腺病毒介导基因导入心包的实验研究
作者：李建军 李庚山 黄从新 许家琍 王晋明 江洪 唐其柱 尹丽亚 王晶
单位：430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院心内科
关键词：
中华医学杂志990224 本实验以腺病毒为载体，以LacZ基因为标识基因，经心包导基因入心肌，获得了较好效果。
一、材料与方法
1.重组腺病****：重组腺病****方法详见文献[1-3]。将细菌LacZ基因插入粘性末端质粒载体的SRa启动子与SV40多聚腺苷酸[poly(A)]序列之间。其质粒载体中含有整个人类5型腺病毒的基因组，但已预先去掉其E1a、E1b和E3区使之形成复制缺陷。含有目的基因LacZ的重组腺病毒名命为Adex1SRLacZ且经293细胞培养同源重组获得，并经常规酶消化法和测定受其感染后细胞中β-半乳糖苷酶的活性而确认。确认后的病毒株经293细胞扩增，尔后经氯化铯密度梯度离心法回收与纯化。病毒滴度采用293细胞受其感染后斑块形成单位(pfu：plaque formation unit)计算。经该法提取，通常可获得1×1010pfu的高滴度病毒。与此同时，制作不含任何外源基因但结构上与重组腺病毒完全相同的腺病毒名为Adex1w作为对照。
, 百拇医药
2.活体基因导入心包：选SD小鼠20只，体重200～300 g，雌雄不限。经腹腔注射苯巴比妥钠(25 mg/kg)麻醉。左侧开胸暴露心包，使用25号针头注入0.5 ml约含0.5×108 pfu的Adex1SRLacZ入心包，缝合胸壁切口。对照小鼠则用相同方法注入等量Adex1w入心包。手术完毕后，给予普通饲料继续喂养。
3.组织化学分析： 基因导入后24小时(2只)、3天(3只)、7天(3只)、14天(3只)、21天(3只)和28天(2只)及对照腺病毒注入后3天(2只)、7天(2只)经腹腔注入过量苯巴比妥钠处死小鼠，并开胸迅速取出心包和心脏，经冷生理盐水冲洗3次后，置于2%甲醛+0.2%戊二醛/PBS(pH7.4)液中于4 ℃固定12小时。继之，PBS冲洗5次，浸泡冲洗10分钟×3次。随后将组织置于PBS液中(5 mmol/L铁氰化钾、5 mmol/L亚铁氰化钾、1 mmol/L二氯化镁、1 mg/ml X-gal)37 ℃培养5小时。
, 百拇医药
染色完毕后，组织经生理盐水冲洗3次，重新置于PBS液中(2%甲醛、0.2%戊二醛pH7.4)液中于4 ℃固定24小时以上。继之，将心脏沿长轴切成3～5 mm薄片，石蜡包埋，使用组织切片机将包埋组织切成5 μm的切片，核固红染色后显微镜下观察、照相。
二、结果
心包壁、脏层均可见成块或片状分布的蓝染区，尤以心包脏层为甚。经组织切片观察，心包壁层可见明显的蓝染颗粒，而心包脏层则可见全层蓝染。心肌中亦可见呈灶状分布的蓝染细胞。而注射同等剂量对照腺病毒Adex1w的小鼠心脏及心包经大体及组织学切片观察均未见蓝染(图1～4)。
图1 心包壁层可见明显的蓝染颗粒(核固红染色) ×80
图2 心包脏层可见全层蓝染
, 百拇医药
图3 心肌中可见灶状分布的蓝染细胞
图4 对照组未见蓝染
LacZ在心包及心肌中表达的时间曲线观察表明，实验组小鼠24小时、3、7、14天组均可见LacZ基因在心包和心脏中表达，以3天为甚。而21天3只小鼠中2只可见LacZ基因在心包和心肌中散在表达，28天则消失。
三、讨论
基因治疗的基本要求之一是具有细胞和组织特异性，这样才能避免副作用，减少基因用量，增加疗效[4]。达此目的除选用细胞特定启动子和利用细胞特异配体等方法外，合理采用导入途径亦甚为重要。心包是由壁层和脏层构成的封闭腔隙，我们推测若将外源基因注入心包，既符合基因治疗所需特定靶器官的要求，又能延长外源基因与心包及心包脏层下心肌的接触时间，其病毒颗粒有足够的时间透过“心包屏障”转染于心肌。本实验证实，经心包导基因入心脏具有可行性与可靠性，为未来基因治疗心肌疾病开辟了一条新的途径。此外，本研究尚证实，腺病毒载体虽具高转染性，但外源基因在心包及心肌中的表达呈一过性，4周左右即见消失。机理可能与腺病毒载体不能整合进细胞染色体及宿主的免疫反应有关[1]。
, 百拇医药
本课题为国家教委回国人员基金资助项目
参考文献
1 Li JJ, Ueno H, Pan Y, et al. Percutaneous transluminal gene transfer into canine myocardium in vivo by replication-defective adenovirus. Cardiovasc Res，1995，30:97-105.
2 Li JJ, Ueno H, Yamamoto H, et al. Adenovirus-mediated arterial gene transfer does not require prior injury for submaximal gene expression. Gene Ther，1995，2：351-354.
, http://www.100md.com
3 Ueno H, Li JJ, Tomita H, et al. Quantitative analysis of gene expression after a repetitive infection into the same arterial wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol，1995，15：2246-2254.
4 Riessen R, Isner JM. Prospects for site-specific delivery of pharmacologic and molecular therapies. J Am Coll Cardiol，1994，23：1234-1342.
(收稿：1997-12-15 修回：1998-12-02), 百拇医药
单位：430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院心内科
关键词：
中华医学杂志990224 本实验以腺病毒为载体，以LacZ基因为标识基因，经心包导基因入心肌，获得了较好效果。
一、材料与方法
1.重组腺病****：重组腺病****方法详见文献[1-3]。将细菌LacZ基因插入粘性末端质粒载体的SRa启动子与SV40多聚腺苷酸[poly(A)]序列之间。其质粒载体中含有整个人类5型腺病毒的基因组，但已预先去掉其E1a、E1b和E3区使之形成复制缺陷。含有目的基因LacZ的重组腺病毒名命为Adex1SRLacZ且经293细胞培养同源重组获得，并经常规酶消化法和测定受其感染后细胞中β-半乳糖苷酶的活性而确认。确认后的病毒株经293细胞扩增，尔后经氯化铯密度梯度离心法回收与纯化。病毒滴度采用293细胞受其感染后斑块形成单位(pfu：plaque formation unit)计算。经该法提取，通常可获得1×1010pfu的高滴度病毒。与此同时，制作不含任何外源基因但结构上与重组腺病毒完全相同的腺病毒名为Adex1w作为对照。
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2.活体基因导入心包：选SD小鼠20只，体重200～300 g，雌雄不限。经腹腔注射苯巴比妥钠(25 mg/kg)麻醉。左侧开胸暴露心包，使用25号针头注入0.5 ml约含0.5×108 pfu的Adex1SRLacZ入心包，缝合胸壁切口。对照小鼠则用相同方法注入等量Adex1w入心包。手术完毕后，给予普通饲料继续喂养。
3.组织化学分析： 基因导入后24小时(2只)、3天(3只)、7天(3只)、14天(3只)、21天(3只)和28天(2只)及对照腺病毒注入后3天(2只)、7天(2只)经腹腔注入过量苯巴比妥钠处死小鼠，并开胸迅速取出心包和心脏，经冷生理盐水冲洗3次后，置于2%甲醛+0.2%戊二醛/PBS(pH7.4)液中于4 ℃固定12小时。继之，PBS冲洗5次，浸泡冲洗10分钟×3次。随后将组织置于PBS液中(5 mmol/L铁氰化钾、5 mmol/L亚铁氰化钾、1 mmol/L二氯化镁、1 mg/ml X-gal)37 ℃培养5小时。
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染色完毕后，组织经生理盐水冲洗3次，重新置于PBS液中(2%甲醛、0.2%戊二醛pH7.4)液中于4 ℃固定24小时以上。继之，将心脏沿长轴切成3～5 mm薄片，石蜡包埋，使用组织切片机将包埋组织切成5 μm的切片，核固红染色后显微镜下观察、照相。
二、结果
心包壁、脏层均可见成块或片状分布的蓝染区，尤以心包脏层为甚。经组织切片观察，心包壁层可见明显的蓝染颗粒，而心包脏层则可见全层蓝染。心肌中亦可见呈灶状分布的蓝染细胞。而注射同等剂量对照腺病毒Adex1w的小鼠心脏及心包经大体及组织学切片观察均未见蓝染(图1～4)。
图1 心包壁层可见明显的蓝染颗粒(核固红染色) ×80
图2 心包脏层可见全层蓝染
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图3 心肌中可见灶状分布的蓝染细胞
图4 对照组未见蓝染
LacZ在心包及心肌中表达的时间曲线观察表明，实验组小鼠24小时、3、7、14天组均可见LacZ基因在心包和心脏中表达，以3天为甚。而21天3只小鼠中2只可见LacZ基因在心包和心肌中散在表达，28天则消失。
三、讨论
基因治疗的基本要求之一是具有细胞和组织特异性，这样才能避免副作用，减少基因用量，增加疗效[4]。达此目的除选用细胞特定启动子和利用细胞特异配体等方法外，合理采用导入途径亦甚为重要。心包是由壁层和脏层构成的封闭腔隙，我们推测若将外源基因注入心包，既符合基因治疗所需特定靶器官的要求，又能延长外源基因与心包及心包脏层下心肌的接触时间，其病毒颗粒有足够的时间透过“心包屏障”转染于心肌。本实验证实，经心包导基因入心脏具有可行性与可靠性，为未来基因治疗心肌疾病开辟了一条新的途径。此外，本研究尚证实，腺病毒载体虽具高转染性，但外源基因在心包及心肌中的表达呈一过性，4周左右即见消失。机理可能与腺病毒载体不能整合进细胞染色体及宿主的免疫反应有关[1]。
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本课题为国家教委回国人员基金资助项目
参考文献
1 Li JJ, Ueno H, Pan Y, et al. Percutaneous transluminal gene transfer into canine myocardium in vivo by replication-defective adenovirus. Cardiovasc Res，1995，30:97-105.
2 Li JJ, Ueno H, Yamamoto H, et al. Adenovirus-mediated arterial gene transfer does not require prior injury for submaximal gene expression. Gene Ther，1995，2：351-354.
, http://www.100md.com
3 Ueno H, Li JJ, Tomita H, et al. Quantitative analysis of gene expression after a repetitive infection into the same arterial wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol，1995，15：2246-2254.
4 Riessen R, Isner JM. Prospects for site-specific delivery of pharmacologic and molecular therapies. J Am Coll Cardiol，1994，23：1234-1342.
(收稿：1997-12-15 修回：1998-12-02), 百拇医药