北均有生长，其资源极为丰富。祖国医学认为，它有散血消肿、清热解毒、止痢杀虫之功效，民间早已用于治疗肠道或皮肤粘膜等局部感染、腮腺炎、疔疮疖肿、痢疾等。治疗时或用鲜草捣烂外敷，或用干品煎水内服[1]。其干品是将鲜马齿苋经沸水烫过后晒干而成[2]。近年来马齿苋用于治疗高血脂、老年性冠心病及动脉硬化等，收到很好效果[3]。但至今尚未见文献报道马齿苋对氧自由基清除作用的研究。为此，本文对鲜马齿苋水提物和经沸水烫过后的马齿苋水提物，分别在碱性溶液中对连苯三酚(邻苯三酚)氧自由化产生的超氧阴离子自由基
和由 邻二氮菲-Fe(Ⅱ)/H2O2体系产生的羟自由基(.OH)的清除作用进行了初步探讨。, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 鲜马齿苋采自长沙地区。试剂包括连苯三酚、硫酸亚铁铵、过氧化氢、邻二氮菲、磷酸氢钾、磷 酸二氢钾及氢氧化钠，均为国产分析纯。 pH7.40的磷酸缓冲液(PBS)用磷酸二氢钾和氢氧化钠配制。pH8.34的磷酸缓冲液(PBS)用磷酸二氢钾和磷酸氢钾配制。VIS-723型分光光度计系上海仪器三厂生产。
1.2 实验方法
1.2.1 水提物制备 取鲜马齿苋全草切碎捣烂，加水浸泡，过滤，得水提物Ⅰ。另取鲜马齿苋用沸水烫过后，切碎捣烂，加水浸泡，过滤，得水提物Ⅱ。以上水提物均含鲜马齿苋200mg.ml-1。
1.2.2
的生成及清除率的测定 利用清除剂能使连苯三酚自氧化产物在λ=322nm处的吸收峰受到抑制这一特点，进行光化学方法监测，间接测得生成及的清除率。按参考文献[4]的方法，采用如下实验方案：25℃，总体积9.00ml，pH8.34的PBS 50mmol.L-1，连苯三酚0.2mmol.L-1，加入一定量水提物，测定反应启动后第10s时的A322值(用同浓度同一水提物作为参比，以消除试样本身在322nm处的吸收)。另取试剂同上，不加水提物以作对照，测反应启动后第10s时的A322值(用pH8.34的PBS作为参比)。清除率按下式计算：清除率S%=(A空-A样)÷A空×100%, 百拇医药
1.2.3
生成的抑制率测定 反应体系同上。用动态方法测定生成的反应初速率VO(A.min)。反应启动后每30s测一相应A322值，至4.5min止。将所得A322值与时间t(min)进行回归分析，其斜率为VO。抑制率按下式计算：抑制率I%=(VO空-VO样)÷VO空×100%1.2.4 .OH的生成及清除率的测定 按参考文献[5]的方法，采用如下的反应体系和步骤：邻二氮菲0.75mmol.L-1，FeSO4 0.75mmol.L-1，pH7.40的PBS 150mmol.L-1，加0.01% H2O2(损)或不加H2O2(未损)，37℃保温60min，分别测λ=536nm时的A值，得A损与A未损。邻二氮菲0.75mmol.L-1，FeSO4 0.75mmol.L-1，PBS 150mmol.L-1(pH7.40)，H2O2 0.01%，加入水提物(含马齿苋8mg.ml-1)，以同浓度水提物作参比，测A536，即A样。.OH清除率按下式计算：
, 百拇医药
.OH清除率S%=(A样-A损)÷(A未损-A损)×100%
1.3 统计学处理 数据以
±s表示。统计采用方差分析、线性相关和回归分析。2 结果
2.1 水提物对
的清除作用 由于连苯三酚自氧化过程有和有色中间产物产生，而该中间产物在322nm处有一特征吸收，故在本实验条件下，可据A322值的变化观察水提物对的清除作用。当加入水提物后，若体系在322nm处的A值增大，表示该水提物对连苯三酚自氧化过程和的生成有促进作用(故其对的清除率用负值表示)；若加入水提物后，体系的A322值减小，则表明该水提物对连苯三酚自氧化过程有抑制作用，对具有清除作用(其清除率用正值表示)。本实验结果见表1。表1示，加入各水提物后，A322值均有显著变化(P<0.01)，说明二试样对的生成均有影响。加入水提物Ⅰ后，测得A322显著增大，表明水提物Ⅰ对的生成有明显的促进作用(P<0.01)，故水提物Ⅰ对的清除率为负值。当水提物Ⅰ的浓度增大时，A322显著增大(P<0.01)，提示该促进作用与水提物Ⅰ的浓度呈正相关。加入水提物Ⅱ后A322显著减小，表明水提物Ⅱ对具有明显的清除作用(P<0.01)，且该作用也随其浓度的增加而显著增大(P<0.01)。, 百拇医药
表1 水提物对
的清除作用(±s,n=5) 试样(ml)A322
清除率(%)对 照
0.521±0.001
0.0
水提物Ⅰ(0.50)
0.586±0.004①
-12.4±0.7
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水提物Ⅰ(1.00)
0.607±0.006①
-16.5±1.1
水提物Ⅱ(0.50)
0.476±0.005①
8.7±0.9
水提物Ⅱ(1.00)
0.438±0.006①
15.9±1.1
①与对照比较P<0.01
2.2 水提物对
生成的抑制作用 用动态方法测得反应的初速率VO(A.min-1)。本实验回归的相关系数在0.9969～0.9992之间(表2)。加入水提物后，体系中产生速率均有显著变化(P<0.01)。加入水提物Ⅰ后，生成速率VO显著增大(P<0.01)，表明水提物Ⅰ不仅不能减缓的生成速率(其抑制率为负值)，反而能加速的生成。且VO加快的程度随其用量增加而增加(P<0.05)。加入水提物Ⅱ后VO值明显减小，提示水提物Ⅱ可显著抑制的生成速率(抑制率为正值)，其用量增大时抑制能力显著增强(P<0.01)。, http://www.100md.com
表2 水提物对
的抑制作用(±s,n=5) 试样(ml)VO(A.min-1)
抑制率(%)对 照
0.0632±0.0001
-
水提物Ⅰ(0.50)
0.0702±0.0002①
, 百拇医药
-11.2±0.4
水提物Ⅰ(1.00)
0.0739±0.0008①
-16.9±1.8
水提物Ⅱ(0.50)
0.0586±0.0009①
8.0±1.5
水提物Ⅱ(1.00)
0.0537±0.0001①
10.2±5.3
①与对照比较P<0.01
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2.3 水提物对.OH的清除作用 在本实验条件下，由A536的测定值观察水提物对.OH的清除效应。测得A未损为0.528±0.001，其它数值见表3。水提物Ⅰ和Ⅱ在60min时对.OH的清除率分别为15.6%和41.7%，表明二者均具有清除.OH的作用，且水提物Ⅱ的清除作用明显大于水提物Ⅰ(P<0.01)。
表3 水提物对.OH的清除作用(
±s,n=5) 试样(ml)A536
, 百拇医药 .OH清除率(%)
对照(损)
0.317±0.001
0.0
水提物Ⅰ
0.350±0.012①
15.6±5.6
水提物Ⅱ
0.405±0.004①
41.7±2.1
①与对照比较P<0.01
, 百拇医药
3 讨论
本文在测定
的生成和清除率时改用了pH8.34的PBS，比文献中的Tris-HCl缓冲液成本低，且A与t之间的直线范围宽。随着自由基研究的不断深入，氧自由基造成的组织损伤已为人们所关注[6]。它能破坏脂类、细胞膜、核酸及染色体，影响蛋白质性质及酶的活性。实验证明，细胞的死亡与
有关，可利用杀死细菌。本文表明未经处理的马齿苋水提物能促进的生成。当机体感染细菌后，若体内不能产生足量的，则不能杀死细菌，故鲜马齿苋常用于治疗痈疖、痢疾等。本实验还发现沸水处理后，马齿苋水提物对和.OH的清除作用显著增强。由于和.OH都是很强的氧化剂，能使许多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，能降低胶原和透明质酸，从而使缺血组织受到损伤。当机体及.OH过多时，会产生大量脂质过氧化物(LPO)，损伤细胞膜，引起高血脂、冠心病等[7]。因沸水处理后的马齿苋能清除及.OH，故可用于防治心血管疾病。, 百拇医药
马齿苋含有多种化学成分，其中主要是三萜类，黄酮类，维生素C，维生素E，多种氨基酸、各种有机酸(如苹果酸、柠檬酸)的钾盐、钙盐及丰富的n-3多价不饱和脂肪酸[8～10]。研究表明[11]，n-3多价不饱和脂肪酸有降血脂作用，对心血管疾病(包括亚洲人的脑血管病)有防治作用。故笔者认为，马齿苋的沸水提物是良好的氧自由基清除剂，因它含有清除氧自由基作用的三萜，黄酮，维生素C，维生素E及n-3多价不饱和脂肪酸。马齿苋在我国资源丰富，且具有多种潜在的药用价值，但目前市场上尚缺乏以马齿苋为原料的制剂，故有待今后大力开发利用。不同处理方法引起的马齿苋水提物对
的作用的差异，也许能解释马齿苋临床使用上的差异，如新鲜草药用于皮肤及肠道感染，沸水处理过的制剂可望用于防治心血管病。中国图书分类号 R282
参考文献
, 百拇医药
[1]湖南中医药研究所.湖南药物志(第二辑).第一版，长沙：湖南人民出版社，1972：90-91
[2]南京药学院《中草药学》编写组.中草药学(中册).第一版，南京：江苏人民出版社，1976：197-198
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[4]邹国林，桂兴芬，钟晓凌，等.一种SOD的测活方法.生物化学与生物物理进展，1986，13(4)：71-73
[5]金鸣，蔡亚欣，李金荣，等.邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由基.生物化学与生物物理进展，1996，23(6)：553-555
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, 百拇医药
[7]陈顺志.过氧化脂质与疾病.锦州医学院学报，1987，8(3)：283
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[9]Simopulos MD. Purslane: A terrestrial source of omega-3 fatty acids. New Engl J Med, 1986,315(13):833
[10]刘宗林.马齿苋药理作用与临床作用.安徽医学，1997，18(4)：57-58
[11]Alexader L, Weber PC. Cardiovascular effects of n-3 fatty acids. New Engl J Med, 1990,318(9):549
收稿日期：1998-09-30, 百拇医药