中国南方鼻咽鳞状细胞癌与EB病毒感染的关系＊
作者：Zong Yongsheng 宗永生1 Zhang Jinxia 张锦霞1 Chan KwokHung 陈国雄2 Yung Chunwai 容振威 2Middeldorp, J.M.3 and Ng Munhon 吴文翰2
单位：
关键词：鼻咽肿瘤；Epstein-Barr病毒；鳞状细胞癌；溶解性感染
癌症/990203
【摘要】目的：探讨BCR介导B淋巴细胞凋亡的作用机制。方法：光镜观察细胞形态。3H-TdR掺入法检测细胞生长。应用FACS：(1)Annexin V法检测细胞凋亡，(2)PI染色分析细胞周期。结果：IgM影响Daud细胞的生长，改变细胞形态，镜下可见类似细胞凋亡样变化。高浓度IgM明显抑制其生长。Annexin V分析显示IgM刺激可导致Daudi细胞发生凋亡；凋亡的发生存在时间上的规律性，在IgM刺激后的48～72小时，细胞凋亡最多；极高浓度IgM导致细胞迅速凋亡。DNA含量分析显示，凋亡发生在G1期和S期两群细胞比值相差最大时。结论：IgM可诱导Daudi细胞凋亡，细胞不能通过G1→S的检测点很可能是细胞凋亡发生的重要原因之一。
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中图号：R733 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)02-0121-05
Apoptosis induced by IgM in human B lymphoma Daudi cell line
ZHANG Fan ZHU Hong xia QUAN Lan ping et al
Laboratory of Cellular and Molecular Biology,Cancer Institute,Chinese Academy of
Medical Sciences,Beijing 100021,China
【Abstract】 Purpose:To investigate the mechanism of apoptosis in human B lymphoma Daudi cell line mediated by B cell antigen receptor(BCR).Method:Observing the cell morphology change by microscope .Cell growth were analyzed by 3H-TdR incorporation.Using fluorescence activated cell sorter (FACS)for:(1)detecting cell apoptosis with Annexin V;(2)analyzing cell cycle by propidium iodide (PI)staining.Pesult:IgM induced Daudi cell growth arrest and morphology change. At high concentration,IgM significantly inhibited cell growth.Annexin V analysis demonstrated that cell apoptosis was triggered by IgM and most of the cells went to apotosis during 48～ 72h after stimulation by IgM.At ultimate high concentration, IgM triggered cell apoptosis more quickly. DNA content analysis showed that cell apoptosis occurred when the ratio of G1 and S phase cclls reached to maximum.Conclusion:IgM can induce Daudi cell apoptosis and this may be resulted from a failure to progress through a G1→S checkpoint(s).
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Key words:Apoptosis;Human B lymphoma;Cell cycle
自70年代以来，人们就认识到细胞凋亡在肿瘤的发生、发展中扮演着重要角色。肿瘤的发生，是由于细胞增殖与细胞凋亡平衡失调的结果[1]。细胞凋亡在肿瘤生长过程中起负调控作用，可以阻遏肿瘤迅速生长。人们在肿瘤治疗的长期实践中，逐渐认识到可以通过诱导肿瘤细胞凋亡，以达到治疗肿瘤的目的。而且，能否诱导肿瘤细胞的凋亡很可能是决定化疗效果的重要因素之一。
B淋巴细胞是人体免疫系统的重要组成部分。B淋巴细胞发育时需经过正负选择，正相选择结果是B淋巴细胞活化，为机体提供参与免疫应答的正常B淋巴细胞。负相选择则导致B淋巴细胞凋亡，是免疫应答时驱除自身反应性B细胞的基本机制。抗原刺激B细胞的活化，依赖于抗原与其表面的抗原受体复合物(Bcell antigen receptor，BCR)的结合[2]。BCR介导B淋巴细胞凋亡是近年免疫学研究的热点。虽然对其进行了大量研究[3-6]，但发生机制仍未完全明了。本研究应用人B淋巴瘤Daudi细胞，观察BCR介导Daudi细胞生物学行为的改变，探讨其发生机制，以期很好地认识B淋巴细胞恶性肿瘤发生、发展的分子机制以及探讨可能的治疗肿瘤的新途径。
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1 材料与方法
1.1 试剂
兔抗人IgM抗体购自DAKO公司(Code No.A0426)。3H-TdR购自杜邦公司。Annexin V试剂盒为Genzyme公司产品。碘化丙啶(PI)购自华美生物制品公司。
1.2 细胞系及培养
Daudi细胞是人B细胞淋巴瘤细胞株(从ATCC引入)，20%胎牛血清的RPMI1640，5%CO237℃孵箱中培养。
1.3 3H-TdR掺入法
接种约1×106/ml细胞于96孔板中，分别用血清浓度为0和10%的RPMI1640培养，并加入终浓度为0～200μg/ml的IgM抗体，分别刺激48小时和72小时。于终止培养前12小时，加入3H-TdR，收集细胞，液体闪烁仪检测CPM。
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1.4 Annexin V法
接种约1×106/ml细胞于24孔板中，血清浓度为10%的RPMI1640培养，并加入IgM抗体，分别于指定时间800～1000转/分，室温离心5～10分钟，收集细胞，取1/2细胞用于本方法(另1/2细胞用于下述1.5PI染色分析)。冷PBS洗涤细胞一次，将细胞重悬于100μml Annexin V孵育缓冲液中(10×Binding buffer 10μl+PI 10μl+Annexin V conjugate 1μl+79μl去离子水)，于暗室中孵育15分钟。再加入400μl结合缓冲液(10×Binding buffer40μl+360μl去离子水)。一小时内用FACS测试，用FL1/FL2软件分析结果。
1.5 PI染色法分析细胞凋亡和细胞周期
1.4项中处理的1/2细胞，收集于离心管中，800～1000转/分离心5分钟，共两次。冷PBS洗涤细胞一次，加入200μlRNaseA(1mg/ml)，37℃水浴30分钟。再加入800μlPI染色液(PI100μg/ml，Triton-x 1001.0%,NaCl0.9%)，混匀，至4℃避光30分钟。FACS检测，记录激发波长488nm处的红色荧光。结果用细胞周期拟合软件进行分析。
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2. 结果
2.1 IgM对Daudi细胞形态改变和生长的作用
人B淋巴瘤细胞系Daudi细胞能否对IgM刺激有所应答，首先取决于膜表面IgM受体的存在状况。间接免疫荧光标记后，FACS结果表明，95%以上的Daudi细胞表面存在大量IgM受体。所以，本研究应用该细胞系，观察BCR介导B淋巴瘤细胞生物学的反应，探讨其发生的机制。大量研究发现正常成熟的B淋巴细胞经抗原受体介导，极低浓度的IgM(1μg/ml)即可引起B细胞发生凋亡[7]。但Daudi细胞的生物学反应不尽相同。3H-TdR掺入结果表明，低浓度(<20μg/ml)IgM刺激下，无血清对照组和10%血清组均无明显变化；而提高Igm浓度(≥20μg/ml)，二组细胞CPM值均呈现显著下降(图1)表明高浓度IgMI可明显抑制其生长(细胞死亡数>细胞增殖数的结果。)
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图1 IgM对Daudi细胞生长的影响
光镜观察，二组细胞刺激后形态改变基本相同。加入IgM刺激数小时后，细胞于平皿中分布不均匀，成团状生长。24小时已观察到团状生长的细胞中，存在部分皱缩和形态不规则的细胞(图2a,2b)。至48～72小时，大量细胞呈死亡状态。而且随IgM浓度的升高，形态改变的细胞更多、更严重。这种形态学的改变与凋亡细胞相似，提示IgM可能具有诱导Daudi细胞凋亡的作用。
图2 IgM刺激后Daudi细胞生长状态和形态的改变
a.对照; b.200μg/mlIgM刺激24小时
2.2 IgM诱导Daudi细胞凋亡
为进一步证实上述镜下观察结果，应用FACS检测，进行Annexin V法和PI染色法同时分析。Annexin V结果显示，200μg/ml IgM刺激Daudi细胞72小时，约50%的细胞发生早期凋亡，对照组72小时未见凋亡发生(图3a)。PI染色DNA含量分析亦表明，实验组于72小时大量细胞发生凋亡，于G0/G1峰前出现一个小于2CDNA含量的区域，称为亚G1峰，而对照组未见亚G1峰(图3b)，结果表明IgM可诱导Daudi细胞发生凋亡。
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图3 FACS分析IgM引起Daudi细胞的凋亡
a.Annexin V分析；b.PI染色分析
(注：1=坏死细胞；2=晚期凋亡；3=存活细胞；4=早期凋亡)
2.3 IgM诱导Daudi细胞凋亡与细胞周期的关系
为探讨凋亡发生的机制，进一步应用Annexin V方法分析IgM刺激Daudi细胞发生凋亡的时间，并用PI染色法分析凋亡发生与细胞周期的关系。Annexin V结果可见，加入IgM后，大量细胞凋亡发生在48～72小时，而24小时内未见明显凋亡发生(图4a)。DNA含量分析显示，此阶段(48～72小时)G0/G1期和S期细胞数量比率差值最大(图4b)。48小时S期细胞增多，而72小时S期明显下降，G0/G1显著增高(表1)。显示凋亡的发生存在时间上的规律性。
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图4 IgM引起Daudi细胞凋亡和细胞周期的变化
a, b分别是Annexin V和PI染色分析200μg/mlIgM
刺激Daudi细胞凋亡和细胞周期；
C.Annexin V分析1000μg/mlIgM刺激Daudi细胞凋亡
(注：1=坏死细胞；2=晚期凋亡；3=存活细胞；4=早期凋亡)
表1 IgM引起Daudi细胞周期各期的变化和细胞凋亡 时间
(小时)
细胞周期(%)
凋亡
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细胞(%)
G0/G1
S
G2/M
0(h)
46.4
41.5
12.1
0.2
24
38.3
47.2
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14.5
1.8
48
25.9
55.5
18.8
18.0
72
55.6
23.0
21.4
48.7
极高浓度(1000μg/mlIgM)刺激仅2小时，细胞就开始发生凋亡；并随时间的延长凋亡细胞数迅速增多。12小时前，早期凋亡细胞呈倍数增长；而后，早期凋亡细胞数增长缓慢，晚期凋亡细胞呈倍数增长(图4c)，并无上述200μg/mlIgM诱发凋亡发生的时间规律性。IgM引起Daudi细胞凋亡发生的时间与浓度有关，提示IgM刺激信号的强弱可能影响细胞周期调控蛋白表达，通过阻止细胞进入细胞周期；或细胞虽进入细胞周期，但不能通过G1期向S期的转换，从而引起细胞凋亡。
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3.讨论
本文结果表明，IgM可诱导Daudi细胞凋亡。Annexin V法分析200μg/ml IgM刺激Daudi细胞凋亡，显示凋亡发生时间存在规律性，于48～72小时凋亡最多；而且凋亡发生与细胞周期也存在相关性，主要发生在G1和S期细胞数比率差别较大时段。虽然不能排除发生凋亡的细胞来自于不能进入细胞周期的细胞群；但大量观察支持48～72小时出现的大量凋亡来自一个活化的细胞群，并可能位于G1期即将进入S期的检测点处，即G1检测点。支持这一推测的原因是，第一，IgM刺激的细胞显示活化状态，如细胞团的形成，进入S期细胞呈中等水平等；第二，凋亡细胞碎片和皱缩的细胞包围着活化细胞；第三，凋亡主要发生在48～72小时，此时其它存活细胞均已或开始进入S期；第四，非常高比率的存活细胞死于调亡而未进入S期等。1000μg/ml IgM刺激的结果说明，IgM引起凋亡发生的时间与其浓度相关。IgM刺激可能激活细胞周期调控蛋白。在细胞周期的早期，则可能通过阻止细胞由G1期进入S期，而导致凋亡。当IgM浓度低时，信号弱，未引起相关蛋白活化或活化较弱，大部分细胞可通过并完成1～2个细胞周期；再进入细胞周期时，由于IgM信号的持续刺激或某些信号的消失，使大部分细胞未能通过G1检测点而发生凋亡。因为从本室其它相关的实验中发现，IgM刺激后48～72小时，许多被激活的、呈现磷酸化的酪氨酸蛋白分子已回复到低磷酸化或去磷酸化的静止状态，而如果IgM浓度高，信号强，可迅速活化一系列相关蛋白，(待发表，张帆等.IgM诱导人B淋巴瘤Daudi细胞凋亡的信号传导通路研究)使大量细胞阻止于G1期检测点外，导致凋亡，(如1000μg/ml IgM组的结果)。这些结果支持Meichers等[8]的推论，B细胞生长主要是在细胞周期检测点上被精确的调控。并推测在对抗原发生免疫应答的过程中，在通过G1期进入S期的检测点时发生失败而导致凋亡。
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另外，进入凋亡的这群活化的细胞可能是负调控分子的表达水平增高或对抗原受体的去敏化，任何一种机制均将导致LgM信号降低，该信号可能是细胞赖以生存和通过G1期检测点进入S期所需要的。而且这种mIg信号可能是细胞周期调控蛋白定时出现和消失的关键。其它研究还推测[9]，无效的BCR信号传导可能导致细胞周期蛋白的无效调控，并进入凋亡通路。还有一种可能是持续的信号刺激是细胞生存而维持适当bcl-bax活化水平所需要的[10]。
本研究还发现，引起Daudi细胞凋亡的IgM浓度远远高于相关报道(1μg/ml)[7]，而且多是早期凋亡。晚期凋亡只在极高IgM浓度组存在，提示Daudi细胞存在较强的抗凋亡机制，这可能也是低浓度IgM刺激未见明显凋亡发生，高浓度组(200μg/ml组)仅见早期凋亡，只在极高浓度(1000μg/ml组)刺激时才可见晚期凋亡的发生。
总之，细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)及其抑制物(CDI)和检测点是细胞周期调控的重要分子基础，只有通过各调节因子彼此间相互作用、相互协调的动态平衡，细胞周期方得以正常进行。任何一类调节因子过多或过少，过度激活或灭活等，都会破坏相互间的平衡，影响细胞正常功能。进一步认识那些凋亡相关蛋白参与了IgM诱导的Daudi细胞凋亡，以及阐述凋亡发生的细胞周期时相与细胞周期调控蛋白的关系，将是探索新的B淋巴细胞肿瘤治疗途径的理论基础。
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基金项目：本课题受国家人事部1997年度非教育系统留学回国人员科研活动D类经费资助
※通讯作者
参考文献
1 Cerard Evan,Trevor Littlewood. A matter of life and cell death〔J〕.Science,1998， 281： 1317～ 1321.
2 Idan Tamir,John C.Cambier.Antigen receptor signaling:inte-gration of protein tyrosine kinase functions〔J〕.Oncogene,1998,17:1353～ 1364.
3 Graves JD, Draves EK,Craxton A,et al. A comparison of signaling requirements for apoptosis of human B lymphocytes induced by the B cell receptor and CD95/Fas〔J〕.Journal of Immunology,1998,161～ 174.
, http://www.100md.com
4 Schauer SL, Bellas RE, Sonenshein GE,et al.Dominant signals leading to inhibitor κ B protein degradation mediated CD40 ligand rescue of WEHI 231 immature B cells fron receptor-mediated apoptosis〔J〕.Journal of Immunology,1998,160:4398～ 4405.
5 Sutherland Cl, Health AW,Pelech SL, et al. Differential activation of the ERK,JNK,and p38 mitogen-activated protein kinases by CD40 and the B cell antigen receptor〔J〕.Joumal of Immunology,1996,157:3381～ 3390.
, http://www.100md.com
6 Xia Z, Dickens M,Raingeand J,et al. Opposing effects of ERK and JNK-p38 Map kinases on apoptosis〔J〕.Science,1995,270:1326～ 1631.
7 Graves JD,Draves KE. Involvement of stress-activated protein kinases and p38 mitogen-activated protein kinases in mIgM-induced apoptosis of human B lymphocytes〔J〕.Processing National Academic Sciences USA, 1996,93:13814～ 13818.
8 Melchers F,Lermhardt W.Three restriction points in the cell cycle of activated murine B lymphocytes〔J〕.Processing National Academic Sciences USA,1985,82:7681～ 7685.
, http://www.100md.com
9 Brorson K,Brunswick M,Ezhevsky S. Xid affects events leading to B cell cycle entry〔J〕.Jourmal of Immunology,1997,159： 135～ 43.
10 Solvason N, Wu WW,Kabra N,et al. Transgene expression of bcl-X1 permits anti-immunoglobulin (Ig)-induced proliferation in xid B cells〔J〕.Journal Experimental Medicine,1998,187:1081～ 1091.
收稿日期：1999-03-15, http://www.100md.com
单位：
关键词：鼻咽肿瘤；Epstein-Barr病毒；鳞状细胞癌；溶解性感染
癌症/990203
【摘要】目的：探讨BCR介导B淋巴细胞凋亡的作用机制。方法：光镜观察细胞形态。3H-TdR掺入法检测细胞生长。应用FACS：(1)Annexin V法检测细胞凋亡，(2)PI染色分析细胞周期。结果：IgM影响Daud细胞的生长，改变细胞形态，镜下可见类似细胞凋亡样变化。高浓度IgM明显抑制其生长。Annexin V分析显示IgM刺激可导致Daudi细胞发生凋亡；凋亡的发生存在时间上的规律性，在IgM刺激后的48～72小时，细胞凋亡最多；极高浓度IgM导致细胞迅速凋亡。DNA含量分析显示，凋亡发生在G1期和S期两群细胞比值相差最大时。结论：IgM可诱导Daudi细胞凋亡，细胞不能通过G1→S的检测点很可能是细胞凋亡发生的重要原因之一。
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Apoptosis induced by IgM in human B lymphoma Daudi cell line
ZHANG Fan ZHU Hong xia QUAN Lan ping et al
Laboratory of Cellular and Molecular Biology,Cancer Institute,Chinese Academy of
Medical Sciences,Beijing 100021,China
【Abstract】 Purpose:To investigate the mechanism of apoptosis in human B lymphoma Daudi cell line mediated by B cell antigen receptor(BCR).Method:Observing the cell morphology change by microscope .Cell growth were analyzed by 3H-TdR incorporation.Using fluorescence activated cell sorter (FACS)for:(1)detecting cell apoptosis with Annexin V;(2)analyzing cell cycle by propidium iodide (PI)staining.Pesult:IgM induced Daudi cell growth arrest and morphology change. At high concentration,IgM significantly inhibited cell growth.Annexin V analysis demonstrated that cell apoptosis was triggered by IgM and most of the cells went to apotosis during 48～ 72h after stimulation by IgM.At ultimate high concentration, IgM triggered cell apoptosis more quickly. DNA content analysis showed that cell apoptosis occurred when the ratio of G1 and S phase cclls reached to maximum.Conclusion:IgM can induce Daudi cell apoptosis and this may be resulted from a failure to progress through a G1→S checkpoint(s).
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Key words:Apoptosis;Human B lymphoma;Cell cycle
自70年代以来，人们就认识到细胞凋亡在肿瘤的发生、发展中扮演着重要角色。肿瘤的发生，是由于细胞增殖与细胞凋亡平衡失调的结果[1]。细胞凋亡在肿瘤生长过程中起负调控作用，可以阻遏肿瘤迅速生长。人们在肿瘤治疗的长期实践中，逐渐认识到可以通过诱导肿瘤细胞凋亡，以达到治疗肿瘤的目的。而且，能否诱导肿瘤细胞的凋亡很可能是决定化疗效果的重要因素之一。
B淋巴细胞是人体免疫系统的重要组成部分。B淋巴细胞发育时需经过正负选择，正相选择结果是B淋巴细胞活化，为机体提供参与免疫应答的正常B淋巴细胞。负相选择则导致B淋巴细胞凋亡，是免疫应答时驱除自身反应性B细胞的基本机制。抗原刺激B细胞的活化，依赖于抗原与其表面的抗原受体复合物(Bcell antigen receptor，BCR)的结合[2]。BCR介导B淋巴细胞凋亡是近年免疫学研究的热点。虽然对其进行了大量研究[3-6]，但发生机制仍未完全明了。本研究应用人B淋巴瘤Daudi细胞，观察BCR介导Daudi细胞生物学行为的改变，探讨其发生机制，以期很好地认识B淋巴细胞恶性肿瘤发生、发展的分子机制以及探讨可能的治疗肿瘤的新途径。
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1 材料与方法
1.1 试剂
兔抗人IgM抗体购自DAKO公司(Code No.A0426)。3H-TdR购自杜邦公司。Annexin V试剂盒为Genzyme公司产品。碘化丙啶(PI)购自华美生物制品公司。
1.2 细胞系及培养
Daudi细胞是人B细胞淋巴瘤细胞株(从ATCC引入)，20%胎牛血清的RPMI1640，5%CO237℃孵箱中培养。
1.3 3H-TdR掺入法
接种约1×106/ml细胞于96孔板中，分别用血清浓度为0和10%的RPMI1640培养，并加入终浓度为0～200μg/ml的IgM抗体，分别刺激48小时和72小时。于终止培养前12小时，加入3H-TdR，收集细胞，液体闪烁仪检测CPM。
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1.4 Annexin V法
接种约1×106/ml细胞于24孔板中，血清浓度为10%的RPMI1640培养，并加入IgM抗体，分别于指定时间800～1000转/分，室温离心5～10分钟，收集细胞，取1/2细胞用于本方法(另1/2细胞用于下述1.5PI染色分析)。冷PBS洗涤细胞一次，将细胞重悬于100μml Annexin V孵育缓冲液中(10×Binding buffer 10μl+PI 10μl+Annexin V conjugate 1μl+79μl去离子水)，于暗室中孵育15分钟。再加入400μl结合缓冲液(10×Binding buffer40μl+360μl去离子水)。一小时内用FACS测试，用FL1/FL2软件分析结果。
1.5 PI染色法分析细胞凋亡和细胞周期
1.4项中处理的1/2细胞，收集于离心管中，800～1000转/分离心5分钟，共两次。冷PBS洗涤细胞一次，加入200μlRNaseA(1mg/ml)，37℃水浴30分钟。再加入800μlPI染色液(PI100μg/ml，Triton-x 1001.0%,NaCl0.9%)，混匀，至4℃避光30分钟。FACS检测，记录激发波长488nm处的红色荧光。结果用细胞周期拟合软件进行分析。
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2. 结果
2.1 IgM对Daudi细胞形态改变和生长的作用
人B淋巴瘤细胞系Daudi细胞能否对IgM刺激有所应答，首先取决于膜表面IgM受体的存在状况。间接免疫荧光标记后，FACS结果表明，95%以上的Daudi细胞表面存在大量IgM受体。所以，本研究应用该细胞系，观察BCR介导B淋巴瘤细胞生物学的反应，探讨其发生的机制。大量研究发现正常成熟的B淋巴细胞经抗原受体介导，极低浓度的IgM(1μg/ml)即可引起B细胞发生凋亡[7]。但Daudi细胞的生物学反应不尽相同。3H-TdR掺入结果表明，低浓度(<20μg/ml)IgM刺激下，无血清对照组和10%血清组均无明显变化；而提高Igm浓度(≥20μg/ml)，二组细胞CPM值均呈现显著下降(图1)表明高浓度IgMI可明显抑制其生长(细胞死亡数>细胞增殖数的结果。)
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图1 IgM对Daudi细胞生长的影响
光镜观察，二组细胞刺激后形态改变基本相同。加入IgM刺激数小时后，细胞于平皿中分布不均匀，成团状生长。24小时已观察到团状生长的细胞中，存在部分皱缩和形态不规则的细胞(图2a,2b)。至48～72小时，大量细胞呈死亡状态。而且随IgM浓度的升高，形态改变的细胞更多、更严重。这种形态学的改变与凋亡细胞相似，提示IgM可能具有诱导Daudi细胞凋亡的作用。
图2 IgM刺激后Daudi细胞生长状态和形态的改变
a.对照; b.200μg/mlIgM刺激24小时
2.2 IgM诱导Daudi细胞凋亡
为进一步证实上述镜下观察结果，应用FACS检测，进行Annexin V法和PI染色法同时分析。Annexin V结果显示，200μg/ml IgM刺激Daudi细胞72小时，约50%的细胞发生早期凋亡，对照组72小时未见凋亡发生(图3a)。PI染色DNA含量分析亦表明，实验组于72小时大量细胞发生凋亡，于G0/G1峰前出现一个小于2CDNA含量的区域，称为亚G1峰，而对照组未见亚G1峰(图3b)，结果表明IgM可诱导Daudi细胞发生凋亡。
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图3 FACS分析IgM引起Daudi细胞的凋亡
a.Annexin V分析；b.PI染色分析
(注：1=坏死细胞；2=晚期凋亡；3=存活细胞；4=早期凋亡)
2.3 IgM诱导Daudi细胞凋亡与细胞周期的关系
为探讨凋亡发生的机制，进一步应用Annexin V方法分析IgM刺激Daudi细胞发生凋亡的时间，并用PI染色法分析凋亡发生与细胞周期的关系。Annexin V结果可见，加入IgM后，大量细胞凋亡发生在48～72小时，而24小时内未见明显凋亡发生(图4a)。DNA含量分析显示，此阶段(48～72小时)G0/G1期和S期细胞数量比率差值最大(图4b)。48小时S期细胞增多，而72小时S期明显下降，G0/G1显著增高(表1)。显示凋亡的发生存在时间上的规律性。
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图4 IgM引起Daudi细胞凋亡和细胞周期的变化
a, b分别是Annexin V和PI染色分析200μg/mlIgM
刺激Daudi细胞凋亡和细胞周期；
C.Annexin V分析1000μg/mlIgM刺激Daudi细胞凋亡
(注：1=坏死细胞；2=晚期凋亡；3=存活细胞；4=早期凋亡)
表1 IgM引起Daudi细胞周期各期的变化和细胞凋亡 时间
(小时)
细胞周期(%)
凋亡
, 百拇医药
细胞(%)
G0/G1
S
G2/M
0(h)
46.4
41.5
12.1
0.2
24
38.3
47.2
, 百拇医药
14.5
1.8
48
25.9
55.5
18.8
18.0
72
55.6
23.0
21.4
48.7
极高浓度(1000μg/mlIgM)刺激仅2小时，细胞就开始发生凋亡；并随时间的延长凋亡细胞数迅速增多。12小时前，早期凋亡细胞呈倍数增长；而后，早期凋亡细胞数增长缓慢，晚期凋亡细胞呈倍数增长(图4c)，并无上述200μg/mlIgM诱发凋亡发生的时间规律性。IgM引起Daudi细胞凋亡发生的时间与浓度有关，提示IgM刺激信号的强弱可能影响细胞周期调控蛋白表达，通过阻止细胞进入细胞周期；或细胞虽进入细胞周期，但不能通过G1期向S期的转换，从而引起细胞凋亡。
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3.讨论
本文结果表明，IgM可诱导Daudi细胞凋亡。Annexin V法分析200μg/ml IgM刺激Daudi细胞凋亡，显示凋亡发生时间存在规律性，于48～72小时凋亡最多；而且凋亡发生与细胞周期也存在相关性，主要发生在G1和S期细胞数比率差别较大时段。虽然不能排除发生凋亡的细胞来自于不能进入细胞周期的细胞群；但大量观察支持48～72小时出现的大量凋亡来自一个活化的细胞群，并可能位于G1期即将进入S期的检测点处，即G1检测点。支持这一推测的原因是，第一，IgM刺激的细胞显示活化状态，如细胞团的形成，进入S期细胞呈中等水平等；第二，凋亡细胞碎片和皱缩的细胞包围着活化细胞；第三，凋亡主要发生在48～72小时，此时其它存活细胞均已或开始进入S期；第四，非常高比率的存活细胞死于调亡而未进入S期等。1000μg/ml IgM刺激的结果说明，IgM引起凋亡发生的时间与其浓度相关。IgM刺激可能激活细胞周期调控蛋白。在细胞周期的早期，则可能通过阻止细胞由G1期进入S期，而导致凋亡。当IgM浓度低时，信号弱，未引起相关蛋白活化或活化较弱，大部分细胞可通过并完成1～2个细胞周期；再进入细胞周期时，由于IgM信号的持续刺激或某些信号的消失，使大部分细胞未能通过G1检测点而发生凋亡。因为从本室其它相关的实验中发现，IgM刺激后48～72小时，许多被激活的、呈现磷酸化的酪氨酸蛋白分子已回复到低磷酸化或去磷酸化的静止状态，而如果IgM浓度高，信号强，可迅速活化一系列相关蛋白，(待发表，张帆等.IgM诱导人B淋巴瘤Daudi细胞凋亡的信号传导通路研究)使大量细胞阻止于G1期检测点外，导致凋亡，(如1000μg/ml IgM组的结果)。这些结果支持Meichers等[8]的推论，B细胞生长主要是在细胞周期检测点上被精确的调控。并推测在对抗原发生免疫应答的过程中，在通过G1期进入S期的检测点时发生失败而导致凋亡。
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另外，进入凋亡的这群活化的细胞可能是负调控分子的表达水平增高或对抗原受体的去敏化，任何一种机制均将导致LgM信号降低，该信号可能是细胞赖以生存和通过G1期检测点进入S期所需要的。而且这种mIg信号可能是细胞周期调控蛋白定时出现和消失的关键。其它研究还推测[9]，无效的BCR信号传导可能导致细胞周期蛋白的无效调控，并进入凋亡通路。还有一种可能是持续的信号刺激是细胞生存而维持适当bcl-bax活化水平所需要的[10]。
本研究还发现，引起Daudi细胞凋亡的IgM浓度远远高于相关报道(1μg/ml)[7]，而且多是早期凋亡。晚期凋亡只在极高IgM浓度组存在，提示Daudi细胞存在较强的抗凋亡机制，这可能也是低浓度IgM刺激未见明显凋亡发生，高浓度组(200μg/ml组)仅见早期凋亡，只在极高浓度(1000μg/ml组)刺激时才可见晚期凋亡的发生。
总之，细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)及其抑制物(CDI)和检测点是细胞周期调控的重要分子基础，只有通过各调节因子彼此间相互作用、相互协调的动态平衡，细胞周期方得以正常进行。任何一类调节因子过多或过少，过度激活或灭活等，都会破坏相互间的平衡，影响细胞正常功能。进一步认识那些凋亡相关蛋白参与了IgM诱导的Daudi细胞凋亡，以及阐述凋亡发生的细胞周期时相与细胞周期调控蛋白的关系，将是探索新的B淋巴细胞肿瘤治疗途径的理论基础。
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基金项目：本课题受国家人事部1997年度非教育系统留学回国人员科研活动D类经费资助
※通讯作者
参考文献
1 Cerard Evan,Trevor Littlewood. A matter of life and cell death〔J〕.Science,1998， 281： 1317～ 1321.
2 Idan Tamir,John C.Cambier.Antigen receptor signaling:inte-gration of protein tyrosine kinase functions〔J〕.Oncogene,1998,17:1353～ 1364.
3 Graves JD, Draves EK,Craxton A,et al. A comparison of signaling requirements for apoptosis of human B lymphocytes induced by the B cell receptor and CD95/Fas〔J〕.Journal of Immunology,1998,161～ 174.
, http://www.100md.com
4 Schauer SL, Bellas RE, Sonenshein GE,et al.Dominant signals leading to inhibitor κ B protein degradation mediated CD40 ligand rescue of WEHI 231 immature B cells fron receptor-mediated apoptosis〔J〕.Journal of Immunology,1998,160:4398～ 4405.
5 Sutherland Cl, Health AW,Pelech SL, et al. Differential activation of the ERK,JNK,and p38 mitogen-activated protein kinases by CD40 and the B cell antigen receptor〔J〕.Joumal of Immunology,1996,157:3381～ 3390.
, http://www.100md.com
6 Xia Z, Dickens M,Raingeand J,et al. Opposing effects of ERK and JNK-p38 Map kinases on apoptosis〔J〕.Science,1995,270:1326～ 1631.
7 Graves JD,Draves KE. Involvement of stress-activated protein kinases and p38 mitogen-activated protein kinases in mIgM-induced apoptosis of human B lymphocytes〔J〕.Processing National Academic Sciences USA, 1996,93:13814～ 13818.
8 Melchers F,Lermhardt W.Three restriction points in the cell cycle of activated murine B lymphocytes〔J〕.Processing National Academic Sciences USA,1985,82:7681～ 7685.
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9 Brorson K,Brunswick M,Ezhevsky S. Xid affects events leading to B cell cycle entry〔J〕.Jourmal of Immunology,1997,159： 135～ 43.
10 Solvason N, Wu WW,Kabra N,et al. Transgene expression of bcl-X1 permits anti-immunoglobulin (Ig)-induced proliferation in xid B cells〔J〕.Journal Experimental Medicine,1998,187:1081～ 1091.
收稿日期：1999-03-15, http://www.100md.com