流式细胞术检测HIE后脑皮质细胞凋亡
作者：刘晓平 王晓蕾 刘凯 唐芳 张峻梅 梁河涛
单位：四川省成都市第三人民医院(成都 610041)
关键词：缺氧缺血性脑病(HIE)；细胞凋亡；流式细胞术(FCM)
华西医学WEST CHINA MEDICAL JOURNAL1999年 第14卷 第2期 Vol 摘要：目的：探讨脑皮质细胞凋亡在新生猪缺氧缺血性脑病(HIE)发生与发展。方法：应用流式细胞术(FCM)、DNA凝胶电泳对新生猪HIE脑皮质细胞凋亡进行定量分析。结果：缺氧缺血后72小时新生猪左额顶大脑皮质细胞凋亡率较对照组明显增加(n=15,12;main±s%=26.18±16.35，3.23±2.93；P<0.0001)；DNA凝胶电泳显示明显“DNA Ladder”。结论：脑皮质细胞凋亡在患HIE新生动物的迟发性神经细胞损伤中占有重要地位。
[中图分类号]R743 [文献标识码]A
, 百拇医药
[文章编号]1002-0179(1999)02-0144-03
Study on Apoptosis of Cerebral Cells Following HIE by Using Flow Cytometry
LIU Xiao-ping,WANG Xiao-lei,LIU Kai,et al.The third Hospital of Chengdu,Sichuan,610041
Abstract:Objective:To determine whether there is apoptosis in cerebral cortical cells of the neonate pigs with hypoxia-ischemia(HI)injury.Methods:We have abserved the “DNA Ladder”by gel electrophoresis and the apoptosis rate of cerebral cortical cells via flow cytometry.Results:The results showed the apoptosis ratio of cerebral cortical cells in left frontotemporal corticocerebrum 72hr post asphyxia was higher than control group(n=15,12;mean±s%)=26.18±16.35，3.23±2.93；P<0.0001).Conclusion:It suggest that apoptosis of cerbral cortical cells plays an important role in the delayed cerebral damage of the neonates post HI.
, 百拇医药
Key words:hypoxia-ischemia,apoptosis,flow cytometry
(Received:1999-01-09)
围产期窒息被认为是造成儿童永久性神经损伤的重要原因之一。传统观念一直认为缺氧缺血性脑病(HIE)后的损伤，包括神经元与胶质细胞的死亡是由于急性能量衰竭造成的细胞坏死(necrotis)，近来研究发现细胞凋亡(Apoptosis)是神经元死亡的另一种形式〔1〕，这为探讨HIE后神经元损伤的病理生理机制，以及损伤后的治疗开辟了新的途径。本文应用流式细胞术(FCM)、DNA凝胶电泳方法，观察新生猪HIE后脑皮质细胞凋亡，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象 健康新生猪27只，雌雄不限，日龄≤3天，体重530～1010g，进食，反应好，外观无异常。每批按同窝随机分成两组，其中试验组15只，对照组12只，两组体重无统计学差异(P>0.05)。
, 百拇医药
1.2 研究方法
1.2.1 新生猪HIE模型制作〔2〕 结扎新生猪左侧颈总动脉，将其置于有持续低流量输入含8%氧气和92%氮气混合气体的有机玻璃箱内，作用2hr后取出新生猪即为HIE模型。
1.2.2 脑细胞悬液制备 HIE模型新生猪喂养72hr后断头处死，迅速取出全脑剥离左额顶部脑皮质置于70%乙醇固定。将固定的脑组织剪碎至小块，用组织匀浆器研磨，300目不锈钢网过滤，PBS离心洗涤3次，500rpm，每次2min,70%乙醇固定，4℃保存备检。
1.2.3 FCM 按Gong等〔3〕的方法，略加修饰。细胞用碘化丙啶(PI)进行染色，然后用FACScan流式细胞仪检测。根据DNA分布直立图各时相定量凋亡细胞百分率。
1.2.4 DNA凝胶电泳 按Kamesaki等〔4〕方法，提取DNA后，1.8%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭1.3μmol/L染色拍照，观察“DNA Ladder”。
, 百拇医药
1.2.5 测量资料分析 采用配对显著性t检验。
2 结果
2.1 FCM测定 凋亡细胞内的小分子DNA丢失，因此在DNA含量分布直方图上出现一个“亚G1峰”，峰的大小即代表凋亡细胞的多少(见图1、2)。结果见表1。
图1.正常猪脑细胞 图2.HIE猪脑细胞
表1.脑皮质细胞凋亡
例数
Sub-G1
x±SD(%)
, 百拇医药
P
试验组
15
26.18±16.35
<0.0001
对照组
12
3.23±2.93
2.2 DNA凝胶电泳分析 凝胶电泳结果显示明显“Ladder”带型，比较分子量大小，提示DNA断裂主要发生在核小体连接处DNA，与FCM结果相吻合(见图3)。
图3.M：DNA标准分子；
, 百拇医药
1：正常脑细胞DNA；
2，3：HIE脑细胞DNA。
3 讨论
对HIE发病机理的研究，最早着重于能量代谢障碍。缺氧缺血首先影响神经细胞能量代谢，包括糖、脂及和蛋白质的代谢障碍，同时使氧自由基大量生成，加重了神经细胞的代谢障碍和结构改变，细胞内外离子平衡失调，发生渗透性肿胀，严重时导致细胞溶解坏死。神经细胞坏死的第二阶段发生在几小时之后，称为继发性细胞死亡。现已证实，此继发性死亡实质上就是细胞凋亡〔1〕。通常细胞凋亡为两组过程，由于受到各种刺激，细胞作出反应进入凋亡程序，这一期细胞被认为处于细胞凋亡的“潜伏期”，因为它们还可以完全恢复到健康状态，这一期持续时间变化非常显著，可由数小时至数天。继而，细胞进入凋亡“活动期”，细胞形态和生理过程发生一系列显著变化。其形态学特点是核染色质在核周边凝集，核膜与胞浆呈囊状突起，最后出现凋亡小体及核碎裂。由于失去细胞与细胞间的相互联系而与邻近细胞分离，随后细胞释放表面信号分子并被吞噬细胞识别和吞噬，因此不损伤周围细胞。近来，时有报道HIE后神经细胞死亡中存在凋亡，1994年MacWanus〔5〕最先报道了成熟动物脑缺血发生凋亡现象，光镜、电镜下均观察到DNA片段及特征性的凋亡细胞形态。1995年Hill〔6〕首次证实在新生鼠HIE模型的脑组织中有断裂DNA细胞，提示凋亡细胞的存在。蒋犁等〔7〕用组织切片原位末端标记技术(TUNEL)证实缺氧缺血后18hr新生大鼠脑皮质细胞出现明显凋亡现象。上述对脑细胞凋亡的定性研究证实了凋亡机制在HIE脑损伤中的作用。
, 百拇医药
通过FCM分析，可见凋亡细胞出现在直方图亚二倍体峰位置，并与细胞主峰G0/G1分界清楚，可定量凋亡占整个细胞群百分比。本研究发现，新生猪缺氧缺血72hr后，脑皮质细胞凋亡较正常对照显著性升高(P<0.0001)，DNA凝胶电泳亦证实“DNA ladder”的存在，表明损伤后72hr脑细胞凋亡的客观存在，提示凋亡的异常启动在新生动物HIE的迟发性脑损伤中占有重要位置。以往报道集中证实“DNA Ladder”的存在，本文在此基础上应用FCM定量分析HIE损伤后脑细胞凋亡的程度，为更深入研究脑细胞凋亡及其相关理论提供了依据。
4 参考文献
1 Beilharz EJ,Williams CE,Draganow M,et al. Mechanism of delayed cell death following hypoxic-ischemic injury in the immatare rat :evidence for apoptosis during selective neuronal loss Mol Brain Res 1995;29(1):1～14.
, http://www.100md.com
2 Rice JE,Vammucci RC,Bridrly JB,The influcence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat Ann Neurol,1981;9:131～141.
3 Gong J,Li X,DanzynKiewicz Z.Different patterns of apoptosis of H1-60 cells induced by cycloheximide and camptothecin.J cell Physiol,1993;157:263～70.
4 Kamesakis ,Kamesaki H,Jorgensen TJ,et al.Bcl-2 protein inhibits etoposide-induced apoptosis through its effects on events subsequent to topoisomerase II-induced DNA strand breaks and repair.Cancer Res,1993;53:4251～6.
, 百拇医药
5 MacManus JP,Hill IE,Hnang ZG,et al.DNA damage consistent with apoptosis in transient focal ishemic neocrotex.Neuroreport,1994;5:493.
6 Hill IE,MacManus JP,Rasquinha J,et al.DNA fragmentation indicative of apoptosis following unilateral cerebral hypoxia-ischemia int he neonatal rat Brain Res 1995;676;393～403.
7 蒋犁，沟云珍，俞咏华，等：缺氧缺血对新生大鼠脑皮质细胞凋亡的影响。新生儿科杂志1998；13(3)：117～119。
(收稿日期：1999-01-09), http://www.100md.com
单位：四川省成都市第三人民医院(成都 610041)
关键词：缺氧缺血性脑病(HIE)；细胞凋亡；流式细胞术(FCM)
华西医学WEST CHINA MEDICAL JOURNAL1999年 第14卷 第2期 Vol 摘要：目的：探讨脑皮质细胞凋亡在新生猪缺氧缺血性脑病(HIE)发生与发展。方法：应用流式细胞术(FCM)、DNA凝胶电泳对新生猪HIE脑皮质细胞凋亡进行定量分析。结果：缺氧缺血后72小时新生猪左额顶大脑皮质细胞凋亡率较对照组明显增加(n=15,12;main±s%=26.18±16.35，3.23±2.93；P<0.0001)；DNA凝胶电泳显示明显“DNA Ladder”。结论：脑皮质细胞凋亡在患HIE新生动物的迟发性神经细胞损伤中占有重要地位。
[中图分类号]R743 [文献标识码]A
, 百拇医药
[文章编号]1002-0179(1999)02-0144-03
Study on Apoptosis of Cerebral Cells Following HIE by Using Flow Cytometry
LIU Xiao-ping,WANG Xiao-lei,LIU Kai,et al.The third Hospital of Chengdu,Sichuan,610041
Abstract:Objective:To determine whether there is apoptosis in cerebral cortical cells of the neonate pigs with hypoxia-ischemia(HI)injury.Methods:We have abserved the “DNA Ladder”by gel electrophoresis and the apoptosis rate of cerebral cortical cells via flow cytometry.Results:The results showed the apoptosis ratio of cerebral cortical cells in left frontotemporal corticocerebrum 72hr post asphyxia was higher than control group(n=15,12;mean±s%)=26.18±16.35，3.23±2.93；P<0.0001).Conclusion:It suggest that apoptosis of cerbral cortical cells plays an important role in the delayed cerebral damage of the neonates post HI.
, 百拇医药
Key words:hypoxia-ischemia,apoptosis,flow cytometry
(Received:1999-01-09)
围产期窒息被认为是造成儿童永久性神经损伤的重要原因之一。传统观念一直认为缺氧缺血性脑病(HIE)后的损伤，包括神经元与胶质细胞的死亡是由于急性能量衰竭造成的细胞坏死(necrotis)，近来研究发现细胞凋亡(Apoptosis)是神经元死亡的另一种形式〔1〕，这为探讨HIE后神经元损伤的病理生理机制，以及损伤后的治疗开辟了新的途径。本文应用流式细胞术(FCM)、DNA凝胶电泳方法，观察新生猪HIE后脑皮质细胞凋亡，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象 健康新生猪27只，雌雄不限，日龄≤3天，体重530～1010g，进食，反应好，外观无异常。每批按同窝随机分成两组，其中试验组15只，对照组12只，两组体重无统计学差异(P>0.05)。
, 百拇医药
1.2 研究方法
1.2.1 新生猪HIE模型制作〔2〕 结扎新生猪左侧颈总动脉，将其置于有持续低流量输入含8%氧气和92%氮气混合气体的有机玻璃箱内，作用2hr后取出新生猪即为HIE模型。
1.2.2 脑细胞悬液制备 HIE模型新生猪喂养72hr后断头处死，迅速取出全脑剥离左额顶部脑皮质置于70%乙醇固定。将固定的脑组织剪碎至小块，用组织匀浆器研磨，300目不锈钢网过滤，PBS离心洗涤3次，500rpm，每次2min,70%乙醇固定，4℃保存备检。
1.2.3 FCM 按Gong等〔3〕的方法，略加修饰。细胞用碘化丙啶(PI)进行染色，然后用FACScan流式细胞仪检测。根据DNA分布直立图各时相定量凋亡细胞百分率。
1.2.4 DNA凝胶电泳 按Kamesaki等〔4〕方法，提取DNA后，1.8%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭1.3μmol/L染色拍照，观察“DNA Ladder”。
, 百拇医药
1.2.5 测量资料分析 采用配对显著性t检验。
2 结果
2.1 FCM测定 凋亡细胞内的小分子DNA丢失，因此在DNA含量分布直方图上出现一个“亚G1峰”，峰的大小即代表凋亡细胞的多少(见图1、2)。结果见表1。
图1.正常猪脑细胞 图2.HIE猪脑细胞
表1.脑皮质细胞凋亡
例数
Sub-G1
x±SD(%)
, 百拇医药
P
试验组
15
26.18±16.35
<0.0001
对照组
12
3.23±2.93
2.2 DNA凝胶电泳分析 凝胶电泳结果显示明显“Ladder”带型，比较分子量大小，提示DNA断裂主要发生在核小体连接处DNA，与FCM结果相吻合(见图3)。
图3.M：DNA标准分子；
, 百拇医药
1：正常脑细胞DNA；
2，3：HIE脑细胞DNA。
3 讨论
对HIE发病机理的研究，最早着重于能量代谢障碍。缺氧缺血首先影响神经细胞能量代谢，包括糖、脂及和蛋白质的代谢障碍，同时使氧自由基大量生成，加重了神经细胞的代谢障碍和结构改变，细胞内外离子平衡失调，发生渗透性肿胀，严重时导致细胞溶解坏死。神经细胞坏死的第二阶段发生在几小时之后，称为继发性细胞死亡。现已证实，此继发性死亡实质上就是细胞凋亡〔1〕。通常细胞凋亡为两组过程，由于受到各种刺激，细胞作出反应进入凋亡程序，这一期细胞被认为处于细胞凋亡的“潜伏期”，因为它们还可以完全恢复到健康状态，这一期持续时间变化非常显著，可由数小时至数天。继而，细胞进入凋亡“活动期”，细胞形态和生理过程发生一系列显著变化。其形态学特点是核染色质在核周边凝集，核膜与胞浆呈囊状突起，最后出现凋亡小体及核碎裂。由于失去细胞与细胞间的相互联系而与邻近细胞分离，随后细胞释放表面信号分子并被吞噬细胞识别和吞噬，因此不损伤周围细胞。近来，时有报道HIE后神经细胞死亡中存在凋亡，1994年MacWanus〔5〕最先报道了成熟动物脑缺血发生凋亡现象，光镜、电镜下均观察到DNA片段及特征性的凋亡细胞形态。1995年Hill〔6〕首次证实在新生鼠HIE模型的脑组织中有断裂DNA细胞，提示凋亡细胞的存在。蒋犁等〔7〕用组织切片原位末端标记技术(TUNEL)证实缺氧缺血后18hr新生大鼠脑皮质细胞出现明显凋亡现象。上述对脑细胞凋亡的定性研究证实了凋亡机制在HIE脑损伤中的作用。
, 百拇医药
通过FCM分析，可见凋亡细胞出现在直方图亚二倍体峰位置，并与细胞主峰G0/G1分界清楚，可定量凋亡占整个细胞群百分比。本研究发现，新生猪缺氧缺血72hr后，脑皮质细胞凋亡较正常对照显著性升高(P<0.0001)，DNA凝胶电泳亦证实“DNA ladder”的存在，表明损伤后72hr脑细胞凋亡的客观存在，提示凋亡的异常启动在新生动物HIE的迟发性脑损伤中占有重要位置。以往报道集中证实“DNA Ladder”的存在，本文在此基础上应用FCM定量分析HIE损伤后脑细胞凋亡的程度，为更深入研究脑细胞凋亡及其相关理论提供了依据。
4 参考文献
1 Beilharz EJ,Williams CE,Draganow M,et al. Mechanism of delayed cell death following hypoxic-ischemic injury in the immatare rat :evidence for apoptosis during selective neuronal loss Mol Brain Res 1995;29(1):1～14.
, http://www.100md.com
2 Rice JE,Vammucci RC,Bridrly JB,The influcence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat Ann Neurol,1981;9:131～141.
3 Gong J,Li X,DanzynKiewicz Z.Different patterns of apoptosis of H1-60 cells induced by cycloheximide and camptothecin.J cell Physiol,1993;157:263～70.
4 Kamesakis ,Kamesaki H,Jorgensen TJ,et al.Bcl-2 protein inhibits etoposide-induced apoptosis through its effects on events subsequent to topoisomerase II-induced DNA strand breaks and repair.Cancer Res,1993;53:4251～6.
, 百拇医药
5 MacManus JP,Hill IE,Hnang ZG,et al.DNA damage consistent with apoptosis in transient focal ishemic neocrotex.Neuroreport,1994;5:493.
6 Hill IE,MacManus JP,Rasquinha J,et al.DNA fragmentation indicative of apoptosis following unilateral cerebral hypoxia-ischemia int he neonatal rat Brain Res 1995;676;393～403.
7 蒋犁，沟云珍，俞咏华，等：缺氧缺血对新生大鼠脑皮质细胞凋亡的影响。新生儿科杂志1998；13(3)：117～119。
(收稿日期：1999-01-09), http://www.100md.com