鼻咽癌组织中EB病毒LMP1的表达与癌细胞增殖和凋亡的关系＊
作者：刘克拉 宗永生 张昌卿 张锋 冯凯涛
单位：刘克拉(中山医科大学肿瘤医院病理科(广州，510060；E-mail:klliu@gzsums.edu.cn))；宗永生(中山医科大学病理教研室)；张昌卿 冯凯涛(中山医科大学肿瘤医院中心实验室)；张锋(中山医科大学肿瘤医院鼻咽癌科)
关键词：鼻咽肿瘤；EB病毒；细胞凋亡
癌症/990206
【摘要】目的：探讨细胞间隙连接蛋白Cx32在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)及其癌旁肝、肝硬变(liver cirrhosis, LC)、病毒性肝炎(viral hepatitis, VH)和正常肝组织中的表达和意义。方法：应用SP免疫组织化学法检测Cx32在47例HCC及其15例癌旁肝、19例LC、8例VH及和9例正常肝组织中的表达。结果：Cx32蛋白表达既定位于肝细胞胞浆中，又定位于胞膜上，也可二者同时阳性。Cx32在HCC及癌旁肝、LC、VH和正常肝组织中阳性率分别为42.6%、73.3%、73.7%、75.0%和88.9%。χ2检验，Cx32在HCC中的表达明显低于在癌旁肝、LC、VH及正常肝组织的水平(P<0.01)。随着HCC分化程度的降低，其阳性率有所下降。结论：Cx32表达减弱可能是HCC发生的重要环节。
, 百拇医药
中图号：R735.7 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)02-0133-03
The expression of gap junction protein connexin 32 in human
hepatocellular carcinoma, cirrhotic and viral hepatitidc liver tissues
MA Xiang-dong SUI Yan-gang WANG Wen-liang
Department of Pathology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032，China
【Abstract】 Objective： To investigate the regularity and significance of expression of connexin (Cx) 32 in human hepatocellular carcinoma (HCC) and liver diseases patients. Method：： Cx32 were detected in 47 cases of HCC, 19 cases of liver cirrhosis (LC), 8 cases of viral hepatitis (VH) and 9 cases of normal hepatic tissues methods：SP immunohistochemical methods was used. Results：： Cx32 antigen postitive stain located not only in the cytoplasm but also on the membranes of hepatocytes. The detecition rates of Cx32 in HCC and pericancerous liver tissue, LC, VH and normal liver tissues were 42.6% , 73.3% , 75.0% and 88.9% respectively. In Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ histological degree of HCC the rates are 50.0% , 42.9% and 38.9% . The lower the degree, the lower the Cx32 positive rate. Ch-square test suggested that Cx32 positive rate in HCC was significant lower than that in pericancerous liver tissur and normal liver tissues (P<0.01). Conclusion: The derease of Cx32 may play an important role in hepatocarcinogenesis.
, 百拇医药
Key word： Connexin： Liver neoplasm; Immunohistochemisty
间隙连接(gap junction)是普遍存在于动物组织中的一种细胞连接形式，通过Cx介导的细胞间连接通讯(gap junction intercellular communication, GJIC)，对细胞的增殖、分化进行调控[1]。间隙连接由相邻细胞膜上的连接子(connexon)相互衔接而成，连接子的蛋白质亚单位即间隙连接蛋白(connexin, Cx)[2]。间隙连接功能缺陷与多种肿瘤的恶性增殖有关，可能是肿瘤发生的重要环节[1]。Cx多基因家族中Cx32在肝脏中特异性表达[3]，研究Cx32在HCC、LC、VH和正常肝中的表达，进一步探讨与肝细胞性肝癌发生的关系，国内尚未见报道。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 标本
47例HCC、15例癌旁肝组织、19例LC、8例VH和9例正常肝组织，均为本校西京医院1994年～1997年外科手术切除标本，经病理证实，根据WHO分类标准分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ级。标本均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4μm厚切片。
1.2 试剂
抗Cx32McAb、SP免疫组化试剂盒及DAB染色试剂盒均为美国Zymed公司产品。
1.3 免疫组化染色
切片脱蜡至水，3%H2O2灭活30min，正常山羊血清封闭30min，倾去血清，加Cx32McAb(1∶1000)37℃孵育1h，PBS振洗后滴加生物素化二抗(1∶100)37℃，30min，PBS振洗，加辣根酶标记的链霉卵白素(1∶100)37℃，10min，PBS振洗，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。
, 百拇医药
1.4 结果判定
阴性(-)：阳性细胞<5%；阳性(+)：5%～50%细胞阳性染色；强阳性(++)：阳性细胞>50%。选择Cx32高表达的正常肝组织为阳性对照，以PBS代替一抗作为空白对照。所有结果均经χ2检验。
2 结果
2.1 Cx32的分布
Cx32在HCC、LC、VH及正常肝组织中均有不同程度的表达。HCC阳性细胞以胞浆内弥漫、均匀分布为主(图1)，也可见胞膜阳性(图2)，染色较淡。癌旁肝细胞阳性较HCC明显(图3)。LC有胞浆、胞膜阳性(图4)，VH以胞膜为主，染色均较深(图5)，正常肝组织胞浆阳性为多见，明显深染(图6)。
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图1 肝细胞肝癌组织，Cx32抗原定位于胞浆。SP法，×400；
图2 肝细胞肝癌组织，Cx32抗原定位于胞膜。SP法，×400；
图3 癌旁肝阳性细胞，Cx32抗原胞浆阳性。SP法，×400；
图4 肝硬变组织，Cx32抗原定位于胞浆。SP法，×200；
图5 肝炎组织，Cx32抗原定位于胞膜。SP法，×400；
图6 正常肝组织，Cx32抗原呈胞浆阳性。SP法，×400
2.2 Cx32在HCC、LC、VH及正常肝中的表达
χ2检验表明，Cx32在HCC中阳性率较其在LC，VH正常肝组织中的阳性率有显著(P<0.01)，结果表1。
, 百拇医药
表1 CX32蛋白在HCC、LC、VH及正常中阳性率 病理类型
例数
阳性例数
%
-
+
++
HCC
47
27
13
7
42.6
, 百拇医药
LC
19
5
6
8
73.7*
VH
8
2
2
4
75.0*
正常肝
, http://www.100md.com
9
1
1
7
88.9*
*与HCC比较，P<0.01
2.3 Cx32在HCC及其癌旁肝、正常肝中表达
经χ2检验，Cx32在HCC中阳性率明显低于其在癌旁肝及正常组织的阳性率(P<0.01)，随着HCC分化程度降低，其阳性率有所下降，结果见表2。
表2 Cx32蛋白在HCC及其癌旁肝、正常肝中阳性率 病理类型例数
, http://www.100md.com
例数
阳性例数
%
-
+
++
HCC Ⅰ
8
4
3
1
50.0
HCC Ⅱ
21
, 百拇医药
12
7
2
42.9
HCC Ⅲ
18
11
3
4
38.9
HCC癌旁肝
15
4
, 百拇医药 6
5
73.3*
正常肝组织
9
1
1
7
88.9*
*与HCC比较，P<0.01
3 讨论
现已克降出Cx多基因家族的13个成员，在结构上有明显的种系间保守性和表达的组织特异性，且有一定叉现象[1]。其Cx32在肝细胞中有特异性表达[4]。应用Cx32McAb，研究国人HCC、LC、VH及正常肝组织中Cx蛋白的表达，国内尚未见报道。
, 百拇医药
本研究表明，Cx32在肝细胞及HC细胞中均存在不同程度的表达，既定位于胞浆内，又有胞膜阳性，或二者同时阳性，与国外文献报道相符合[4]。
目前国外对Cx32在HCC中的研究，多集中在其表达的阳性率上[6]，Cx32在HCC、LC及正常肝中阳性率分别为56.2%、73.1%和84.9%，与本研究结果相似。对于深入探讨Cx32这一与细胞分化、进展阶段的表达规律的研究，尚未见系统报道。
本研究发现，Cx32在正常肝细胞中有较高水平的表达(88.9%)，阳性细胞深染。在VH、LC中表达比正常肝组织低(75.0%、73.7%)，VH因胞浆疏松比正常肝组织低(75.0%、73.7%)，VH因胞浆疏松化和汽球样变使阳性染色集中在胞膜上。Cx32在HCC中表达更明显降低(42.6%)，且染色强度明显弱。Cx32的表达减弱与正常肝、VH、LC至HCC的恶性进程密切相关[7]。
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实验还对Cx32在HCC及其癌旁肝中的表达进行了分析，发现Cx32在二者中的表达阳性率明显不同。癌旁肝细胞虽然有压迫性萎缩现象，阳性染色仍较深，阳性率达73.3%，共周围的HCC细胞淡染甚至无阳性染色，形成明显对比，显示癌旁肝细胞与肝癌细胞间生物性质不同。进一步证实Cx32表达异常与HCC的形成及其恶性特征有关。
不同分化阶段的HCC组织中，Cx32的表达也存在差别，在HCCⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级中的阳性率分别为50.0%、42.9%和38.9%，提示分化程度降低，Cx32的表达水平逐渐下降。
现有资料已明确，间隙连接通讯功能的缺陷以间隙连接基因表达的异常为基础，与肿瘤的恶性增殖和转化密切相关[7]。有认为Cx基因的稳定表达可能有抑瘤用，可能具有重要抑癌因基[1]。本研究提示，Cx32表达下降可能是HCC的发生的重要环节[8]，其详尽的分子机制尚需深入研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Kumar NM, Gilula NB. The gap junction communication channel〔J〕. Cell, 1996, 84:381.
2 Stauffer KA, Kumar NM, Gilula NB, et al. Isolation and Purification of gap junction channels〔J〕. J Cell Biol, 1991, 116(1):141.
3 Yoshizawa T, Watanabe D, Hirose M,e t al. Dimethylsulfoxide maintains intercellular commumication by preserving the gap junctional protein connexin 32 in primary cultured hepatocyte doublest from rats〔J〕. J Gastro ＆ Hepatol, 1997, 12:325.
, 百拇医药
4 Krutovskikh V, Mazzoleni G, Mironov N, et al. Altered homologous and heterologous gap-junctional intercellular communication in primary human liver tumors associated with aberrant protern localization but not gene mutation of connexin 32〔J〕. Int J Cancer, 1994, 56:87.
5 Tsuda H, Asamoto M, Baba H, et al. Cell proliferation and advancement of hepatocarcinogenesis in the rat are associated with decrease in connexin 32 expression〔J〕. Carcinogenesis, 1995, 15910:101.
, 百拇医药
6 Yamaoka Y, Nouchi T, Tazawa J, et al. Expression of gap junction protein connexin 32 and E-cadherin in human hepatocellular carcinoma〔J〕. J Hepatol, 1995, 22(5):536.
7 Holder JW, Elmope E, Barrett JC. Gap junction function and cener〔J〕. Cancer Res, 1993, 53:3475.
8 Neveu MJ, Hully JR, Babcock KL, et al. Multiple mechanisms are responsible for altered expression of gap junction genes during oncogenesis in rat liver〔J〕. J Cell Sci, 1994, 107(pt1):83.
收稿日期：1997-11-28 修回日期：1998-01-07, 百拇医药
单位：刘克拉(中山医科大学肿瘤医院病理科(广州，510060；E-mail:klliu@gzsums.edu.cn))；宗永生(中山医科大学病理教研室)；张昌卿 冯凯涛(中山医科大学肿瘤医院中心实验室)；张锋(中山医科大学肿瘤医院鼻咽癌科)
关键词：鼻咽肿瘤；EB病毒；细胞凋亡
癌症/990206
【摘要】目的：探讨细胞间隙连接蛋白Cx32在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)及其癌旁肝、肝硬变(liver cirrhosis, LC)、病毒性肝炎(viral hepatitis, VH)和正常肝组织中的表达和意义。方法：应用SP免疫组织化学法检测Cx32在47例HCC及其15例癌旁肝、19例LC、8例VH及和9例正常肝组织中的表达。结果：Cx32蛋白表达既定位于肝细胞胞浆中，又定位于胞膜上，也可二者同时阳性。Cx32在HCC及癌旁肝、LC、VH和正常肝组织中阳性率分别为42.6%、73.3%、73.7%、75.0%和88.9%。χ2检验，Cx32在HCC中的表达明显低于在癌旁肝、LC、VH及正常肝组织的水平(P<0.01)。随着HCC分化程度的降低，其阳性率有所下降。结论：Cx32表达减弱可能是HCC发生的重要环节。
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中图号：R735.7 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)02-0133-03
The expression of gap junction protein connexin 32 in human
hepatocellular carcinoma, cirrhotic and viral hepatitidc liver tissues
MA Xiang-dong SUI Yan-gang WANG Wen-liang
Department of Pathology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032，China
【Abstract】 Objective： To investigate the regularity and significance of expression of connexin (Cx) 32 in human hepatocellular carcinoma (HCC) and liver diseases patients. Method：： Cx32 were detected in 47 cases of HCC, 19 cases of liver cirrhosis (LC), 8 cases of viral hepatitis (VH) and 9 cases of normal hepatic tissues methods：SP immunohistochemical methods was used. Results：： Cx32 antigen postitive stain located not only in the cytoplasm but also on the membranes of hepatocytes. The detecition rates of Cx32 in HCC and pericancerous liver tissue, LC, VH and normal liver tissues were 42.6% , 73.3% , 75.0% and 88.9% respectively. In Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ histological degree of HCC the rates are 50.0% , 42.9% and 38.9% . The lower the degree, the lower the Cx32 positive rate. Ch-square test suggested that Cx32 positive rate in HCC was significant lower than that in pericancerous liver tissur and normal liver tissues (P<0.01). Conclusion: The derease of Cx32 may play an important role in hepatocarcinogenesis.
, 百拇医药
Key word： Connexin： Liver neoplasm; Immunohistochemisty
间隙连接(gap junction)是普遍存在于动物组织中的一种细胞连接形式，通过Cx介导的细胞间连接通讯(gap junction intercellular communication, GJIC)，对细胞的增殖、分化进行调控[1]。间隙连接由相邻细胞膜上的连接子(connexon)相互衔接而成，连接子的蛋白质亚单位即间隙连接蛋白(connexin, Cx)[2]。间隙连接功能缺陷与多种肿瘤的恶性增殖有关，可能是肿瘤发生的重要环节[1]。Cx多基因家族中Cx32在肝脏中特异性表达[3]，研究Cx32在HCC、LC、VH和正常肝中的表达，进一步探讨与肝细胞性肝癌发生的关系，国内尚未见报道。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 标本
47例HCC、15例癌旁肝组织、19例LC、8例VH和9例正常肝组织，均为本校西京医院1994年～1997年外科手术切除标本，经病理证实，根据WHO分类标准分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ级。标本均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4μm厚切片。
1.2 试剂
抗Cx32McAb、SP免疫组化试剂盒及DAB染色试剂盒均为美国Zymed公司产品。
1.3 免疫组化染色
切片脱蜡至水，3%H2O2灭活30min，正常山羊血清封闭30min，倾去血清，加Cx32McAb(1∶1000)37℃孵育1h，PBS振洗后滴加生物素化二抗(1∶100)37℃，30min，PBS振洗，加辣根酶标记的链霉卵白素(1∶100)37℃，10min，PBS振洗，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。
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1.4 结果判定
阴性(-)：阳性细胞<5%；阳性(+)：5%～50%细胞阳性染色；强阳性(++)：阳性细胞>50%。选择Cx32高表达的正常肝组织为阳性对照，以PBS代替一抗作为空白对照。所有结果均经χ2检验。
2 结果
2.1 Cx32的分布
Cx32在HCC、LC、VH及正常肝组织中均有不同程度的表达。HCC阳性细胞以胞浆内弥漫、均匀分布为主(图1)，也可见胞膜阳性(图2)，染色较淡。癌旁肝细胞阳性较HCC明显(图3)。LC有胞浆、胞膜阳性(图4)，VH以胞膜为主，染色均较深(图5)，正常肝组织胞浆阳性为多见，明显深染(图6)。
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图1 肝细胞肝癌组织，Cx32抗原定位于胞浆。SP法，×400；
图2 肝细胞肝癌组织，Cx32抗原定位于胞膜。SP法，×400；
图3 癌旁肝阳性细胞，Cx32抗原胞浆阳性。SP法，×400；
图4 肝硬变组织，Cx32抗原定位于胞浆。SP法，×200；
图5 肝炎组织，Cx32抗原定位于胞膜。SP法，×400；
图6 正常肝组织，Cx32抗原呈胞浆阳性。SP法，×400
2.2 Cx32在HCC、LC、VH及正常肝中的表达
χ2检验表明，Cx32在HCC中阳性率较其在LC，VH正常肝组织中的阳性率有显著(P<0.01)，结果表1。
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表1 CX32蛋白在HCC、LC、VH及正常中阳性率 病理类型
例数
阳性例数
%
-
+
++
HCC
47
27
13
7
42.6
, 百拇医药
LC
19
5
6
8
73.7*
VH
8
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75.0*
正常肝
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9
1
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*与HCC比较，P<0.01
2.3 Cx32在HCC及其癌旁肝、正常肝中表达
经χ2检验，Cx32在HCC中阳性率明显低于其在癌旁肝及正常组织的阳性率(P<0.01)，随着HCC分化程度降低，其阳性率有所下降，结果见表2。
表2 Cx32蛋白在HCC及其癌旁肝、正常肝中阳性率 病理类型例数
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例数
阳性例数
%
-
+
++
HCC Ⅰ
8
4
3
1
50.0
HCC Ⅱ
21
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12
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42.9
HCC Ⅲ
18
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38.9
HCC癌旁肝
15
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5
73.3*
正常肝组织
9
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88.9*
*与HCC比较，P<0.01
3 讨论
现已克降出Cx多基因家族的13个成员，在结构上有明显的种系间保守性和表达的组织特异性，且有一定叉现象[1]。其Cx32在肝细胞中有特异性表达[4]。应用Cx32McAb，研究国人HCC、LC、VH及正常肝组织中Cx蛋白的表达，国内尚未见报道。
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本研究表明，Cx32在肝细胞及HC细胞中均存在不同程度的表达，既定位于胞浆内，又有胞膜阳性，或二者同时阳性，与国外文献报道相符合[4]。
目前国外对Cx32在HCC中的研究，多集中在其表达的阳性率上[6]，Cx32在HCC、LC及正常肝中阳性率分别为56.2%、73.1%和84.9%，与本研究结果相似。对于深入探讨Cx32这一与细胞分化、进展阶段的表达规律的研究，尚未见系统报道。
本研究发现，Cx32在正常肝细胞中有较高水平的表达(88.9%)，阳性细胞深染。在VH、LC中表达比正常肝组织低(75.0%、73.7%)，VH因胞浆疏松比正常肝组织低(75.0%、73.7%)，VH因胞浆疏松化和汽球样变使阳性染色集中在胞膜上。Cx32在HCC中表达更明显降低(42.6%)，且染色强度明显弱。Cx32的表达减弱与正常肝、VH、LC至HCC的恶性进程密切相关[7]。
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实验还对Cx32在HCC及其癌旁肝中的表达进行了分析，发现Cx32在二者中的表达阳性率明显不同。癌旁肝细胞虽然有压迫性萎缩现象，阳性染色仍较深，阳性率达73.3%，共周围的HCC细胞淡染甚至无阳性染色，形成明显对比，显示癌旁肝细胞与肝癌细胞间生物性质不同。进一步证实Cx32表达异常与HCC的形成及其恶性特征有关。
不同分化阶段的HCC组织中，Cx32的表达也存在差别，在HCCⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级中的阳性率分别为50.0%、42.9%和38.9%，提示分化程度降低，Cx32的表达水平逐渐下降。
现有资料已明确，间隙连接通讯功能的缺陷以间隙连接基因表达的异常为基础，与肿瘤的恶性增殖和转化密切相关[7]。有认为Cx基因的稳定表达可能有抑瘤用，可能具有重要抑癌因基[1]。本研究提示，Cx32表达下降可能是HCC的发生的重要环节[8]，其详尽的分子机制尚需深入研究。
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参考文献
1 Kumar NM, Gilula NB. The gap junction communication channel〔J〕. Cell, 1996, 84:381.
2 Stauffer KA, Kumar NM, Gilula NB, et al. Isolation and Purification of gap junction channels〔J〕. J Cell Biol, 1991, 116(1):141.
3 Yoshizawa T, Watanabe D, Hirose M,e t al. Dimethylsulfoxide maintains intercellular commumication by preserving the gap junctional protein connexin 32 in primary cultured hepatocyte doublest from rats〔J〕. J Gastro ＆ Hepatol, 1997, 12:325.
, 百拇医药
4 Krutovskikh V, Mazzoleni G, Mironov N, et al. Altered homologous and heterologous gap-junctional intercellular communication in primary human liver tumors associated with aberrant protern localization but not gene mutation of connexin 32〔J〕. Int J Cancer, 1994, 56:87.
5 Tsuda H, Asamoto M, Baba H, et al. Cell proliferation and advancement of hepatocarcinogenesis in the rat are associated with decrease in connexin 32 expression〔J〕. Carcinogenesis, 1995, 15910:101.
, 百拇医药
6 Yamaoka Y, Nouchi T, Tazawa J, et al. Expression of gap junction protein connexin 32 and E-cadherin in human hepatocellular carcinoma〔J〕. J Hepatol, 1995, 22(5):536.
7 Holder JW, Elmope E, Barrett JC. Gap junction function and cener〔J〕. Cancer Res, 1993, 53:3475.
8 Neveu MJ, Hully JR, Babcock KL, et al. Multiple mechanisms are responsible for altered expression of gap junction genes during oncogenesis in rat liver〔J〕. J Cell Sci, 1994, 107(pt1):83.
收稿日期：1997-11-28 修回日期：1998-01-07, 百拇医药