重组乙型肝炎表面抗原插入突变体的真核表达及其抗原性的分析
作者：古柏燕 任红 张定凤
单位：400010 重庆医科大学附属第二医院病毒性肝炎研究所
关键词：肝炎表面抗原，乙型；突变，插入；基因表达
中华医学杂志990219 【摘要】 目的 研究与乙型肝炎病毒感染的临床进程相关的两种乙型肝炎表面抗原(HBsAg)插入变异体的免疫学性状，以阐明在HBsAg阴性的慢性乙型肝炎病毒感染中所起的作用。方法 利用体外PCR诱变方法，构建重组HBsAg的插入突变体；借助EB病毒载体pCEP4和逆转录病毒载体PXT1将重组插入变异S基因转染哺乳动物细胞；利用ELISA及Western blot方法，探讨变异抗原与抗HBs的结合力。结果 (1)构建了HBsAg的插入突变体(分别在HBsAg的第122位与123位氨基酸间插入Arg,Ala和第123位与124位氨基酸间插入Arg, Gly, Ala)的真核表达载体；(2)将其转染哺乳动物细胞，最终建立了能表达野生型和变异型HBsAg的HepG2细胞系；(3)这些细胞系能在体外稳定地连续传代培养；(4)野生型HBsAg可与抗HBs结合，变异型HBsAg不能与抗HBs结合。结论 研究表明这两种插入变异体影响了HBsAg的空间结构，从而使其失去与乙型肝炎病毒表面抗体的结合力，因而可能逃避机体的免疫清除而持续存在于体内形成慢性感染。
, 百拇医药
Expression of recombinant inserting mutants of HBsAg in vitro and its antigenic analysis GU Baiyan, REN Hong, ZHANG Dingfeng. Institute for Virol Hepatitis, Chongqing Medical University, Chongqing 400010
【Abstract】 Objective To study the immunological characteristics of two inserting variants of HBsAg as further to elucidate the role of inserting mutants in the development of HBsAg-negative chronic hepatitis B. Methods The inserting mutants of HBsAg were constructed by PCR-mediated mutagenesis in vitro. Epstein-Barr virus vector pCEP4 and retrovirus vector PXT1 carrying the mutant genes of HBsAg were transfected into mamalian cells. The affinity of polyclonal and monoclonal antibodies against HBsAg for mutant antigens were studied by ELISA and western blot.Results Two insertions were introduced into s gene, and a six nucleotide insertion introduced two aminoacids (Arg and Ala) between codons 122 and 123 of the s polypeptide, whereas a nine nucleotide insertion introduced three aminoacids(Arg, Gly and Ala) between codons 123 and 124. These s genes were subcloned into two eukaryotic expression vectors (pCEP4 and PXT1), and the recombinant eukaryotic expression plasmids had been constructed, which could express s polypeptide in mammalian cells. Cell lines expressing wild-type or mutant-type HBsAg stably were obtained after transfection of these vectors into mammalian cells. The two inserting variants failed to react with polyclonal and monoclonal antibodies against HBsAg by ELISA and Western blot. Conclusion The insertions may result in a conformational change of the s protein, and affect its antigenicities, suggesting that the inserting mutations may be critical for immunoescape of HBV and in part responsible for chronicity of HBsAg-negative patients.
, http://www.100md.com
【Key words】 Hepatitis B surface antigens Mutagenesis,insertional Genes expression
(Natl Med J China, 1999, 79:139-142)
临床研究显示HBV的S区变异热点主要集中于“a”抗原决定簇编码区，发生于HBsAg“a”抗原决定簇内的变异在一定范围内解释了免疫逃避株的出现及临床意义[1，2]。临床分析发现，30%～40%的HBsAg阴性的慢性乙型肝炎患者血清和肝组织中可用PCR方法检知HBV DNA[3]。新近的研究在2例HBsAg阴性的中国慢性HBV感染者发现了发生于“a”抗原决定簇前的两株新的插入变异株，而同地区的30名HBsAg阳性患者中则未发现类似变异株存在[4]。为深入研究这两种HBsAg插入变异的生物学行为及其临床相关性，本研究利用体外PCR诱变方法，基因重组和真核表达等技术，构建了重组HBsAg的插入突变体；分别以EB病毒载体pCEP4和逆转录病毒载体PXT1为表达载体，在真核细胞上表达了变异抗原，并对其抗原性作了初步分析。
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材料与方法
一、材料
1.质粒载体及菌株：pEcob6, pBluescriptKS+见参考文献[5]；pCEP4,为EB病毒真核表达载体，转化菌TOP10F′(美国In vitroGene公司)；PXT1，为逆转录病毒真核表达载体，转化菌RR1(美国Strategen公司)。
2.限制性核酸内切酶，Taq酶，AMVRT-polymerase及其它修饰酶：均购自德国Boehringer Mannheim公司。
3.质粒DNA提取，RNA提取及基因片段分离：采用德国Qiagen公司及上海华顺公司试剂盒。
二、方法
1.体外PCR诱变：根据HBV野毒株S区基因序列(已测)及相关文献[6]，分别设计两组体外插入诱变的引物，经Pcgene软件分析，由Cybersyn公司合成。以pEcob6为模板，分别利用S区的上游引物和方向与之相反的内侧诱变引物及S区的下游引物和方向与之相反的内侧诱变引物进行两套初级PCR，再将两套初级PCR产物混合，在一定的条件下变性，退火，然后再利用S区的上游引物进行PCR，由此获得的PCR产物中即含有大小约为680bp的已发生插入突变的S基因。详细的步骤见参考文献[6]。S区的两条PCR引物：P1(上游引物)5′GTGAAGCTTATGGAGAACATCGCATCAG3′；P2(下游引物)5′GTTTAAATGTATACCCAAAG3′；插入变异株1(以后简称IM1)的内侧诱变引物：P35′GTTGCCCGTTTGCATGGTCCGGTGCTG3′；P4 5′CAAACGGGCAACCTGCACGACTCCTGC3′；插入变异株2(以后简称 IM2)的内侧诱变引物：P5 5′AGGCGCCCCGTGTTTTGCATGGTCCGGTGCTG3′；P6 5′AACACGGG GCGCCTGCAAGACTCCTGC3′。
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2.诱变产物的克隆及确证性测序：为了确定诱变基因的序列，首先应将其克隆到pBKS+载体以制备单链DNA进行测序。利用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段将所获得的野毒株及变异株S基因片段的3′粘端去除，然后经HindⅢ酶切后纯化，由此可获得一端为平端，另一端为粘端的野毒株及变异株S基因片段；将其克隆到pBluescript KS+载体的SmaⅠ、HindⅢ位点，转化受体菌XL1-Blue。制备质粒DNA，以XbaⅠ作限制性内切酶分析，选择阳性重组质粒。按照常规方法制备单链DNA，用美国USB公司Sequenase Version2.0试剂盒进行测序。
3.野生型及变异型S基因真核表达载体的构建：采用两种真核表达载体表达野生型及变异型S基因，即将野生型及变异型S基因从pBKS+-HBS系列重组体亚克隆到EB病毒真核表达载体pCEP4和逆转录病毒真核表达载体PXT1。将上述HBV S基因野生型和突变型的基因片段经BamHI和Kpn第I位点由pBluescript KS+-HBs定向克隆到真核表达载体pCEP4的相同位点，经限制性内切酶SalI分析，筛选出阳性克隆。用BamHI和XhoI消化pBKS+-HBS系列重组体，分离纯化野生型和突变型S基因片段；PXT1经HindⅢ和BglⅡ消化，分离纯化小片段DNA；同时将PXT1经HindⅢ和XholⅡ消化分离纯化大片段DNA；将两条载体片段与前面制备的目的基因连接后转化受体菌RR1。制备质粒DNA，通过限制性内切酶HindⅢ分析，筛选出阳性克隆。
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4.对HepG2细胞转染：采用电穿孔方法将pCEP4重组体导入HepG2细胞，以潮霉素(Hygromycine B,美国Cal Biochem公司)筛选抗性克隆。
5.对PA317细胞转染：采用电穿孔方法将PXT1重组体导入PA317细胞，以G418(美国Promega公司)筛选抗性克隆。
6.感染HepG2细胞：用含假病毒颗粒的PA317细胞培养上清感染HepG2细胞。
7.HBsAg检测：采用厦门新科公司ELISA检测试剂盒。
8.Western-blot分析：抗HBs单抗及其他相关试剂购自深圳晶美公司。
结 果
一、HBV S区的体外插入诱变(IM1和IM2)及确证性测序
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利用PCR诱变方法将两种插入突变引入S基因，初步PCR产物经电泳鉴定，发现获得了大小为320bp和360bp大小的两条DNA条带，将这两条含突变区的末端部分序列重叠的DNA利用S区外侧引物进行PCR扩增，获得的最终产物中含有大小约为680bp的基因片段。pBKS+载体含有1个XbaI位点，S基因也含有1个XbaI位点，因此重组质粒经XbaI消化后电泳呈现两条DNA带。再经DNA序列分析鉴定(图1)表明两种插入突变已按预先设想引入S基因：IM1，在HBV DNA第519位核苷酸前插入6个核苷酸，即在S基因第122位与123位密码子间插入Arg和Ala的密码子；IM2，在第519位核苷酸后插入9个核苷酸而致HBsAg第123位与124位氨基酸间插入Arg、Gly和Ala。
图1 诱变S基因的确证性测序图谱
二、pCEP4-HBs系列重组体的构建(图2)
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pCEP4含有2个SalI位点，pCEP4-HBs系列重组体含有3个SalI位点，电泳结果与此相符。由此建立了以下一系列S基因的pCEP4表达载体：pCEP4-HBs(WT)，pCEP4-HBs(IM1)，pCEP4-HBs(IM2)。
1.Marker; 2.pCEP4/SalI；3.4.pCEP4-SWT/SalI；5.6.pCEP4-SIM1/SalI；7.8.pCEP4-SIM2/SalI；9.Marker
图2 pCEP4-HBs系列重组体鉴定图谱
三、PXT1-HBs系列重组体的构建(图3)
pBKS+-S系列重组体经BamHI和XhoI消化后电泳可见2条带，分离纯化得到了其中的约700 bp大小的野生型和突变型S基因片段。PXT1经HindⅢ和BglⅡ消化，分离纯化小片段DNA；同时将PXT1经HindⅢ和XholⅡ消化分离纯化大片段DNA；将两条载体片段与目的基因连接构建得到PXT1-HBs系列重组体。经限制性内切酶HindⅢ分析。PXT1含有1个HindⅢ位点，PXT1-HBs系列重组体含有2个HindⅢ位点，电泳结果与此相符。由此建立了一系列S基因的PXT1表达载体：PXT1-HBs(WT)，PXT1-HBs(IM1)，PXT1-HBs(IM2)。
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1.2.PXT1-SWT/HindⅢ 3.4.PXT1-SIM1/HindⅢ 5.6.PXT1-SIM2/HindⅢ 7.PXT1/HindⅢ 8.1kb Marker
图3 PXT1-S系列重组体的酶切鉴定图谱
四、pCEP4-HBS系列重组体对HepG2细胞的转染
纯化的表达载体pCEP4-HBs DNA转染PA317细胞，用电穿孔法转染HepG2细胞，经潮霉素选择培养3周后获得了一系列稳定的抗性细胞克隆：HepG2/pCEP4,HepG2/pCEP4-HBs(WT),HepG2/pCEP4-HBs(IM1),HepG2/pCEP4-HBs(IM2)。
五、PXT1-HBs系列重组体经PA317包装后对HepG2细胞的感染
纯化的表达载体PXT1-HBs DNA，经G418选择培养获得了一系列抗性细胞克隆：PA317/PXT1，PA317/PXT1-HBs(WT)，PA317/PXT1-HBs(IM1)，PA317/PXT1-HBs(IM2)。其产病毒效价约为7.8～8.9×104。感染HepG2细胞再经G418选择培养获得了一系列稳定的抗性细胞克隆：HepG2/PXT1，HepG2/PXT1-HBs(WT),HepG2/PXT1-HBs(IM1),HepG2/PXT1-HBs(IM2)。
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六、转染细胞系中S基因的转录
变异型和野生型S基因转染的各抗性细胞中的RNA经RT-PCR后均可获得大小与阳性对照S基因片段相当的基因片段(图4)。
1.Marker；2.HepG2/pCEP4；3.HepG2/pCEP4-SWT；4.HepG2/pCEP4-SIM1；5.HepG2/pCEP4-SIM2；6.HepG2/PXT1；7.HepG2/PXT1-SWT；8.HepG2/PXT1-SIM1；9.HepG2/PXT1-SIM2；10.阳性对照(pCEP4-SWT)
图4 细胞基因RT-PCR结果
七、ELISA法分析重组HBsAg的抗原性
, http://www.100md.com 野生型HBsAg可与抗HBs多克隆抗体结合，而两种插入变异型HBsAg不能与抗体结合(表1)。
表1 变异型和野生型HBsAg和抗体的结合反应 细胞上清
A值(492 nm)
HepG2/pCEP4
0.01
HepG2/pCEP4-SWT
0.18
HepG2/pCEP4-IM1
0.01
HepG2/pCEP4-IM2
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0.01
HepG2/PXT1
0.01
HepG2/PXT1-SWT
0.82
HepG2/PXT1-IM1
0.01
HepG2/PXT1-IM2
0.01
cell control(HepG2)
0.01
Medium control(10%Fcs/DM EM)
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0.01
注：阳性对照：0.34，阴性对照：0.02；临界值0.10
八、Western-Blot分析
在27 000处，野生型HBsAg出现特异性蛋白条带，而变异型HBsAg未出现特异性蛋白条带。
讨 论
乙型肝炎病毒基因变异是影响其感染发生发展的重要因素之一。HBsAg与病毒的清除密切相关，其变异可能影响疾病的转归。目前临床研究显示S区的变异热点主要集中于HBsAg的“a”决定簇，如145位及141位的氨基酸替代变异等[7-9]，这些变异与疫苗接种失败及感染慢性化有一定关系。我们已经构建并在真核细胞中表达了HBsAg“a”抗原决定簇的一系列重组突变体，并对其抗原性作了分析[5]，证明了145位的替代变异导致表面抗原与抗HBs的结合力下降。在本实验中，我们利用PCR诱变技术，在体外完成了S区“a”决定簇外的两种插入诱变[4]，即S区第122位与123位氨基酸，123与124位氨基酸间分别插入2个、3个氨基酸。并以pCEP4和PXT1为载体在HepG2细胞中表达变异抗原。各转染细胞系发生了S基因的转录，提示S基因在真核细胞中均发生了表达。同时结果也显示，野生型HBsAg能被抗HBs检测到，而两种变异抗原均不能被抗HBs检知。说明这两种插入变异影响了HBsAg的空间结构，从而使其失去与抗HBs的结合力。说明这两种插入变异具有重要意义，在一定范围内解释了某些HBsAg阴性的慢性HBV感染者的出现。
, 百拇医药
“a”抗原决定簇位于124～147位氨基酸之间，其变异被认为是HBV逃避保护性抗体清除的重要因素。这两株发生于“a”抗原决定簇前的插入变异影响HBsAg与抗HBs的结合力，提示“a”决定簇以外的S区变异也可能影响HBsAg的抗原性，或者说主要抗原决定簇可能不仅限于124～147位氨基酸，可能其空间结构的形成还涉及了此区域外的某些氨基酸特别是紧邻“a”决定簇具有重要空间构型的氨基酸。重组S区插入变异体的构建及其在真核细胞中的表达，为基因免疫及疫苗的研制奠定了基础，同时也为进一步研究这种插入变异的生物学性状等提供了有用的工具。
本课题为国家自然科学基金重点项目及国家教委跨世纪优秀人才基金资助项目(39630280)
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, 百拇医药
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(收稿：1998-06-23 修回：1998-12-01), 百拇医药
单位：400010 重庆医科大学附属第二医院病毒性肝炎研究所
关键词：肝炎表面抗原，乙型；突变，插入；基因表达
中华医学杂志990219 【摘要】 目的 研究与乙型肝炎病毒感染的临床进程相关的两种乙型肝炎表面抗原(HBsAg)插入变异体的免疫学性状，以阐明在HBsAg阴性的慢性乙型肝炎病毒感染中所起的作用。方法 利用体外PCR诱变方法，构建重组HBsAg的插入突变体；借助EB病毒载体pCEP4和逆转录病毒载体PXT1将重组插入变异S基因转染哺乳动物细胞；利用ELISA及Western blot方法，探讨变异抗原与抗HBs的结合力。结果 (1)构建了HBsAg的插入突变体(分别在HBsAg的第122位与123位氨基酸间插入Arg,Ala和第123位与124位氨基酸间插入Arg, Gly, Ala)的真核表达载体；(2)将其转染哺乳动物细胞，最终建立了能表达野生型和变异型HBsAg的HepG2细胞系；(3)这些细胞系能在体外稳定地连续传代培养；(4)野生型HBsAg可与抗HBs结合，变异型HBsAg不能与抗HBs结合。结论 研究表明这两种插入变异体影响了HBsAg的空间结构，从而使其失去与乙型肝炎病毒表面抗体的结合力，因而可能逃避机体的免疫清除而持续存在于体内形成慢性感染。
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Expression of recombinant inserting mutants of HBsAg in vitro and its antigenic analysis GU Baiyan, REN Hong, ZHANG Dingfeng. Institute for Virol Hepatitis, Chongqing Medical University, Chongqing 400010
【Abstract】 Objective To study the immunological characteristics of two inserting variants of HBsAg as further to elucidate the role of inserting mutants in the development of HBsAg-negative chronic hepatitis B. Methods The inserting mutants of HBsAg were constructed by PCR-mediated mutagenesis in vitro. Epstein-Barr virus vector pCEP4 and retrovirus vector PXT1 carrying the mutant genes of HBsAg were transfected into mamalian cells. The affinity of polyclonal and monoclonal antibodies against HBsAg for mutant antigens were studied by ELISA and western blot.Results Two insertions were introduced into s gene, and a six nucleotide insertion introduced two aminoacids (Arg and Ala) between codons 122 and 123 of the s polypeptide, whereas a nine nucleotide insertion introduced three aminoacids(Arg, Gly and Ala) between codons 123 and 124. These s genes were subcloned into two eukaryotic expression vectors (pCEP4 and PXT1), and the recombinant eukaryotic expression plasmids had been constructed, which could express s polypeptide in mammalian cells. Cell lines expressing wild-type or mutant-type HBsAg stably were obtained after transfection of these vectors into mammalian cells. The two inserting variants failed to react with polyclonal and monoclonal antibodies against HBsAg by ELISA and Western blot. Conclusion The insertions may result in a conformational change of the s protein, and affect its antigenicities, suggesting that the inserting mutations may be critical for immunoescape of HBV and in part responsible for chronicity of HBsAg-negative patients.
, http://www.100md.com
【Key words】 Hepatitis B surface antigens Mutagenesis,insertional Genes expression
(Natl Med J China, 1999, 79:139-142)
临床研究显示HBV的S区变异热点主要集中于“a”抗原决定簇编码区，发生于HBsAg“a”抗原决定簇内的变异在一定范围内解释了免疫逃避株的出现及临床意义[1，2]。临床分析发现，30%～40%的HBsAg阴性的慢性乙型肝炎患者血清和肝组织中可用PCR方法检知HBV DNA[3]。新近的研究在2例HBsAg阴性的中国慢性HBV感染者发现了发生于“a”抗原决定簇前的两株新的插入变异株，而同地区的30名HBsAg阳性患者中则未发现类似变异株存在[4]。为深入研究这两种HBsAg插入变异的生物学行为及其临床相关性，本研究利用体外PCR诱变方法，基因重组和真核表达等技术，构建了重组HBsAg的插入突变体；分别以EB病毒载体pCEP4和逆转录病毒载体PXT1为表达载体，在真核细胞上表达了变异抗原，并对其抗原性作了初步分析。
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材料与方法
一、材料
1.质粒载体及菌株：pEcob6, pBluescriptKS+见参考文献[5]；pCEP4,为EB病毒真核表达载体，转化菌TOP10F′(美国In vitroGene公司)；PXT1，为逆转录病毒真核表达载体，转化菌RR1(美国Strategen公司)。
2.限制性核酸内切酶，Taq酶，AMVRT-polymerase及其它修饰酶：均购自德国Boehringer Mannheim公司。
3.质粒DNA提取，RNA提取及基因片段分离：采用德国Qiagen公司及上海华顺公司试剂盒。
二、方法
1.体外PCR诱变：根据HBV野毒株S区基因序列(已测)及相关文献[6]，分别设计两组体外插入诱变的引物，经Pcgene软件分析，由Cybersyn公司合成。以pEcob6为模板，分别利用S区的上游引物和方向与之相反的内侧诱变引物及S区的下游引物和方向与之相反的内侧诱变引物进行两套初级PCR，再将两套初级PCR产物混合，在一定的条件下变性，退火，然后再利用S区的上游引物进行PCR，由此获得的PCR产物中即含有大小约为680bp的已发生插入突变的S基因。详细的步骤见参考文献[6]。S区的两条PCR引物：P1(上游引物)5′GTGAAGCTTATGGAGAACATCGCATCAG3′；P2(下游引物)5′GTTTAAATGTATACCCAAAG3′；插入变异株1(以后简称IM1)的内侧诱变引物：P35′GTTGCCCGTTTGCATGGTCCGGTGCTG3′；P4 5′CAAACGGGCAACCTGCACGACTCCTGC3′；插入变异株2(以后简称 IM2)的内侧诱变引物：P5 5′AGGCGCCCCGTGTTTTGCATGGTCCGGTGCTG3′；P6 5′AACACGGG GCGCCTGCAAGACTCCTGC3′。
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2.诱变产物的克隆及确证性测序：为了确定诱变基因的序列，首先应将其克隆到pBKS+载体以制备单链DNA进行测序。利用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段将所获得的野毒株及变异株S基因片段的3′粘端去除，然后经HindⅢ酶切后纯化，由此可获得一端为平端，另一端为粘端的野毒株及变异株S基因片段；将其克隆到pBluescript KS+载体的SmaⅠ、HindⅢ位点，转化受体菌XL1-Blue。制备质粒DNA，以XbaⅠ作限制性内切酶分析，选择阳性重组质粒。按照常规方法制备单链DNA，用美国USB公司Sequenase Version2.0试剂盒进行测序。
3.野生型及变异型S基因真核表达载体的构建：采用两种真核表达载体表达野生型及变异型S基因，即将野生型及变异型S基因从pBKS+-HBS系列重组体亚克隆到EB病毒真核表达载体pCEP4和逆转录病毒真核表达载体PXT1。将上述HBV S基因野生型和突变型的基因片段经BamHI和Kpn第I位点由pBluescript KS+-HBs定向克隆到真核表达载体pCEP4的相同位点，经限制性内切酶SalI分析，筛选出阳性克隆。用BamHI和XhoI消化pBKS+-HBS系列重组体，分离纯化野生型和突变型S基因片段；PXT1经HindⅢ和BglⅡ消化，分离纯化小片段DNA；同时将PXT1经HindⅢ和XholⅡ消化分离纯化大片段DNA；将两条载体片段与前面制备的目的基因连接后转化受体菌RR1。制备质粒DNA，通过限制性内切酶HindⅢ分析，筛选出阳性克隆。
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4.对HepG2细胞转染：采用电穿孔方法将pCEP4重组体导入HepG2细胞，以潮霉素(Hygromycine B,美国Cal Biochem公司)筛选抗性克隆。
5.对PA317细胞转染：采用电穿孔方法将PXT1重组体导入PA317细胞，以G418(美国Promega公司)筛选抗性克隆。
6.感染HepG2细胞：用含假病毒颗粒的PA317细胞培养上清感染HepG2细胞。
7.HBsAg检测：采用厦门新科公司ELISA检测试剂盒。
8.Western-blot分析：抗HBs单抗及其他相关试剂购自深圳晶美公司。
结 果
一、HBV S区的体外插入诱变(IM1和IM2)及确证性测序
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利用PCR诱变方法将两种插入突变引入S基因，初步PCR产物经电泳鉴定，发现获得了大小为320bp和360bp大小的两条DNA条带，将这两条含突变区的末端部分序列重叠的DNA利用S区外侧引物进行PCR扩增，获得的最终产物中含有大小约为680bp的基因片段。pBKS+载体含有1个XbaI位点，S基因也含有1个XbaI位点，因此重组质粒经XbaI消化后电泳呈现两条DNA带。再经DNA序列分析鉴定(图1)表明两种插入突变已按预先设想引入S基因：IM1，在HBV DNA第519位核苷酸前插入6个核苷酸，即在S基因第122位与123位密码子间插入Arg和Ala的密码子；IM2，在第519位核苷酸后插入9个核苷酸而致HBsAg第123位与124位氨基酸间插入Arg、Gly和Ala。
图1 诱变S基因的确证性测序图谱
二、pCEP4-HBs系列重组体的构建(图2)
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pCEP4含有2个SalI位点，pCEP4-HBs系列重组体含有3个SalI位点，电泳结果与此相符。由此建立了以下一系列S基因的pCEP4表达载体：pCEP4-HBs(WT)，pCEP4-HBs(IM1)，pCEP4-HBs(IM2)。
1.Marker; 2.pCEP4/SalI；3.4.pCEP4-SWT/SalI；5.6.pCEP4-SIM1/SalI；7.8.pCEP4-SIM2/SalI；9.Marker
图2 pCEP4-HBs系列重组体鉴定图谱
三、PXT1-HBs系列重组体的构建(图3)
pBKS+-S系列重组体经BamHI和XhoI消化后电泳可见2条带，分离纯化得到了其中的约700 bp大小的野生型和突变型S基因片段。PXT1经HindⅢ和BglⅡ消化，分离纯化小片段DNA；同时将PXT1经HindⅢ和XholⅡ消化分离纯化大片段DNA；将两条载体片段与目的基因连接构建得到PXT1-HBs系列重组体。经限制性内切酶HindⅢ分析。PXT1含有1个HindⅢ位点，PXT1-HBs系列重组体含有2个HindⅢ位点，电泳结果与此相符。由此建立了一系列S基因的PXT1表达载体：PXT1-HBs(WT)，PXT1-HBs(IM1)，PXT1-HBs(IM2)。
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1.2.PXT1-SWT/HindⅢ 3.4.PXT1-SIM1/HindⅢ 5.6.PXT1-SIM2/HindⅢ 7.PXT1/HindⅢ 8.1kb Marker
图3 PXT1-S系列重组体的酶切鉴定图谱
四、pCEP4-HBS系列重组体对HepG2细胞的转染
纯化的表达载体pCEP4-HBs DNA转染PA317细胞，用电穿孔法转染HepG2细胞，经潮霉素选择培养3周后获得了一系列稳定的抗性细胞克隆：HepG2/pCEP4,HepG2/pCEP4-HBs(WT),HepG2/pCEP4-HBs(IM1),HepG2/pCEP4-HBs(IM2)。
五、PXT1-HBs系列重组体经PA317包装后对HepG2细胞的感染
纯化的表达载体PXT1-HBs DNA，经G418选择培养获得了一系列抗性细胞克隆：PA317/PXT1，PA317/PXT1-HBs(WT)，PA317/PXT1-HBs(IM1)，PA317/PXT1-HBs(IM2)。其产病毒效价约为7.8～8.9×104。感染HepG2细胞再经G418选择培养获得了一系列稳定的抗性细胞克隆：HepG2/PXT1，HepG2/PXT1-HBs(WT),HepG2/PXT1-HBs(IM1),HepG2/PXT1-HBs(IM2)。
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六、转染细胞系中S基因的转录
变异型和野生型S基因转染的各抗性细胞中的RNA经RT-PCR后均可获得大小与阳性对照S基因片段相当的基因片段(图4)。
1.Marker；2.HepG2/pCEP4；3.HepG2/pCEP4-SWT；4.HepG2/pCEP4-SIM1；5.HepG2/pCEP4-SIM2；6.HepG2/PXT1；7.HepG2/PXT1-SWT；8.HepG2/PXT1-SIM1；9.HepG2/PXT1-SIM2；10.阳性对照(pCEP4-SWT)
图4 细胞基因RT-PCR结果
七、ELISA法分析重组HBsAg的抗原性
, http://www.100md.com 野生型HBsAg可与抗HBs多克隆抗体结合，而两种插入变异型HBsAg不能与抗体结合(表1)。
表1 变异型和野生型HBsAg和抗体的结合反应 细胞上清
A值(492 nm)
HepG2/pCEP4
0.01
HepG2/pCEP4-SWT
0.18
HepG2/pCEP4-IM1
0.01
HepG2/pCEP4-IM2
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0.01
HepG2/PXT1
0.01
HepG2/PXT1-SWT
0.82
HepG2/PXT1-IM1
0.01
HepG2/PXT1-IM2
0.01
cell control(HepG2)
0.01
Medium control(10%Fcs/DM EM)
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0.01
注：阳性对照：0.34，阴性对照：0.02；临界值0.10
八、Western-Blot分析
在27 000处，野生型HBsAg出现特异性蛋白条带，而变异型HBsAg未出现特异性蛋白条带。
讨 论
乙型肝炎病毒基因变异是影响其感染发生发展的重要因素之一。HBsAg与病毒的清除密切相关，其变异可能影响疾病的转归。目前临床研究显示S区的变异热点主要集中于HBsAg的“a”决定簇，如145位及141位的氨基酸替代变异等[7-9]，这些变异与疫苗接种失败及感染慢性化有一定关系。我们已经构建并在真核细胞中表达了HBsAg“a”抗原决定簇的一系列重组突变体，并对其抗原性作了分析[5]，证明了145位的替代变异导致表面抗原与抗HBs的结合力下降。在本实验中，我们利用PCR诱变技术，在体外完成了S区“a”决定簇外的两种插入诱变[4]，即S区第122位与123位氨基酸，123与124位氨基酸间分别插入2个、3个氨基酸。并以pCEP4和PXT1为载体在HepG2细胞中表达变异抗原。各转染细胞系发生了S基因的转录，提示S基因在真核细胞中均发生了表达。同时结果也显示，野生型HBsAg能被抗HBs检测到，而两种变异抗原均不能被抗HBs检知。说明这两种插入变异影响了HBsAg的空间结构，从而使其失去与抗HBs的结合力。说明这两种插入变异具有重要意义，在一定范围内解释了某些HBsAg阴性的慢性HBV感染者的出现。
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“a”抗原决定簇位于124～147位氨基酸之间，其变异被认为是HBV逃避保护性抗体清除的重要因素。这两株发生于“a”抗原决定簇前的插入变异影响HBsAg与抗HBs的结合力，提示“a”决定簇以外的S区变异也可能影响HBsAg的抗原性，或者说主要抗原决定簇可能不仅限于124～147位氨基酸，可能其空间结构的形成还涉及了此区域外的某些氨基酸特别是紧邻“a”决定簇具有重要空间构型的氨基酸。重组S区插入变异体的构建及其在真核细胞中的表达，为基因免疫及疫苗的研制奠定了基础，同时也为进一步研究这种插入变异的生物学性状等提供了有用的工具。
本课题为国家自然科学基金重点项目及国家教委跨世纪优秀人才基金资助项目(39630280)
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(收稿：1998-06-23 修回：1998-12-01), 百拇医药