丝裂霉素C耐药性细胞亚系的建立及生物学特性的研究
作者：陈红 陈惠祯 刘诗权 吴绪峰 侯汉英 杨庆忆
单位：430071 武汉，湖北医科大学附属第二医院肿瘤科(陈红现在该院妇产科)
关键词：
中华医学杂志990222 丝裂霉素C(MMC)是临床常用抗宫颈癌药物，但常易产生耐药性。我们建立了宫颈癌耐MMC耐药亚系Hela/MMC，并观察了其生物学特性，为临床克服耐药性产生和寻找有效耐药修饰剂提供实验模型。
一、材料和方法
1.材料：人宫颈癌Hela细胞由湖北省医学科学院病毒研究所提供；丝裂霉素系日本协和发酵工业株式会社生产；顺铂为中国齐鲁制药厂产品；阿霉素为意大利爱宝制药厂生产；5-氟尿嘧啶为上海旭东海埔药业有限公司生产；长春新碱为上海第十二制药厂生产；HR-A、HR-B液由德国Partel公司生产；溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)为美国Sigma公司产品；裸鼠为雌性BALB/C/nu小鼠，鼠龄4～6周，由军事医学科学院提供。
, 百拇医药
2.方法：(1) 细胞培养及Hela/MMC耐药细胞亚系的分离：Hela细胞常规培养于Hybri-care培养基[1]，隔天换液1次，每周传代2次，细胞呈贴壁生长。采用连续性药物作用，间歇性增加药量，逐步提高培养液中MMC质量浓度的方法，从亲代宫颈癌Hela细胞中获得耐MMC耐药亚系[2]。Hela细胞培养液中MMC的初质量浓度为0.5 μg/L，然后，每隔2～3周MMC质量浓度递增0.5 μg/L，7个月后，MMC质量浓度增至6.0 μg/ml，细胞于含MMC 6.0 μg/L培养液中贴壁生长良好1个月，为Hela/MMC耐药亚系，已传至96代。进行下列每项生物学实验前1周去药。(2) Hela与Hela/MMC细胞生物学特性研究：① 细胞形态、超微结构：取亲代、耐药细胞倒置显微镜或HE染色涂片观察，随机测50个细胞的平均直径。透射电镜观察细胞超微结构。② 细胞生长增殖特性：群体倍增时间(Td)方法参照文献[2]；DNA倍体构成检测：将亲代和耐药细胞分别接种于有盖玻片培养瓶中，4天后取出玻片，按吴中亮等[3]方法进行Feulgen-DNA染色并采用图象分析系统检测细胞核积分吸光度值(A)，得出细胞核DNA倍体构成。正常人淋巴细胞DNA含量作二倍体细胞对照；细胞周期测定：收集对数生长期亲代和耐药细胞，按Xu等[4]方法，采用Partel-Ⅲi流式细胞检测。(3) 染色体分析：取对数生长期亲代、耐药细胞(12,43代),常规方法收集细胞、制片和G分带。(4) 耐药程度、耐药稳定性及交叉耐药性：采用MTT法，耐药程度和交叉耐药检测方法参照文献[5，6]，细胞在无MMC培养液中传代4个月后，重复实验，观察Hela/MMC细胞耐药稳定性。(5) 裸鼠体内成瘤实验：取对数生长期亲代和耐药细胞分别接种于4只4～6周龄裸鼠背部皮下2点，每点约2×107个细胞，待Hela/MMC移植瘤直径长至1.5～2 cm左右，取瘤组织转种于30只裸小鼠背部皮下，观察鼠间传代成功率。取移植瘤，常规固定、包埋、切片、HE染色，光学显微镜下观察组织形态。(6) 统计学处理：采用u和χ2检验。
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二、结果
1.Hela和Hela/MMC细胞形态学比较：(1) 光学显微镜下：Hela和Hela/MMC细胞均为贴壁生长的上皮细胞,倒置光学显微镜下活细胞呈扁平不规则菱形或多角形，均质且透明；HE染色光学显微镜下观察，Hela/MMC细胞形态多样，巨大细胞多见；核异型性更为明显，可见双核、多核、核分裂相增多；核仁大、畸形；Hela和Hela/MMC细胞直径分别是(21±6)μm和(30±11)μm，P<0.01，见图1，2。(2) 电子显微镜下：可见耐药细胞核异型性更明显，核形态不规则，核膜增厚，核切迹多见，核仁大呈海绵状、双核仁，微绒毛更丰富。
图1 Hela细胞形态较一致，核分裂相较少 HE×400
图2 Hela/MMC细胞形态多样，多核细胞、瘤巨细胞多见 HE×400
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2.生长增殖特性：(1) 细胞群体倍增时间：亲代和耐药细胞Td分别为32.8小时和28.6小时，后者比前者缩短了12.6%。(2) DNA倍体构成：结果见表1。(3) Hela及Hela/MMC细胞周期分析：见表2。 表1 两种细胞DNA倍体构成比较(细胞数) 细胞
细胞数
倍体构成
2C
3～4C
≥5C
Hela
315
5(1.6)
158(50.2)
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152(48.2)*
Hela/MMC
320
3(0.9)
76(23.8)
241(75.3)
注：括号内为构成比(%)；* 与Hela/MMC细胞比较 P<0.01
表2 Hela及Hela/MMC细胞周期检测 细胞
细胞数
细胞时相
G0/G1
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S
G2+M
合计
Hela
106
52.49
43.34
4.17
100
Hela/MMC
106
38.88
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45.87
15.28
100
3.染色体分析：共分析亲代和耐药细胞各200个的中期相染色体，染色体众数分别是超三倍和亚四倍体。耐药细胞(12,43代)G分带，在A～G组可见到染色体的增多或减少，并发现一条9号染色体长臂与2号染色体短臂连接形成的衍生染色体，出现率为18%(9/50)。
4.耐药水平、耐药稳定性及交叉耐药性：耐药细胞对MMC呈5.02倍耐药，对顺铂呈2倍交叉耐药，而对阿霉素(ADM)、长春新碱(VCR)和5-氟尿嘧啶(5-Fu)保持敏感，该细胞系在无MMC培养液中传代4个月,耐药性不变(表3)。 表3 两种细胞对不同化疗药物的半抑制浓度(nmol/L) 细胞系
丝裂霉素
, 百拇医药
顺铂
阿霉素
长春新碱
5-氟尿嘧啶
Hela
194.42
168.16
147.19
1.40
2 995.80
975.10
341.36
110.39
, 百拇医药
1.10
1 921.92
Hela/MMC
5.02
2.03
0.75
0.79
0.64
注：样本数均为每种细胞每次接1×108个/L
5.裸鼠体内成瘤实验：亲代、耐药细胞裸鼠移植瘤生长情况见表4。
表4 Hela及Hela/MMC细胞裸鼠移植瘤生长情况 细 胞
, 百拇医药
长瘤鼠数/
接种鼠数
移植瘤
形成天数
接种4周后
移植瘤大小(cm)
组织学形态
鼠间传代
Hela
3/4
14
1～1.5
宫颈上皮细胞癌
, 百拇医药
0
Hela/MMC
4/4
12
1.5～2
宫颈上皮癌
96%
(29/30)
三、讨论
1.耐药亚系Hela/MMC生物学特性：耐药细胞某些生物学特性较之亲代细胞发生了变化，其形态、超微结构及生长增殖指标结果显示分化程度更差，恶性程度更高，生长增殖能力更强，这在其他耐药细胞中也有发现[7]，其机制可能是：MMC长期作用影响细胞分裂；细胞为适应环境改变，自身的基因调控发生改变。
, 百拇医药
2.Hela/MMC细胞耐药特性：我们以Hela细胞为亲本成功地筛选出对MMC5倍耐药的耐药亚系Hela/MMC，其对顺铂(DDP)有2倍交叉耐药，而对ADM、VCR和5-Fu趋向于更敏感，这对指导临床合理用药有意义。肿瘤细胞对MMC和DDP易产生交叉耐药可能与下列因素有关：(1) MMC和DDP同属同期非特异性药物，能与DNA形成交联，阻碍DNA复制过程，当DNA损伤修复增强时，则产生耐药。(2) 与耐药细胞巯基和金属硫因(MT-ⅡA)mRNA的过表达有关。
本课题为湖北省教委重点攻关项目
参考文献
1 鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术.第1版.北京：北京出版社，1995.96-98.
2 王艳萍，徐刚.耐阿霉素人胃腺癌细胞亚株的分离及特征.癌症，1992, 11：450-454.
, 百拇医药
3 吴中亮，杨晖，高宏光，等.EMD对肺癌A-549细胞DNA含量的影响.广州医学院报，1985,13：10-12.
4 Xu BH,Gupta V,Sigh SV,et al. Characterization of a human bladder cancer cell line selected for resistance to mitomycin C. Int J Cancer, 1994, 58：686-692.
5 Mosman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods,1983, 65：55-72.
6 周友珍，陈惠祯，杨庆忆，等.人卵巢癌顺铂耐药细胞株的建立及其耐药机制的研究.中华医学杂志，1996,76:680-683.
7 Twentyman PR. Derivation and preliminary characterization of adriam-ycin resistance lines of human lung cancer cell. Br J Cancer,1986, 53：529-534.
(收稿：1998-03-24 修回：1998-09-01), http://www.100md.com
单位：430071 武汉，湖北医科大学附属第二医院肿瘤科(陈红现在该院妇产科)
关键词：
中华医学杂志990222 丝裂霉素C(MMC)是临床常用抗宫颈癌药物，但常易产生耐药性。我们建立了宫颈癌耐MMC耐药亚系Hela/MMC，并观察了其生物学特性，为临床克服耐药性产生和寻找有效耐药修饰剂提供实验模型。
一、材料和方法
1.材料：人宫颈癌Hela细胞由湖北省医学科学院病毒研究所提供；丝裂霉素系日本协和发酵工业株式会社生产；顺铂为中国齐鲁制药厂产品；阿霉素为意大利爱宝制药厂生产；5-氟尿嘧啶为上海旭东海埔药业有限公司生产；长春新碱为上海第十二制药厂生产；HR-A、HR-B液由德国Partel公司生产；溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)为美国Sigma公司产品；裸鼠为雌性BALB/C/nu小鼠，鼠龄4～6周，由军事医学科学院提供。
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2.方法：(1) 细胞培养及Hela/MMC耐药细胞亚系的分离：Hela细胞常规培养于Hybri-care培养基[1]，隔天换液1次，每周传代2次，细胞呈贴壁生长。采用连续性药物作用，间歇性增加药量，逐步提高培养液中MMC质量浓度的方法，从亲代宫颈癌Hela细胞中获得耐MMC耐药亚系[2]。Hela细胞培养液中MMC的初质量浓度为0.5 μg/L，然后，每隔2～3周MMC质量浓度递增0.5 μg/L，7个月后，MMC质量浓度增至6.0 μg/ml，细胞于含MMC 6.0 μg/L培养液中贴壁生长良好1个月，为Hela/MMC耐药亚系，已传至96代。进行下列每项生物学实验前1周去药。(2) Hela与Hela/MMC细胞生物学特性研究：① 细胞形态、超微结构：取亲代、耐药细胞倒置显微镜或HE染色涂片观察，随机测50个细胞的平均直径。透射电镜观察细胞超微结构。② 细胞生长增殖特性：群体倍增时间(Td)方法参照文献[2]；DNA倍体构成检测：将亲代和耐药细胞分别接种于有盖玻片培养瓶中，4天后取出玻片，按吴中亮等[3]方法进行Feulgen-DNA染色并采用图象分析系统检测细胞核积分吸光度值(A)，得出细胞核DNA倍体构成。正常人淋巴细胞DNA含量作二倍体细胞对照；细胞周期测定：收集对数生长期亲代和耐药细胞，按Xu等[4]方法，采用Partel-Ⅲi流式细胞检测。(3) 染色体分析：取对数生长期亲代、耐药细胞(12,43代),常规方法收集细胞、制片和G分带。(4) 耐药程度、耐药稳定性及交叉耐药性：采用MTT法，耐药程度和交叉耐药检测方法参照文献[5，6]，细胞在无MMC培养液中传代4个月后，重复实验，观察Hela/MMC细胞耐药稳定性。(5) 裸鼠体内成瘤实验：取对数生长期亲代和耐药细胞分别接种于4只4～6周龄裸鼠背部皮下2点，每点约2×107个细胞，待Hela/MMC移植瘤直径长至1.5～2 cm左右，取瘤组织转种于30只裸小鼠背部皮下，观察鼠间传代成功率。取移植瘤，常规固定、包埋、切片、HE染色，光学显微镜下观察组织形态。(6) 统计学处理：采用u和χ2检验。
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二、结果
1.Hela和Hela/MMC细胞形态学比较：(1) 光学显微镜下：Hela和Hela/MMC细胞均为贴壁生长的上皮细胞,倒置光学显微镜下活细胞呈扁平不规则菱形或多角形，均质且透明；HE染色光学显微镜下观察，Hela/MMC细胞形态多样，巨大细胞多见；核异型性更为明显，可见双核、多核、核分裂相增多；核仁大、畸形；Hela和Hela/MMC细胞直径分别是(21±6)μm和(30±11)μm，P<0.01，见图1，2。(2) 电子显微镜下：可见耐药细胞核异型性更明显，核形态不规则，核膜增厚，核切迹多见，核仁大呈海绵状、双核仁，微绒毛更丰富。
图1 Hela细胞形态较一致，核分裂相较少 HE×400
图2 Hela/MMC细胞形态多样，多核细胞、瘤巨细胞多见 HE×400
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2.生长增殖特性：(1) 细胞群体倍增时间：亲代和耐药细胞Td分别为32.8小时和28.6小时，后者比前者缩短了12.6%。(2) DNA倍体构成：结果见表1。(3) Hela及Hela/MMC细胞周期分析：见表2。 表1 两种细胞DNA倍体构成比较(细胞数) 细胞
细胞数
倍体构成
2C
3～4C
≥5C
Hela
315
5(1.6)
158(50.2)
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152(48.2)*
Hela/MMC
320
3(0.9)
76(23.8)
241(75.3)
注：括号内为构成比(%)；* 与Hela/MMC细胞比较 P<0.01
表2 Hela及Hela/MMC细胞周期检测 细胞
细胞数
细胞时相
G0/G1
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S
G2+M
合计
Hela
106
52.49
43.34
4.17
100
Hela/MMC
106
38.88
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45.87
15.28
100
3.染色体分析：共分析亲代和耐药细胞各200个的中期相染色体，染色体众数分别是超三倍和亚四倍体。耐药细胞(12,43代)G分带，在A～G组可见到染色体的增多或减少，并发现一条9号染色体长臂与2号染色体短臂连接形成的衍生染色体，出现率为18%(9/50)。
4.耐药水平、耐药稳定性及交叉耐药性：耐药细胞对MMC呈5.02倍耐药，对顺铂呈2倍交叉耐药，而对阿霉素(ADM)、长春新碱(VCR)和5-氟尿嘧啶(5-Fu)保持敏感，该细胞系在无MMC培养液中传代4个月,耐药性不变(表3)。 表3 两种细胞对不同化疗药物的半抑制浓度(nmol/L) 细胞系
丝裂霉素
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顺铂
阿霉素
长春新碱
5-氟尿嘧啶
Hela
194.42
168.16
147.19
1.40
2 995.80
975.10
341.36
110.39
, 百拇医药
1.10
1 921.92
Hela/MMC
5.02
2.03
0.75
0.79
0.64
注：样本数均为每种细胞每次接1×108个/L
5.裸鼠体内成瘤实验：亲代、耐药细胞裸鼠移植瘤生长情况见表4。
表4 Hela及Hela/MMC细胞裸鼠移植瘤生长情况 细 胞
, 百拇医药
长瘤鼠数/
接种鼠数
移植瘤
形成天数
接种4周后
移植瘤大小(cm)
组织学形态
鼠间传代
Hela
3/4
14
1～1.5
宫颈上皮细胞癌
, 百拇医药
0
Hela/MMC
4/4
12
1.5～2
宫颈上皮癌
96%
(29/30)
三、讨论
1.耐药亚系Hela/MMC生物学特性：耐药细胞某些生物学特性较之亲代细胞发生了变化，其形态、超微结构及生长增殖指标结果显示分化程度更差，恶性程度更高，生长增殖能力更强，这在其他耐药细胞中也有发现[7]，其机制可能是：MMC长期作用影响细胞分裂；细胞为适应环境改变，自身的基因调控发生改变。
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2.Hela/MMC细胞耐药特性：我们以Hela细胞为亲本成功地筛选出对MMC5倍耐药的耐药亚系Hela/MMC，其对顺铂(DDP)有2倍交叉耐药，而对ADM、VCR和5-Fu趋向于更敏感，这对指导临床合理用药有意义。肿瘤细胞对MMC和DDP易产生交叉耐药可能与下列因素有关：(1) MMC和DDP同属同期非特异性药物，能与DNA形成交联，阻碍DNA复制过程，当DNA损伤修复增强时，则产生耐药。(2) 与耐药细胞巯基和金属硫因(MT-ⅡA)mRNA的过表达有关。
本课题为湖北省教委重点攻关项目
参考文献
1 鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术.第1版.北京：北京出版社，1995.96-98.
2 王艳萍，徐刚.耐阿霉素人胃腺癌细胞亚株的分离及特征.癌症，1992, 11：450-454.
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3 吴中亮，杨晖，高宏光，等.EMD对肺癌A-549细胞DNA含量的影响.广州医学院报，1985,13：10-12.
4 Xu BH,Gupta V,Sigh SV,et al. Characterization of a human bladder cancer cell line selected for resistance to mitomycin C. Int J Cancer, 1994, 58：686-692.
5 Mosman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods,1983, 65：55-72.
6 周友珍，陈惠祯，杨庆忆，等.人卵巢癌顺铂耐药细胞株的建立及其耐药机制的研究.中华医学杂志，1996,76:680-683.
7 Twentyman PR. Derivation and preliminary characterization of adriam-ycin resistance lines of human lung cancer cell. Br J Cancer,1986, 53：529-534.
(收稿：1998-03-24 修回：1998-09-01), http://www.100md.com