内皮素反义寡核苷酸在抑制大鼠肾小球系膜细胞和系膜基质增生中的作用
作者：李美花 谌贻璞 张志文 范英鲜
单位：100034 北京医科大学第一医院肾内科[李美花(现在中国人民解放军总医院老年心肾科)]；中日友好医院肾内科(谌贻璞)；北京医科大学生理学系(张志文)；中国人民解放军总医院老年心肾科(范英鲜)
关键词：寡核苷酸类，反义；内皮缩血管肽类；肾小球肾炎
中华医学杂志990217 【摘要】 目的 研究内皮素-1(ET-1)在体内系膜细胞和系膜基质增生中的作用。方法 应用反义寡核苷酸技术，将前内皮素原的反义寡核苷酸作为ET-1基因表达的特异抑制剂，同时设立正义寡核苷酸和错配寡核苷酸作为对照序列(每组3只大鼠)。(1)在大鼠抗Thy1.1系膜增生性肾小球肾炎模型中，以阳离子脂质体介导的基因转移方法，将各种寡核苷酸链分别导入大鼠肾脏。通过生物素修饰的反义寡核苷酸显色反应，了解寡核苷酸链的体内转移效果。(2)用放射免疫分析方法分析反义、正义，错配寡核苷酸对肾小球ET-1蛋白量的影响；用定量病理分析方法观察反义、正义，错配寡核苷酸对系膜细胞和系膜基质增生的作用。结果 (1)寡核苷酸链能够进入肾小球系膜细胞。(2)反义寡核苷酸降低了肾小球的ET-1蛋白水平[(32±19) ng/g，对照组(126±20) ng/g]，抑制了系膜细胞增生[(0.82±0.04)个/100 μm2]和系膜基质增生(12.8±1.6)%，而正义和错配寡核苷酸不影响肾小球的ET-1蛋白水平或系膜细胞和系膜基质的病变。结论 抑制ET-1基因表达能够抑制肾炎大鼠系膜细胞和系膜基质增生，ET-1是刺激体内系膜细胞和系膜基质增生的重要炎症介质之一。
, 百拇医药
Inhibition of mesangial cell proliferation and mesangial matrix expansion by antisense oligodeoxynucleotide targeting preproendothelin-1 mRNA in vivo LI Meihua, CHEN Yipu, ZHANG Zhiwen, et al. Division of Nephrology, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To investigate the effect of endothelin-1 (ET-1) on mesangial cells(MC) proliferation and mesangial matrix expansion in vivo. Methods Antisense oligodeoxynucleotide(As-ODN) and its control sequences, sense oligodeoxynucleotide(Se-ODN) and mismatch oligodeoxynucleotide(Mis-ODN),targeting preproendothelin-1 mRNA (ppET-1) were delivered into the kidney of rats with mesangioproliferative glomerulonephritis (MsPGN) model respectively at day 2 by lipofectin-mediated gene transfer method. The efficiency of transfer of ODNs into MC was examined with biotinylated As-ODN staining. Four days after the rats were sacrificed, the influence of ODNs on ET-1 production by glomeruli was tested with radioimmunoassay(RIA). The action of ODNs on MC proliferation and mesangial matrix expansion was evaluated with quantitative pathologic analysis. Results ODNs were transferred into MC in vivo. The glomerular ET-1 production was decreased by As-ODN [(32±19) ng/g, P<0.05] with reduction of mesangial cell proliferation[(0.82±0.04)/100 μm2，P<0.05] and mesangial matrix expansion[(12.8±1.6)%, P<0.05], where Se-ODN and Mis-ODN did not show any effect on all of these. Conclusions Specific inhibition of ET-1 gene expression leads to reduction of proliferation of mesangial cell and expansion of mesangial matrix in rats with MsPGN model. ET-1 is one of the important inflammatory mediators which can stimulate MC proliferation and mesangial matrix expansion in vivo.
, 百拇医药
【Key words】 Oligodeoxynucleotides，antisense Endothelin Glomerularnephritis
(Natl Med J China, 1999, 79:133-135)
内皮素-1(ET-1)不仅是强烈的缩血管多肽，而且是一个强炎症介质，在许多炎症反应中起重要作用[1]。以往的体外实验研究证实，不仅外源的ET-1是肾小球系膜细胞的致有丝分裂原[2，3]，而且ET-1是系膜细胞的自分泌因子，能够介导系膜细胞自身的增生[4]。但是，ET-1是否在肾小球肾炎的发生和发展过程中发挥致病作用，仍然缺乏确凿的实验依据。因此，我们在大鼠抗Thy1.1系膜增生性肾小球肾炎模型中，将前内皮素原的反义寡核苷酸作为ET-1基因表达的特异抑制剂进行抑制试验，探讨ET-1在体内对系膜细胞和系膜基质增生中的效应。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料
1.大鼠抗Thy1.1系膜增生性肾小球肾炎模型的建立：选雄性6～8周龄的Wistar大鼠(北京医科大学第一附属医院动物室)进行试验。于尾静脉单次注入小鼠抗大鼠Thy1.1单克隆抗体每100 g体重4 mg，(注射日作为0天，次日为第1天)。所建立的模型具备系膜增生性肾小球肾炎的病理改变特征。
2.寡核苷酸链的设计和合成：前内皮素原的反义寡核苷酸链序列是5′-GGG AAA ATA ATC CAT-3′，靶序列是前内皮素原 mRNA中含AUG起始位点的15个核苷酸，其特异性已在平滑肌细胞得到证实[5]。为了除外反义寡核苷酸可能的非特异作用，设立了对照序列，分别是正义寡核苷酸链和错配寡核苷酸链。正义的序列是：5′-ATG GAT TAT TTT CCC-3′，错配的序列是：5′-GGT AAC ATA ATT CAT-3′。错配寡核苷酸的序列运用Blast程序[6]在GenBank数据库进行同源性检索，无同源序列。为了检测寡核苷酸链的体内转移效果，部分反义寡核苷酸的5′端用生物素修饰。上述各寡核苷酸链两端各两个碱基的磷酸二酯键被硫化修饰，由美国Cybersyn公司合成。
, 百拇医药
二、方法
1.寡核苷酸链的体内转移：以阳离子脂质体介导的基因转移方法，进行寡核苷酸链的体内转移。在2天的实验大鼠中进行，每组3只大鼠。操作过程如下：氯胺酮1 mg/kg肌内注射麻醉大鼠，切开腹壁，暴露腹主动脉及肾动脉，动脉夹夹住双肾动脉分支之前的腹主动脉，左肾动脉穿刺，将寡核苷酸链各0.5 mg分别与阳离子脂质体0.4 mg混合，缓慢注射至左肾，局部明胶海棉止血，10分钟内松开动脉夹，关腹，大鼠继续饲养。
2.寡核苷酸链转移效果的检测：将生物素标记的反义寡核苷酸按上法转移，1小时后取肾组织进行显色观察。步骤如下：肾组织常规固定、切片(4 μm)，60 ℃烤1小时，用纯甲醇和3%过氧化氢处理15分钟以封闭内源性过氧化氢酶，滴加辣根过氧化物酶标记的链亲合素(1∶200，PBS稀释)37℃孵育30分钟。然后用3%过氧化氢二氨基联苯胺(DAB)显色10分钟，自来水充分冲洗。同一只大鼠未转移生物素反义寡核苷酸时取得的肾组织作为阴性对照同时染色。
, 百拇医药
3.效应观察：大鼠于转移寡核苷酸链后4天，即大鼠模型6天时断颈处死取左肾。(1)放射免疫分析(RIA)分析肾小球ET-1蛋白水平：过筛法提取肾小球，制成匀浆，离心(10 000 r/min，10分钟)，吸取上清，按RIA试剂盒(中国人民解放军总医院东亚免疫所)方法检测ET-1含量。ET-1的RIA值用上清的蛋白量(改良微量Lowry法)校正；(2)病理定量分析：肾组织常规固定、切片，运用真彩色医学图像分析系统(IBAS 2000型)，以4 μm的PASM+HE染色切片计数100 μm2 的毛细血管襻面积的系膜细胞数；以4 μm的PAS染色切片计算系膜区PAS染色阳性面积占毛细血管襻面积的百分数，即相对系膜基质面积。
4.统计学分析：各组数据为均数±标准差表示，多组均数分析用F检验，组间两两比较用q检验。
结 果
1.生物素标记的反义寡核苷酸染色结果：在阳离子脂质体携带下，经肾动脉注射1小时时，反义寡核苷酸能够到达肾小球系膜区，进入系膜细胞，同时反义寡核苷酸也到达肾间质，而肾小管未见反义寡核苷酸的阳性显色(图1)。同等条件下进行染色的对照肾组织呈阴性。
, 百拇医药
图1 生物素修饰的反义寡核苷酸体内转移后染色阳性(褐色)着色LAB法 ×200
2.放射免疫分析结果：经前内皮素原的反义寡核苷酸处理的大鼠，其肾小球ET-1蛋白水平明显降低(P<0.05)，而经正义寡核苷酸链和错配寡核苷酸链处理的大鼠，其肾小球的ET-1蛋白量与对照组比较无明显变化(P>0.05，表1)。
表1 寡核苷酸对肾炎大鼠肾小球各指标的影响(
±s) 组别
鼠数
ET-1蛋白量(ng/g)
系膜细胞数(个/100 μm2)
系膜基质指数(%)
, 百拇医药
对照组
3
126±20
1.02±0.20
31.1±3.2
反义组
3
32±19*
0.82±0.04*
12.8±1.6*
正义组
3
, 百拇医药
110±19
1.01±0.02
29.7±2.6
错配组
3
128±13
1.06±0.19
29.4±2.2
F值
12.89
49.61
45.64
P值
, 百拇医药
0.016
0.000
0.000
* 与对照组比较P<0.05
3.病理检查及定量图像分析：经反义寡核苷酸治疗的肾炎大鼠，6天时的系膜细胞增生显著受到抑制，系膜基质增生减轻，而经正义寡核苷酸链和错配寡核苷酸链治疗的大鼠，系膜细胞和系膜基质增生均无显著变化(图2、表1)。
注：左上：对照组(MsPGN 6天)系膜细胞和系膜基质增生 右上：反义寡核苷酸链组系膜细胞和系膜基质增生减轻 左下：正义寡核苷酸链组系膜细胞和系膜基质增生 右下：错配寡核苷酸链组系膜细胞和系膜基质增生
, http://www.100md.com
图2 寡核苷酸链对肾小球肾炎大鼠病理改变的影响 PASM+HE ×400
讨 论
抑制试验是一种重要的研究手段，在探讨炎症介质的致病效应方面具有不可替代的作用。而体内抑制试验则使人们能够清晰地了解某一炎症介质在整体条件下的致病作用。反义技术的发展，使体内特异抑制某一特定基因的表达成为现实。
本组观察寡核苷酸的体内转移效果，与文献报UTHP的结果相仿[7]。Oberbauer等[8]经静脉途径转移的反义寡核苷酸5小时时大部分浓集于肾小管，而本组经肾动脉注射的反义寡核苷酸，没有明显的肾小管分布，可能本组实验观察的时间较短(1小时)，还未到反义寡核苷酸到达肾小管的高峰时间。
硫化修饰的寡核苷酸经静脉注射后4天，肾组织中的寡核苷酸链仍然完整[8]，据此估计反义寡核苷酸在肾脏中的作用应能持续4天，故于反义寡核苷酸转移后第4天，即系膜细胞和系膜基质增生达到高峰的第6天，经反义寡核苷酸处理的大鼠，肾小球的ET-1蛋白浓度显著减少，系膜细胞和系膜基质的增生明显减轻。系膜细胞增生和系膜基质增多，是增生性肾小球肾炎的重要特征。此结果提示，ET-1是刺激体内系膜细胞和系膜基质增生的重要炎症介质之一，可能在人类肾小球肾炎发病机理中具有重要作用。
, 百拇医药
反义寡核苷酸技术尽管在动物实验中显示了其应用效果，但是，诸多未解决的难题限制了它在疾病治疗中的应用前景。肾炎发病机理涉及复杂的炎症介质网络，仅以单个炎症介质为靶基因的基因干预可能难以明显奏效；目前仍然缺乏高效、可控的基因转移方法；反义寡核苷酸的体内代谢及其近、远期毒性作用的资料尚不完善。以上都是现阶段没有克服的问题。但是，反义寡核苷酸技术作为基因治疗的方法之一，仍然在研究和探索之中。
本课题为国家自然科学基金赞助项目(39470334)
参考文献
1 谌贻璞.炎症细胞与炎症介质.见：王海燕，主编.肾脏病学.第2版.北京：人民卫生出版社，1996.477-478.
2 马利军，谌贻璞，高进，等.内皮素对肾小球系膜细胞炎症效应的作用.肾脏病与透析肾移植杂志, 1993，2：17-19.
, 百拇医药
3 Sun YJ, Chen YP, Lu XY, et al. Inflammatory effects of endothelin-1 on human mesangial cells.Kidney Int , 1995,48:603.
4 Li MH, Chen YP. Thrombin induced proliferation of cultured human mesangial cell partially via Endothelin-1. Nephrology, 1997,3(suppl 1)：S484.
5 Ito H, Hiroe M, Hirata Y, et al.Endothelin-1 as an autocrine factor in hypertrophy of cardiomyocytes. Jap Cir J, 1992,56 (suppl 5):1314-1318.
, 百拇医药
6 Altshul SF, Gish W, Miller W. Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 1990,215:403-405.
7 Akagi Y, Isaka Y, Arai M, et al. Inhibition of TGF β1 expression by antisense oligonucleotides suppressed extracellular matrix accumulation in experimental glomerulonephritis. Kidney Int, 1996,50:148-155.
8 Oberbauer R, Schriner GF,Meyer TW,et al. Renal uptake of an 18-mer phosphorothioated oligonucleotide. Kidney Int, 1995,48:1226-1229.
(收稿：1998-03-16 修回：1998-10-28), http://www.100md.com
单位：100034 北京医科大学第一医院肾内科[李美花(现在中国人民解放军总医院老年心肾科)]；中日友好医院肾内科(谌贻璞)；北京医科大学生理学系(张志文)；中国人民解放军总医院老年心肾科(范英鲜)
关键词：寡核苷酸类，反义；内皮缩血管肽类；肾小球肾炎
中华医学杂志990217 【摘要】 目的 研究内皮素-1(ET-1)在体内系膜细胞和系膜基质增生中的作用。方法 应用反义寡核苷酸技术，将前内皮素原的反义寡核苷酸作为ET-1基因表达的特异抑制剂，同时设立正义寡核苷酸和错配寡核苷酸作为对照序列(每组3只大鼠)。(1)在大鼠抗Thy1.1系膜增生性肾小球肾炎模型中，以阳离子脂质体介导的基因转移方法，将各种寡核苷酸链分别导入大鼠肾脏。通过生物素修饰的反义寡核苷酸显色反应，了解寡核苷酸链的体内转移效果。(2)用放射免疫分析方法分析反义、正义，错配寡核苷酸对肾小球ET-1蛋白量的影响；用定量病理分析方法观察反义、正义，错配寡核苷酸对系膜细胞和系膜基质增生的作用。结果 (1)寡核苷酸链能够进入肾小球系膜细胞。(2)反义寡核苷酸降低了肾小球的ET-1蛋白水平[(32±19) ng/g，对照组(126±20) ng/g]，抑制了系膜细胞增生[(0.82±0.04)个/100 μm2]和系膜基质增生(12.8±1.6)%，而正义和错配寡核苷酸不影响肾小球的ET-1蛋白水平或系膜细胞和系膜基质的病变。结论 抑制ET-1基因表达能够抑制肾炎大鼠系膜细胞和系膜基质增生，ET-1是刺激体内系膜细胞和系膜基质增生的重要炎症介质之一。
, 百拇医药
Inhibition of mesangial cell proliferation and mesangial matrix expansion by antisense oligodeoxynucleotide targeting preproendothelin-1 mRNA in vivo LI Meihua, CHEN Yipu, ZHANG Zhiwen, et al. Division of Nephrology, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To investigate the effect of endothelin-1 (ET-1) on mesangial cells(MC) proliferation and mesangial matrix expansion in vivo. Methods Antisense oligodeoxynucleotide(As-ODN) and its control sequences, sense oligodeoxynucleotide(Se-ODN) and mismatch oligodeoxynucleotide(Mis-ODN),targeting preproendothelin-1 mRNA (ppET-1) were delivered into the kidney of rats with mesangioproliferative glomerulonephritis (MsPGN) model respectively at day 2 by lipofectin-mediated gene transfer method. The efficiency of transfer of ODNs into MC was examined with biotinylated As-ODN staining. Four days after the rats were sacrificed, the influence of ODNs on ET-1 production by glomeruli was tested with radioimmunoassay(RIA). The action of ODNs on MC proliferation and mesangial matrix expansion was evaluated with quantitative pathologic analysis. Results ODNs were transferred into MC in vivo. The glomerular ET-1 production was decreased by As-ODN [(32±19) ng/g, P<0.05] with reduction of mesangial cell proliferation[(0.82±0.04)/100 μm2，P<0.05] and mesangial matrix expansion[(12.8±1.6)%, P<0.05], where Se-ODN and Mis-ODN did not show any effect on all of these. Conclusions Specific inhibition of ET-1 gene expression leads to reduction of proliferation of mesangial cell and expansion of mesangial matrix in rats with MsPGN model. ET-1 is one of the important inflammatory mediators which can stimulate MC proliferation and mesangial matrix expansion in vivo.
, 百拇医药
【Key words】 Oligodeoxynucleotides，antisense Endothelin Glomerularnephritis
(Natl Med J China, 1999, 79:133-135)
内皮素-1(ET-1)不仅是强烈的缩血管多肽，而且是一个强炎症介质，在许多炎症反应中起重要作用[1]。以往的体外实验研究证实，不仅外源的ET-1是肾小球系膜细胞的致有丝分裂原[2，3]，而且ET-1是系膜细胞的自分泌因子，能够介导系膜细胞自身的增生[4]。但是，ET-1是否在肾小球肾炎的发生和发展过程中发挥致病作用，仍然缺乏确凿的实验依据。因此，我们在大鼠抗Thy1.1系膜增生性肾小球肾炎模型中，将前内皮素原的反义寡核苷酸作为ET-1基因表达的特异抑制剂进行抑制试验，探讨ET-1在体内对系膜细胞和系膜基质增生中的效应。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料
1.大鼠抗Thy1.1系膜增生性肾小球肾炎模型的建立：选雄性6～8周龄的Wistar大鼠(北京医科大学第一附属医院动物室)进行试验。于尾静脉单次注入小鼠抗大鼠Thy1.1单克隆抗体每100 g体重4 mg，(注射日作为0天，次日为第1天)。所建立的模型具备系膜增生性肾小球肾炎的病理改变特征。
2.寡核苷酸链的设计和合成：前内皮素原的反义寡核苷酸链序列是5′-GGG AAA ATA ATC CAT-3′，靶序列是前内皮素原 mRNA中含AUG起始位点的15个核苷酸，其特异性已在平滑肌细胞得到证实[5]。为了除外反义寡核苷酸可能的非特异作用，设立了对照序列，分别是正义寡核苷酸链和错配寡核苷酸链。正义的序列是：5′-ATG GAT TAT TTT CCC-3′，错配的序列是：5′-GGT AAC ATA ATT CAT-3′。错配寡核苷酸的序列运用Blast程序[6]在GenBank数据库进行同源性检索，无同源序列。为了检测寡核苷酸链的体内转移效果，部分反义寡核苷酸的5′端用生物素修饰。上述各寡核苷酸链两端各两个碱基的磷酸二酯键被硫化修饰，由美国Cybersyn公司合成。
, 百拇医药
二、方法
1.寡核苷酸链的体内转移：以阳离子脂质体介导的基因转移方法，进行寡核苷酸链的体内转移。在2天的实验大鼠中进行，每组3只大鼠。操作过程如下：氯胺酮1 mg/kg肌内注射麻醉大鼠，切开腹壁，暴露腹主动脉及肾动脉，动脉夹夹住双肾动脉分支之前的腹主动脉，左肾动脉穿刺，将寡核苷酸链各0.5 mg分别与阳离子脂质体0.4 mg混合，缓慢注射至左肾，局部明胶海棉止血，10分钟内松开动脉夹，关腹，大鼠继续饲养。
2.寡核苷酸链转移效果的检测：将生物素标记的反义寡核苷酸按上法转移，1小时后取肾组织进行显色观察。步骤如下：肾组织常规固定、切片(4 μm)，60 ℃烤1小时，用纯甲醇和3%过氧化氢处理15分钟以封闭内源性过氧化氢酶，滴加辣根过氧化物酶标记的链亲合素(1∶200，PBS稀释)37℃孵育30分钟。然后用3%过氧化氢二氨基联苯胺(DAB)显色10分钟，自来水充分冲洗。同一只大鼠未转移生物素反义寡核苷酸时取得的肾组织作为阴性对照同时染色。
, 百拇医药
3.效应观察：大鼠于转移寡核苷酸链后4天，即大鼠模型6天时断颈处死取左肾。(1)放射免疫分析(RIA)分析肾小球ET-1蛋白水平：过筛法提取肾小球，制成匀浆，离心(10 000 r/min，10分钟)，吸取上清，按RIA试剂盒(中国人民解放军总医院东亚免疫所)方法检测ET-1含量。ET-1的RIA值用上清的蛋白量(改良微量Lowry法)校正；(2)病理定量分析：肾组织常规固定、切片，运用真彩色医学图像分析系统(IBAS 2000型)，以4 μm的PASM+HE染色切片计数100 μm2 的毛细血管襻面积的系膜细胞数；以4 μm的PAS染色切片计算系膜区PAS染色阳性面积占毛细血管襻面积的百分数，即相对系膜基质面积。
4.统计学分析：各组数据为均数±标准差表示，多组均数分析用F检验，组间两两比较用q检验。
结 果
1.生物素标记的反义寡核苷酸染色结果：在阳离子脂质体携带下，经肾动脉注射1小时时，反义寡核苷酸能够到达肾小球系膜区，进入系膜细胞，同时反义寡核苷酸也到达肾间质，而肾小管未见反义寡核苷酸的阳性显色(图1)。同等条件下进行染色的对照肾组织呈阴性。
, 百拇医药
图1 生物素修饰的反义寡核苷酸体内转移后染色阳性(褐色)着色LAB法 ×200
2.放射免疫分析结果：经前内皮素原的反义寡核苷酸处理的大鼠，其肾小球ET-1蛋白水平明显降低(P<0.05)，而经正义寡核苷酸链和错配寡核苷酸链处理的大鼠，其肾小球的ET-1蛋白量与对照组比较无明显变化(P>0.05，表1)。
表1 寡核苷酸对肾炎大鼠肾小球各指标的影响(
±s) 组别鼠数
ET-1蛋白量(ng/g)
系膜细胞数(个/100 μm2)
系膜基质指数(%)
, 百拇医药
对照组
3
126±20
1.02±0.20
31.1±3.2
反义组
3
32±19*
0.82±0.04*
12.8±1.6*
正义组
3
, 百拇医药
110±19
1.01±0.02
29.7±2.6
错配组
3
128±13
1.06±0.19
29.4±2.2
F值
12.89
49.61
45.64
P值
, 百拇医药
0.016
0.000
0.000
* 与对照组比较P<0.05
3.病理检查及定量图像分析：经反义寡核苷酸治疗的肾炎大鼠，6天时的系膜细胞增生显著受到抑制，系膜基质增生减轻，而经正义寡核苷酸链和错配寡核苷酸链治疗的大鼠，系膜细胞和系膜基质增生均无显著变化(图2、表1)。
注：左上：对照组(MsPGN 6天)系膜细胞和系膜基质增生 右上：反义寡核苷酸链组系膜细胞和系膜基质增生减轻 左下：正义寡核苷酸链组系膜细胞和系膜基质增生 右下：错配寡核苷酸链组系膜细胞和系膜基质增生
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图2 寡核苷酸链对肾小球肾炎大鼠病理改变的影响 PASM+HE ×400
讨 论
抑制试验是一种重要的研究手段，在探讨炎症介质的致病效应方面具有不可替代的作用。而体内抑制试验则使人们能够清晰地了解某一炎症介质在整体条件下的致病作用。反义技术的发展，使体内特异抑制某一特定基因的表达成为现实。
本组观察寡核苷酸的体内转移效果，与文献报UTHP的结果相仿[7]。Oberbauer等[8]经静脉途径转移的反义寡核苷酸5小时时大部分浓集于肾小管，而本组经肾动脉注射的反义寡核苷酸，没有明显的肾小管分布，可能本组实验观察的时间较短(1小时)，还未到反义寡核苷酸到达肾小管的高峰时间。
硫化修饰的寡核苷酸经静脉注射后4天，肾组织中的寡核苷酸链仍然完整[8]，据此估计反义寡核苷酸在肾脏中的作用应能持续4天，故于反义寡核苷酸转移后第4天，即系膜细胞和系膜基质增生达到高峰的第6天，经反义寡核苷酸处理的大鼠，肾小球的ET-1蛋白浓度显著减少，系膜细胞和系膜基质的增生明显减轻。系膜细胞增生和系膜基质增多，是增生性肾小球肾炎的重要特征。此结果提示，ET-1是刺激体内系膜细胞和系膜基质增生的重要炎症介质之一，可能在人类肾小球肾炎发病机理中具有重要作用。
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反义寡核苷酸技术尽管在动物实验中显示了其应用效果，但是，诸多未解决的难题限制了它在疾病治疗中的应用前景。肾炎发病机理涉及复杂的炎症介质网络，仅以单个炎症介质为靶基因的基因干预可能难以明显奏效；目前仍然缺乏高效、可控的基因转移方法；反义寡核苷酸的体内代谢及其近、远期毒性作用的资料尚不完善。以上都是现阶段没有克服的问题。但是，反义寡核苷酸技术作为基因治疗的方法之一，仍然在研究和探索之中。
本课题为国家自然科学基金赞助项目(39470334)
参考文献
1 谌贻璞.炎症细胞与炎症介质.见：王海燕，主编.肾脏病学.第2版.北京：人民卫生出版社，1996.477-478.
2 马利军，谌贻璞，高进，等.内皮素对肾小球系膜细胞炎症效应的作用.肾脏病与透析肾移植杂志, 1993，2：17-19.
, 百拇医药
3 Sun YJ, Chen YP, Lu XY, et al. Inflammatory effects of endothelin-1 on human mesangial cells.Kidney Int , 1995,48:603.
4 Li MH, Chen YP. Thrombin induced proliferation of cultured human mesangial cell partially via Endothelin-1. Nephrology, 1997,3(suppl 1)：S484.
5 Ito H, Hiroe M, Hirata Y, et al.Endothelin-1 as an autocrine factor in hypertrophy of cardiomyocytes. Jap Cir J, 1992,56 (suppl 5):1314-1318.
, 百拇医药
6 Altshul SF, Gish W, Miller W. Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 1990,215:403-405.
7 Akagi Y, Isaka Y, Arai M, et al. Inhibition of TGF β1 expression by antisense oligonucleotides suppressed extracellular matrix accumulation in experimental glomerulonephritis. Kidney Int, 1996,50:148-155.
8 Oberbauer R, Schriner GF,Meyer TW,et al. Renal uptake of an 18-mer phosphorothioated oligonucleotide. Kidney Int, 1995,48:1226-1229.
(收稿：1998-03-16 修回：1998-10-28), http://www.100md.com