流感嗜血杆菌耐药监测
作者：陈文昭 刘兴态 陈慧莉 过孝静 刘际芬 潘万德 杨伟男
单位：华西医科大学附属第一医院检验科(成都 610041)
关键词：流感嗜血杆菌；耐药性
华西医学WEST CHINA MEDICAL JOURNAL1999年 第14卷 第2期 Vol 摘要：本文检测了354例我校附二院儿科门诊发烧、咳嗽病人流感嗜血杆菌(H.Influenzae)感染情况；对培养阳性者进行β-内酰胺酶试验和药敏试验。结果显示：有237例检出流感嗜血杆菌，检出率为66.9%(237/354)，其中β-内酰胺酶阳性者27株，阳性率为11.4%(27/237)；对氨苄青霉素耐药率(Ampicillin)为13.1%(31/237)，对希克劳(Cefaclor)耐药率0(0/237)；同时发现β-内酰胺酶阳性者均对氨苄青霉素耐药，耐药率为100%(27/27)；本文仅检测出2株对希克劳中敏。
, 百拇医药
[中图分类号]R517.9 [文献标识码]A
[文章编号]1002-0179(1999)02-0149-02
Surveillance on Drug-Resistant Situation of Haemophilus.Influenzae
CHEN Wen-zhao,LIU Xing-tai,CHEN Hui-li,et al.
Department of Laboratory Medicine,First University Hospital,West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
Abstract:354 samples of outpatients and hospitalized patients with symptoms of fever and cough were cultured for H.Influenzae in the second hospital affiliated to West China University of Medical Sciences.β-lactamase and drug-susceptibility testing were done on the positve culture.The results demonstrated that H.influenzae was found in 237 samples(66.9%);among which 27(11.4%)strains of H.influenzae were positive in β-lactamase testing;About 13.1 percent of strains(31/237) were resistant to ampicillin;No strain was resistant to cefaclor and only 2 strains were moderately susceptible to cefaclor.
, 百拇医药
Key words: haemophilus.influenzae,drug-resisrance
(Received:1998-12-15)
流感嗜血杆菌(H.Influenzae)是一种只侵犯人类的苛养革兰氏阴性杆菌，主要存在于上呼吸道中，也可侵入血液继发多种感染性疾病，如肺炎、关节炎、蜂窝组织炎、心包炎、鼻窦炎和结膜炎等[1～3，6]。在儿科病例中尤为常见，是儿童呼吸系统感染的一种主要病原之一，也被认为是学龄前儿童中继肺炎链球菌之后造成急性中耳炎的第二种病原菌[4]。60和70年代，氨苄青霉素(Ampicillin)为治疗流感嗜血杆菌感染的首选药物[5]。但是近20年来因产β-内酰胺酶菌株的不断增加，氨苄青霉素耐药菌株(Ampicillin Resistant H.Influenzae)随之出现，并逐渐增加[7]，给临床治疗带来了一定的困难，因此在全球范围内引起了广泛关注。我们从我校附二院儿科门诊354例病人中分离到237株流感嗜血杆菌，现将其耐药情况作一报道：
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 病人选择 为1998年1月13日至1998年6月26日期间因发烧、咳嗽且未服用抗生素来我校附二院就诊的儿科病人，其中男178人，平均年龄4.2岁(1～14岁)；女176人，平均年龄4.4岁(1～11岁)，均在其监护人带领下来就诊，且在标本采集时积极配合。
1.2 转运培养基(CULTURETE 4360210) 磷酸甘油酸钠1%，巯乙酸钠0.1%，二水氯化钙0.01%及水，每个中装有上述混合液0.5ml(由BD公司生产)。
1.3 巧克力培养基(Chocolatic II Agar W/Bacitracin 96271) 胰化酪蛋白7.5g/l，精制蛋白胨7.5g/l，谷物淀粉1.0g/l，磷酸氢二钾4.0g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，氯化钠5.0g/l，琼脂12g/l，浓缩Isovilatex 10.0ml/l，杆菌肽16500u/l。
, http://www.100md.com
1.4 M-H培养基(Mueller Hinton II Agar 21275) 牛肉浸液2.0g/l，酸性酪蛋白水解物17.5g/l，淀粉1.5g/l，琼脂17.0g/l。
1.5 HTM培养基(Haemophilus Test Medium Agar 21992) 牛肉浸液2.0g/l，酸性酪蛋白水解物17.5g/l，淀粉1.5g/l，琼脂17.0g/l，酵母浸液5.0g/l，正铁血红素15.0mg/l，辅酶I 15.0mg/l。(上述培养基均由BD公司生产)
1.6 XV X V因子纸片及β-内酰胺酶检测纸片均由BD公司生产。
1.7 质控菌株 ATCC49247及ATCC49766流感嗜血杆菌。
1.8 菌株的分离鉴定 用转运培养基取病人咽部分泌物立即接种于巧克力培养基上(床旁接种)，置35°C 5%CO2孵箱24h。挑取光滑、湿润、边缘整齐、灰白的可疑菌落涂片、革兰氏染色，镜检可见革兰氏阴性多形性杆菌时做进一步鉴定试验：取3～5个可疑菌落均匀涂在MH培养基上，如图所示贴上XV X V因子纸片，置35°C 5%CO2孵箱24h，通过因子纸片周围细菌生长情况作出鉴定，依据表1筛选出流感嗜血杆菌：
, 百拇医药
表1.菌株的分离鉴定 菌 名
沿试条周围生长
XV
X
V
流感嗜血杆菌
+
-
-
副流感嗜血杆菌
+
-
+
, 百拇医药
+示生长 -示不生长
1.9 β-内酰胺酶试验 用色原底物法(Cefinase Disc；BBL Microbiology Systems)将纸片用无菌生理盐水浸湿，涂上部分菌落，观察颜色改变：1分钟内纸片由黄色变为红色表示β-内酰胺酶阳性；不变色为阴性。
1.10 药敏试验及其质量控制 将分离出的菌株用氨苄青霉素(Ampicillin)及希克劳(Cefaclor)以标准K—B法进行药敏试验，并以ATCC49247及ATCC49766流感嗜血杆菌进行质量控制。
2 结果
2.1 质控菌株的判定，如表2所示。
表2.质控菌株的判定 菌 株
抗菌药物
, 百拇医药
应在范围
(Φmm)
ATCC49247
氨苄青
13～21
ATCC49766
希克劳
25～31
2.2 分离菌株药敏判定，如表3所示：表3.分离菌株药敏判定 抗菌药物
敏感度
S
I
, 百拇医药
R
氨苄青
>22
19～21
<18
希克劳
>20
17～19
<16
2.3 检测咽部分泌物354份，共检出流感嗜血杆菌273株，检出率为66.9%(237/354)，其中β-内酰胺酶阳性27株，阳性率为11.4%(27/237)；药敏结果见表4：表4.药敏结果 抗菌药物
敏感株数
, 百拇医药
(%)
中敏株数
(%)
耐药株数
(%)
氨苄青
191(80.6)
15(6.5)
31(13.1)
希克劳
235(99.2)
2(1.2)
0(0)
, 百拇医药
2.4 β-内酰胺酶试验与药敏试验比较如表5所示：表5.β-内酰胺酶试验与药敏试验比较 β-内酰胺酶试验(株数)
其中抗菌药耐药株数(%)
氨苄青
希克劳
阳性(27)
27(100)
0(0)
阴性(210)
4(1.9)
0(0)
3 讨论
, http://www.100md.com
流感嗜血杆菌为临床常见病原菌，造成许多急性感染；由于耐药菌株的出现给临床治疗带来了一定的困难，为此，对其耐药情况进行监测、为临床提供恰当的抗生素就显得尤为必要。本文在354份标本中共分离到273株此菌，阳性率为66.9%，远高于杜小玲、王清淘等报道的检出率(16.8%)[1]，其原因可能如下：①病人的准备：这354人均有发烧咳嗽等上呼吸道感染征象，且未服用抗生素，避免了因抗生素作用而造成假阴性的可能；②标本采集时维持一定的湿度，并且及时接种，不致于使其死亡 ；③营养丰富的培养基：本室所使用的培养基均由BD公司提供，里面含有丰富的营养成分，包括X及V因子，利于其生长；因此为了提高流感嗜血杆菌的检出率，建议各科室应着重考虑上述各因素的影响，尽量减少这些影响因素。
氨苄青霉素于70年代取代氯霉素和四环素成为治疗流感嗜血杆菌的首选药物。1974年自脑脊液中分离出产TEM—1β内酰胺酶的氨苄青霉素耐药菌株，不久又分离出产乙酰转移酶的氯霉素耐药菌株,继之又获得产β-内酰胺酶及乙酰转移酶的菌株[5]。自70年代中期至80年代中期呈普遍上升趋势，但在80年代后期及90年代初则上升减缓。本室分离到的耐氨苄青霉素菌株占13.1%，与泰国相当(14.6%)，高于菲律宾(6.3%)而低于台湾(35.7%)[5]。由表3可知：β-内酰胺酶阳性的菌株均对氨苄青霉素耐药(耐药率为100%)，而在210株β-内酰胺酶阴性者中仅有4株耐药(耐药率为1.9%)，说明产β-内酰胺酶为流感嗜血杆菌最主要的耐药机制。有学者研究表明：耐药菌株，尤其是B型菌株90%以上产TEM-1酶(为革兰氏阴性杆菌中最常见的质粒介导的β-内酰胺酶)；8%产ROB-1酶(一种等电点为8.1的类TEM酶，亦为质粒介导)，极个别菌株的耐药与β-内酰胺酶无关，为固有耐药，系青霉素结合蛋白(PBPS)的改变以致氨苄青霉素与PBPS结合障碍，细菌可在氨苄青霉素存在的情况下继续生长繁殖[5，6]。因此对临床分离菌株作β-内酰胺酶的检测对判断其耐药情况有重要意义。
, http://www.100md.com
由表4可知：除2株中敏外，所有的菌株均对希克劳敏感，无一株耐药(耐药率为0)，与Nissinea A等报道的数据相当(0.6%)[4]，并且在27株β-内酰胺酶阳性者中仅有两株中敏，其它均敏感，这说明耐希克劳机制与β-内酰胺酶无关，同时对临床分离出耐氨苄青霉素的菌株可选用希克劳进行治疗。但是在做此试验时应注意两点：一、其敏感与耐药的临界点很近，判读时应慎重，并结合质控菌株综合考虑；二、抑菌环大小与培养基成分及菌量多少有关，应对其严格控制。
由本文结果可知：目前产β-内酰胺酶的菌株维持在一个相对稳定的水平(10%左右)，且这些菌株均对氨苄青霉素耐药，而对新型的头孢类抗生素如希克劳来说绝大多数敏感，尚未出现耐希克劳菌株。
从70年代至今，20多年中流感嗜血杆菌的耐药谱发生明显变化，主要特点就是各种新的耐药菌株的出现，密切关注其耐药趋势、研究其耐药机制是较为迫切的任务。
, 百拇医药 本文由纽约中华医学基金会(CMB 92-558)资助
4 参考文献
1 杜小玲，王清涛:临床检验杂志1996；14(4)：205。
2 徐红：中华医学检验杂志1987；10：365。
3 Sottenk Fo，et al. J Clin Microbiol 1984；20：815.
4 Nessiena A，et al . Scand J Infect Dis. 1995；27：51～61.
5 李光辉:国外医学内科学分册1996；7：288～290。
6 Scriver SR，et al . Antimicrobiol Agents Chemother . 1994；38(7)：1678～80.
7 Hussey G，et al . J Antimicrob Chemother. 1994；34：1031～36.
(收稿日期：1998-12-15), 百拇医药
单位：华西医科大学附属第一医院检验科(成都 610041)
关键词：流感嗜血杆菌；耐药性
华西医学WEST CHINA MEDICAL JOURNAL1999年 第14卷 第2期 Vol 摘要：本文检测了354例我校附二院儿科门诊发烧、咳嗽病人流感嗜血杆菌(H.Influenzae)感染情况；对培养阳性者进行β-内酰胺酶试验和药敏试验。结果显示：有237例检出流感嗜血杆菌，检出率为66.9%(237/354)，其中β-内酰胺酶阳性者27株，阳性率为11.4%(27/237)；对氨苄青霉素耐药率(Ampicillin)为13.1%(31/237)，对希克劳(Cefaclor)耐药率0(0/237)；同时发现β-内酰胺酶阳性者均对氨苄青霉素耐药，耐药率为100%(27/27)；本文仅检测出2株对希克劳中敏。
, 百拇医药
[中图分类号]R517.9 [文献标识码]A
[文章编号]1002-0179(1999)02-0149-02
Surveillance on Drug-Resistant Situation of Haemophilus.Influenzae
CHEN Wen-zhao,LIU Xing-tai,CHEN Hui-li,et al.
Department of Laboratory Medicine,First University Hospital,West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
Abstract:354 samples of outpatients and hospitalized patients with symptoms of fever and cough were cultured for H.Influenzae in the second hospital affiliated to West China University of Medical Sciences.β-lactamase and drug-susceptibility testing were done on the positve culture.The results demonstrated that H.influenzae was found in 237 samples(66.9%);among which 27(11.4%)strains of H.influenzae were positive in β-lactamase testing;About 13.1 percent of strains(31/237) were resistant to ampicillin;No strain was resistant to cefaclor and only 2 strains were moderately susceptible to cefaclor.
, 百拇医药
Key words: haemophilus.influenzae,drug-resisrance
(Received:1998-12-15)
流感嗜血杆菌(H.Influenzae)是一种只侵犯人类的苛养革兰氏阴性杆菌，主要存在于上呼吸道中，也可侵入血液继发多种感染性疾病，如肺炎、关节炎、蜂窝组织炎、心包炎、鼻窦炎和结膜炎等[1～3，6]。在儿科病例中尤为常见，是儿童呼吸系统感染的一种主要病原之一，也被认为是学龄前儿童中继肺炎链球菌之后造成急性中耳炎的第二种病原菌[4]。60和70年代，氨苄青霉素(Ampicillin)为治疗流感嗜血杆菌感染的首选药物[5]。但是近20年来因产β-内酰胺酶菌株的不断增加，氨苄青霉素耐药菌株(Ampicillin Resistant H.Influenzae)随之出现，并逐渐增加[7]，给临床治疗带来了一定的困难，因此在全球范围内引起了广泛关注。我们从我校附二院儿科门诊354例病人中分离到237株流感嗜血杆菌，现将其耐药情况作一报道：
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 病人选择 为1998年1月13日至1998年6月26日期间因发烧、咳嗽且未服用抗生素来我校附二院就诊的儿科病人，其中男178人，平均年龄4.2岁(1～14岁)；女176人，平均年龄4.4岁(1～11岁)，均在其监护人带领下来就诊，且在标本采集时积极配合。
1.2 转运培养基(CULTURETE 4360210) 磷酸甘油酸钠1%，巯乙酸钠0.1%，二水氯化钙0.01%及水，每个中装有上述混合液0.5ml(由BD公司生产)。
1.3 巧克力培养基(Chocolatic II Agar W/Bacitracin 96271) 胰化酪蛋白7.5g/l，精制蛋白胨7.5g/l，谷物淀粉1.0g/l，磷酸氢二钾4.0g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，氯化钠5.0g/l，琼脂12g/l，浓缩Isovilatex 10.0ml/l，杆菌肽16500u/l。
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1.4 M-H培养基(Mueller Hinton II Agar 21275) 牛肉浸液2.0g/l，酸性酪蛋白水解物17.5g/l，淀粉1.5g/l，琼脂17.0g/l。
1.5 HTM培养基(Haemophilus Test Medium Agar 21992) 牛肉浸液2.0g/l，酸性酪蛋白水解物17.5g/l，淀粉1.5g/l，琼脂17.0g/l，酵母浸液5.0g/l，正铁血红素15.0mg/l，辅酶I 15.0mg/l。(上述培养基均由BD公司生产)
1.6 XV X V因子纸片及β-内酰胺酶检测纸片均由BD公司生产。
1.7 质控菌株 ATCC49247及ATCC49766流感嗜血杆菌。
1.8 菌株的分离鉴定 用转运培养基取病人咽部分泌物立即接种于巧克力培养基上(床旁接种)，置35°C 5%CO2孵箱24h。挑取光滑、湿润、边缘整齐、灰白的可疑菌落涂片、革兰氏染色，镜检可见革兰氏阴性多形性杆菌时做进一步鉴定试验：取3～5个可疑菌落均匀涂在MH培养基上，如图所示贴上XV X V因子纸片，置35°C 5%CO2孵箱24h，通过因子纸片周围细菌生长情况作出鉴定，依据表1筛选出流感嗜血杆菌：
, 百拇医药
表1.菌株的分离鉴定 菌 名
沿试条周围生长
XV
X
V
流感嗜血杆菌
+
-
-
副流感嗜血杆菌
+
-
+
, 百拇医药
+示生长 -示不生长
1.9 β-内酰胺酶试验 用色原底物法(Cefinase Disc；BBL Microbiology Systems)将纸片用无菌生理盐水浸湿，涂上部分菌落，观察颜色改变：1分钟内纸片由黄色变为红色表示β-内酰胺酶阳性；不变色为阴性。
1.10 药敏试验及其质量控制 将分离出的菌株用氨苄青霉素(Ampicillin)及希克劳(Cefaclor)以标准K—B法进行药敏试验，并以ATCC49247及ATCC49766流感嗜血杆菌进行质量控制。
2 结果
2.1 质控菌株的判定，如表2所示。
表2.质控菌株的判定 菌 株
抗菌药物
, 百拇医药
应在范围
(Φmm)
ATCC49247
氨苄青
13～21
ATCC49766
希克劳
25～31
2.2 分离菌株药敏判定，如表3所示：表3.分离菌株药敏判定 抗菌药物
敏感度
S
I
, 百拇医药
R
氨苄青
>22
19～21
<18
希克劳
>20
17～19
<16
2.3 检测咽部分泌物354份，共检出流感嗜血杆菌273株，检出率为66.9%(237/354)，其中β-内酰胺酶阳性27株，阳性率为11.4%(27/237)；药敏结果见表4：表4.药敏结果 抗菌药物
敏感株数
, 百拇医药
(%)
中敏株数
(%)
耐药株数
(%)
氨苄青
191(80.6)
15(6.5)
31(13.1)
希克劳
235(99.2)
2(1.2)
0(0)
, 百拇医药
2.4 β-内酰胺酶试验与药敏试验比较如表5所示：表5.β-内酰胺酶试验与药敏试验比较 β-内酰胺酶试验(株数)
其中抗菌药耐药株数(%)
氨苄青
希克劳
阳性(27)
27(100)
0(0)
阴性(210)
4(1.9)
0(0)
3 讨论
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流感嗜血杆菌为临床常见病原菌，造成许多急性感染；由于耐药菌株的出现给临床治疗带来了一定的困难，为此，对其耐药情况进行监测、为临床提供恰当的抗生素就显得尤为必要。本文在354份标本中共分离到273株此菌，阳性率为66.9%，远高于杜小玲、王清淘等报道的检出率(16.8%)[1]，其原因可能如下：①病人的准备：这354人均有发烧咳嗽等上呼吸道感染征象，且未服用抗生素，避免了因抗生素作用而造成假阴性的可能；②标本采集时维持一定的湿度，并且及时接种，不致于使其死亡 ；③营养丰富的培养基：本室所使用的培养基均由BD公司提供，里面含有丰富的营养成分，包括X及V因子，利于其生长；因此为了提高流感嗜血杆菌的检出率，建议各科室应着重考虑上述各因素的影响，尽量减少这些影响因素。
氨苄青霉素于70年代取代氯霉素和四环素成为治疗流感嗜血杆菌的首选药物。1974年自脑脊液中分离出产TEM—1β内酰胺酶的氨苄青霉素耐药菌株，不久又分离出产乙酰转移酶的氯霉素耐药菌株,继之又获得产β-内酰胺酶及乙酰转移酶的菌株[5]。自70年代中期至80年代中期呈普遍上升趋势，但在80年代后期及90年代初则上升减缓。本室分离到的耐氨苄青霉素菌株占13.1%，与泰国相当(14.6%)，高于菲律宾(6.3%)而低于台湾(35.7%)[5]。由表3可知：β-内酰胺酶阳性的菌株均对氨苄青霉素耐药(耐药率为100%)，而在210株β-内酰胺酶阴性者中仅有4株耐药(耐药率为1.9%)，说明产β-内酰胺酶为流感嗜血杆菌最主要的耐药机制。有学者研究表明：耐药菌株，尤其是B型菌株90%以上产TEM-1酶(为革兰氏阴性杆菌中最常见的质粒介导的β-内酰胺酶)；8%产ROB-1酶(一种等电点为8.1的类TEM酶，亦为质粒介导)，极个别菌株的耐药与β-内酰胺酶无关，为固有耐药，系青霉素结合蛋白(PBPS)的改变以致氨苄青霉素与PBPS结合障碍，细菌可在氨苄青霉素存在的情况下继续生长繁殖[5，6]。因此对临床分离菌株作β-内酰胺酶的检测对判断其耐药情况有重要意义。
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由表4可知：除2株中敏外，所有的菌株均对希克劳敏感，无一株耐药(耐药率为0)，与Nissinea A等报道的数据相当(0.6%)[4]，并且在27株β-内酰胺酶阳性者中仅有两株中敏，其它均敏感，这说明耐希克劳机制与β-内酰胺酶无关，同时对临床分离出耐氨苄青霉素的菌株可选用希克劳进行治疗。但是在做此试验时应注意两点：一、其敏感与耐药的临界点很近，判读时应慎重，并结合质控菌株综合考虑；二、抑菌环大小与培养基成分及菌量多少有关，应对其严格控制。
由本文结果可知：目前产β-内酰胺酶的菌株维持在一个相对稳定的水平(10%左右)，且这些菌株均对氨苄青霉素耐药，而对新型的头孢类抗生素如希克劳来说绝大多数敏感，尚未出现耐希克劳菌株。
从70年代至今，20多年中流感嗜血杆菌的耐药谱发生明显变化，主要特点就是各种新的耐药菌株的出现，密切关注其耐药趋势、研究其耐药机制是较为迫切的任务。
, 百拇医药 本文由纽约中华医学基金会(CMB 92-558)资助
4 参考文献
1 杜小玲，王清涛:临床检验杂志1996；14(4)：205。
2 徐红：中华医学检验杂志1987；10：365。
3 Sottenk Fo，et al. J Clin Microbiol 1984；20：815.
4 Nessiena A，et al . Scand J Infect Dis. 1995；27：51～61.
5 李光辉:国外医学内科学分册1996；7：288～290。
6 Scriver SR，et al . Antimicrobiol Agents Chemother . 1994；38(7)：1678～80.
7 Hussey G，et al . J Antimicrob Chemother. 1994；34：1031～36.
(收稿日期：1998-12-15), 百拇医药