肝细胞癌患者和献血员中庚型肝炎病毒感染检测分析
作者：姚春斓 周元平 李刚 陈涛 黄育昌 彭文伟
单位：姚春斓 周元平 李刚 彭文伟 中山医科大学附属第三医院传染科(广州，510630)；陈涛 中山医科大学附属孙逸仙纪念医院(广州，510120)；黄育昌 中山医科大学附属肿瘤防冶中心(广州·510060)
关键词：肝细胞癌；献血员；庚型肝炎病毒；聚合酶链反应
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【摘要】目的：调查庚型肝炎病毒(HGV)在肝细胞癌(HCC)患者中的感染情况。方法：采用蛋白酶K裂解法提取血清中HGVRNA，逆转录为cDNA后进行巢式聚合酶链反应，获得238bp的特异性片段者为阳性结果。用此技术对145例HCC患者、69例献血员和304例体检者(正常人群)血清进行了检测分析。结果：145例HCC患者中有21例HGVRNA阳性(14.5%)，均为男性患者。献血员69例有2例HGVRNA阳性(2.9%)，正常人群304例有2例HGVRNA阳性(0.7%)。结论：HCC患者中HGV感染率明显高于献血员和正常人群，提示HGV与HCC发生相关。
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中图号：R512-63 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)02-0136-03
An analysis of HGV infection status among HCC patinets and donors
YAP Chun-lan ZHOU Yuan-ping LI Guang, et al.
Departmetn of Infectious Diseases, The Thired Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of
Medical Sciences, Guangzhou 510630,China
【Abstract】 Purpose： To investigate the hepatitis G virus (HGV) infection status among hepatocellular carcinoma (HCC) patients donors and normal persons. Methods： Proteinase K digestion method was used to extract HGV RNA in sera. RT-nested PCR technique was applied to amplify the 238 bp HGV genome fragment. Serum specimens of 145 cases of HCC, 69 donors and 304 normal persons have been tested. Results： HGV RNA was positive in (1) 21 (14.5% ) male patients out of 145 cases of HCC, (2) 2 (2.9% ) out of 304 normal individuals, and (3) 2(0.7% ) out of 69 normal blood donors. Conclusion： Positive rate of HGV RNA in HCC patients was significant higher than that in donors and normal persons, and suggested that HGV infection might be related with HCC.
, 百拇医药
Key words： Hepatocellular carcinoma; Donor; Hepatitis G, virus; Polymerase chain reaction
为了探讨庚型肝炎病毒(HGV)在肝细胞癌(HCC)患者中的感染情况，我们应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术[1]检测了145例HCC患者血清中的HGV-RNA，现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 标本来源
145例血清标本采自中山医科大学附属肿瘤医院及孙逸仙纪念医院住院的HCC病人。其中男132例，女13例。均经手术取材病理确诊为HCC。另取69例献血员及东莞市幼儿园到高中学生正常人群共304例血清作检测对照。血清标本用消毒离心管分装，在-20℃以下保存。
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1.2 血清肝炎病毒标志物的检测
HBsAg、HBeAg、抗HBe、抗HBc采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测，试剂均为卫生部核准产品，按说明书操作并判断结果。
1.3 HGV RNA检测试剂
RNA酶抑制剂(RNasin)，AMV反转录酶，TaqDNA聚合酶等均购自丰华公司。引物根据Gen Ban K中GBV-C序列(U36380)，HGV PNF 2161株序列(U44402)及HGV R 10291株序列(U45966)，在5′端非编码区(NCR)，挑选三株序列相同的区段设计，计位按HGVPNF2161株，序列如下；G15′ATGCGTATGACAGGGTTGG3(+)(117-136，按PNF216株位置，下同)；G25′TAGGTGGCCCCATGCATTTCC3(-)(451-471)：G35′GGTAGCCACTATAGGTGGGT3(+)(161-180)：G45′CACTGGTCCTTGTCAACTCG3(-)(379-398)。G1、G2为外引物，G3、G4为内引物，位于5′NCR，巢式扩增后产物为238bp。
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1.4 方法
RT-PCR采用蛋白酶K裂解法制备RNA模板，取待检血清标本及阳性对照标本各50μl分别加入裂解液5μl(主要成份为蛋白酶K)，55℃ 30 min 95℃ 15 min。11000 rpm离心5 min，取裂解上清5μl进行逆转录，逆转录反应体积10μl，内含引物G2100ng，AMV逆转录酶10单位，0.25mmol/L dNTP 2μl，RNasin 8单位，5×buffer 2μl，42℃ 45 min。第一次PCR反应体积为20μl，含逆转录液10μl，引物G1 100ng，G2 100ng，0.25mmol/LdNTP 4μl，10×buffer 2μl，TaqDNA聚合酶0.4单位，在94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 40sec，循环30次，72℃延伸反应7min。第二次PCR反应体积为20μl，内含第一次PCR反应液5μl，引物G3100ng,G4100ng, 10×buffer 2μl,TaqDNA聚合酶0.4U，循环条件同第一次PCR，循环30次。取10μl产物在含溴化己锭的2%琼脂糖凝胶中电泳，与分子量标准作对照，在紫外线灯下观察结果。
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2 结果
经两次扩增后的产物在2%琼脂糖凝胶中电泳后可见单一条带，与阳性对照标本的扩增条带一致，为238 bp。如附图。
附图 HGV经RTnestedPCR后电泳结果
1-4 为检测标本(其中3、4观察到阳性产物)，5 为阴性对照，6 为阳性对照，7 为100 bpDNA Ladder (GIBCOBRL)
在145例HCC患者血清标本中，共发现21例HGVRNA阳性，均为男性患者。其中HBsAg阳性病例为130例。HBsAg阴性15例。HBsAg阴性、阳性与HGVRNA阴性、阳性的关系见表1。
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表1 肝癌患者HGV感染与乙型病毒性肝炎的关系
组别
例数
HGV RNA
+
(%)
-
(%)
HBsAg(+)
130
19
(14.62)
111
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(85.38)
HBsAg(-)
15
2
(13.33)
13
(86.67)
合计
145
21
(14.48)
124
(85.52)
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我们在检测69例献血员及304例正常人群的血清中，发现献血员有2例、正常人群也有2例HGVRNA阳性。HCC病人的HGV感染率明显高于正常人群。结果如表2。表2 肝癌患者与献血员及正常人群HGV感染比较
组别
例数
HGV RNA+(%)
(1)HCC
145
21(14.5)
(2)献血员
69
2(2.9)
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(3)正常人
304
2(0.7)
3 讨论
近年来世界各地对HGV感染的研究逐渐深入[2～4]，研究的手段多以HGVRNA的检测为主，因为至今尚无其他可靠的免疫学方法可确定HGV的现症感染。以往我们多采用热变性法(主要成份为2—疏基乙醇)制备模板，现改用蛋白酶K裂解粗提RNA，用此方法后条带清晰，HGV重复扩增较好。我们对145份HCC患者血清检测出21例、69份献血员血清检测出2例、304份正常人群血清检测出2例HGVRNA阳性，均经二次实验证实。
HGV男女均可感染，在本实验中，13例女性病人HGVRNA无一例阳性，这可能与女性HCC患者检测例数较少有关。在我国，HCC的发病率男多于女，曾有报道[1，5]HCC男女比例为1∶3～8。在本组21例HGVRNA阳性的男性肝癌病人中，HBsAg阳性的HCC患者HGV感染19例(14.6%)，其中HBsAg、抗HBe、抗HBc阳性17例，HBsAg、抗HBe阳性2例。15例HBsAg阴性的HCC患者HGV感染2例(13.3%)，这两例患者丙肝均为阴性，两者结果没有统计学差异，可能与HBsAg阴性的HCC患者例数少有关。曾有报道[6]乙型肝炎重叠HGV的感染率达37%，由于HGV的传播途径与HBV和HCV的传播途径及流行情况类似[7]，主要通过输血、血制品和注射途径感染。有报道[8]HGV感染者体内病毒复制可能持续存在。是否HGV与HBV均有协同的致癌作用?从本研究来说，没有证据表明HGV在HCC发生中起着重要作用，只是HCC病人HGV感染率明显高于献血员和正常人群。
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基金项目：广东省自然科学基金和CMB部分资助课题(NO：93852)
参考文献
1 周元平，彭文伟，姚集鲁.肝癌组织中丙型和乙型肝炎病毒基因状况研究〔J〕.中华肝脏病杂志，1995，3(4)：202.
2 Linnen J, Wages J, Zhang K Z Y, et al. Molecular cloning and disease assoiation of hepatitis G virus： a transfusion transmissible agent〔J〕. Science, 1996, 271:505.
3 Zhao X P, Yang X P. Histological evidence on the relation of hepatocrllular carcinoma to hepatitis B ,C and G virus infection 〔J〕. Gastroenterol Hepatol, 1997, 12 (suppl):s99.
, 百拇医药
4 Nakatsuji Y, Shih J W K, Tanaka E, et al. Prevatenec and disease association of hepatitis G virus infection in Japan〔J〕. J Viral Hepatitis. 1996, 3:307.
5 汤钊猷.原发性肝癌〔A〕.见：汤钊猷主编.现代肿瘤学〔M〕.上海医科大学出版社，1993：554.
6 黄爱龙，张建军，曾维群.重庆地区HGVRNA检测及部分序列分析〔J〕.中华肝脏病杂志，1997，3(5)：5.
7 李刚，姚集鲁，陈青，等.一种新型肝炎病人—庚型肝炎病毒的cDNA克隆〔J〕.中山医科大学学报，1996，17(3)：237.
8 张定凤.庚型肝炎研究的现状〔J〕.中华肝脏病杂志，1997，3(5)：1.
收稿日期：1997-12-12 修回日期：1998-01-07, 百拇医药
单位：姚春斓 周元平 李刚 彭文伟 中山医科大学附属第三医院传染科(广州，510630)；陈涛 中山医科大学附属孙逸仙纪念医院(广州，510120)；黄育昌 中山医科大学附属肿瘤防冶中心(广州·510060)
关键词：肝细胞癌；献血员；庚型肝炎病毒；聚合酶链反应
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【摘要】目的：调查庚型肝炎病毒(HGV)在肝细胞癌(HCC)患者中的感染情况。方法：采用蛋白酶K裂解法提取血清中HGVRNA，逆转录为cDNA后进行巢式聚合酶链反应，获得238bp的特异性片段者为阳性结果。用此技术对145例HCC患者、69例献血员和304例体检者(正常人群)血清进行了检测分析。结果：145例HCC患者中有21例HGVRNA阳性(14.5%)，均为男性患者。献血员69例有2例HGVRNA阳性(2.9%)，正常人群304例有2例HGVRNA阳性(0.7%)。结论：HCC患者中HGV感染率明显高于献血员和正常人群，提示HGV与HCC发生相关。
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中图号：R512-63 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)02-0136-03
An analysis of HGV infection status among HCC patinets and donors
YAP Chun-lan ZHOU Yuan-ping LI Guang, et al.
Departmetn of Infectious Diseases, The Thired Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of
Medical Sciences, Guangzhou 510630,China
【Abstract】 Purpose： To investigate the hepatitis G virus (HGV) infection status among hepatocellular carcinoma (HCC) patients donors and normal persons. Methods： Proteinase K digestion method was used to extract HGV RNA in sera. RT-nested PCR technique was applied to amplify the 238 bp HGV genome fragment. Serum specimens of 145 cases of HCC, 69 donors and 304 normal persons have been tested. Results： HGV RNA was positive in (1) 21 (14.5% ) male patients out of 145 cases of HCC, (2) 2 (2.9% ) out of 304 normal individuals, and (3) 2(0.7% ) out of 69 normal blood donors. Conclusion： Positive rate of HGV RNA in HCC patients was significant higher than that in donors and normal persons, and suggested that HGV infection might be related with HCC.
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Key words： Hepatocellular carcinoma; Donor; Hepatitis G, virus; Polymerase chain reaction
为了探讨庚型肝炎病毒(HGV)在肝细胞癌(HCC)患者中的感染情况，我们应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术[1]检测了145例HCC患者血清中的HGV-RNA，现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 标本来源
145例血清标本采自中山医科大学附属肿瘤医院及孙逸仙纪念医院住院的HCC病人。其中男132例，女13例。均经手术取材病理确诊为HCC。另取69例献血员及东莞市幼儿园到高中学生正常人群共304例血清作检测对照。血清标本用消毒离心管分装，在-20℃以下保存。
, 百拇医药
1.2 血清肝炎病毒标志物的检测
HBsAg、HBeAg、抗HBe、抗HBc采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测，试剂均为卫生部核准产品，按说明书操作并判断结果。
1.3 HGV RNA检测试剂
RNA酶抑制剂(RNasin)，AMV反转录酶，TaqDNA聚合酶等均购自丰华公司。引物根据Gen Ban K中GBV-C序列(U36380)，HGV PNF 2161株序列(U44402)及HGV R 10291株序列(U45966)，在5′端非编码区(NCR)，挑选三株序列相同的区段设计，计位按HGVPNF2161株，序列如下；G15′ATGCGTATGACAGGGTTGG3(+)(117-136，按PNF216株位置，下同)；G25′TAGGTGGCCCCATGCATTTCC3(-)(451-471)：G35′GGTAGCCACTATAGGTGGGT3(+)(161-180)：G45′CACTGGTCCTTGTCAACTCG3(-)(379-398)。G1、G2为外引物，G3、G4为内引物，位于5′NCR，巢式扩增后产物为238bp。
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1.4 方法
RT-PCR采用蛋白酶K裂解法制备RNA模板，取待检血清标本及阳性对照标本各50μl分别加入裂解液5μl(主要成份为蛋白酶K)，55℃ 30 min 95℃ 15 min。11000 rpm离心5 min，取裂解上清5μl进行逆转录，逆转录反应体积10μl，内含引物G2100ng，AMV逆转录酶10单位，0.25mmol/L dNTP 2μl，RNasin 8单位，5×buffer 2μl，42℃ 45 min。第一次PCR反应体积为20μl，含逆转录液10μl，引物G1 100ng，G2 100ng，0.25mmol/LdNTP 4μl，10×buffer 2μl，TaqDNA聚合酶0.4单位，在94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 40sec，循环30次，72℃延伸反应7min。第二次PCR反应体积为20μl，内含第一次PCR反应液5μl，引物G3100ng,G4100ng, 10×buffer 2μl,TaqDNA聚合酶0.4U，循环条件同第一次PCR，循环30次。取10μl产物在含溴化己锭的2%琼脂糖凝胶中电泳，与分子量标准作对照，在紫外线灯下观察结果。
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2 结果
经两次扩增后的产物在2%琼脂糖凝胶中电泳后可见单一条带，与阳性对照标本的扩增条带一致，为238 bp。如附图。
附图 HGV经RTnestedPCR后电泳结果
1-4 为检测标本(其中3、4观察到阳性产物)，5 为阴性对照，6 为阳性对照，7 为100 bpDNA Ladder (GIBCOBRL)
在145例HCC患者血清标本中，共发现21例HGVRNA阳性，均为男性患者。其中HBsAg阳性病例为130例。HBsAg阴性15例。HBsAg阴性、阳性与HGVRNA阴性、阳性的关系见表1。
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表1 肝癌患者HGV感染与乙型病毒性肝炎的关系
组别
例数
HGV RNA
+
(%)
-
(%)
HBsAg(+)
130
19
(14.62)
111
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(85.38)
HBsAg(-)
15
2
(13.33)
13
(86.67)
合计
145
21
(14.48)
124
(85.52)
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我们在检测69例献血员及304例正常人群的血清中，发现献血员有2例、正常人群也有2例HGVRNA阳性。HCC病人的HGV感染率明显高于正常人群。结果如表2。表2 肝癌患者与献血员及正常人群HGV感染比较
组别
例数
HGV RNA+(%)
(1)HCC
145
21(14.5)
(2)献血员
69
2(2.9)
, 百拇医药
(3)正常人
304
2(0.7)
3 讨论
近年来世界各地对HGV感染的研究逐渐深入[2～4]，研究的手段多以HGVRNA的检测为主，因为至今尚无其他可靠的免疫学方法可确定HGV的现症感染。以往我们多采用热变性法(主要成份为2—疏基乙醇)制备模板，现改用蛋白酶K裂解粗提RNA，用此方法后条带清晰，HGV重复扩增较好。我们对145份HCC患者血清检测出21例、69份献血员血清检测出2例、304份正常人群血清检测出2例HGVRNA阳性，均经二次实验证实。
HGV男女均可感染，在本实验中，13例女性病人HGVRNA无一例阳性，这可能与女性HCC患者检测例数较少有关。在我国，HCC的发病率男多于女，曾有报道[1，5]HCC男女比例为1∶3～8。在本组21例HGVRNA阳性的男性肝癌病人中，HBsAg阳性的HCC患者HGV感染19例(14.6%)，其中HBsAg、抗HBe、抗HBc阳性17例，HBsAg、抗HBe阳性2例。15例HBsAg阴性的HCC患者HGV感染2例(13.3%)，这两例患者丙肝均为阴性，两者结果没有统计学差异，可能与HBsAg阴性的HCC患者例数少有关。曾有报道[6]乙型肝炎重叠HGV的感染率达37%，由于HGV的传播途径与HBV和HCV的传播途径及流行情况类似[7]，主要通过输血、血制品和注射途径感染。有报道[8]HGV感染者体内病毒复制可能持续存在。是否HGV与HBV均有协同的致癌作用?从本研究来说，没有证据表明HGV在HCC发生中起着重要作用，只是HCC病人HGV感染率明显高于献血员和正常人群。
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基金项目：广东省自然科学基金和CMB部分资助课题(NO：93852)
参考文献
1 周元平，彭文伟，姚集鲁.肝癌组织中丙型和乙型肝炎病毒基因状况研究〔J〕.中华肝脏病杂志，1995，3(4)：202.
2 Linnen J, Wages J, Zhang K Z Y, et al. Molecular cloning and disease assoiation of hepatitis G virus： a transfusion transmissible agent〔J〕. Science, 1996, 271:505.
3 Zhao X P, Yang X P. Histological evidence on the relation of hepatocrllular carcinoma to hepatitis B ,C and G virus infection 〔J〕. Gastroenterol Hepatol, 1997, 12 (suppl):s99.
, 百拇医药
4 Nakatsuji Y, Shih J W K, Tanaka E, et al. Prevatenec and disease association of hepatitis G virus infection in Japan〔J〕. J Viral Hepatitis. 1996, 3:307.
5 汤钊猷.原发性肝癌〔A〕.见：汤钊猷主编.现代肿瘤学〔M〕.上海医科大学出版社，1993：554.
6 黄爱龙，张建军，曾维群.重庆地区HGVRNA检测及部分序列分析〔J〕.中华肝脏病杂志，1997，3(5)：5.
7 李刚，姚集鲁，陈青，等.一种新型肝炎病人—庚型肝炎病毒的cDNA克隆〔J〕.中山医科大学学报，1996，17(3)：237.
8 张定凤.庚型肝炎研究的现状〔J〕.中华肝脏病杂志，1997，3(5)：1.
收稿日期：1997-12-12 修回日期：1998-01-07, 百拇医药