大鼠脊髓受压后血管通透性的变化和益气化瘀利水方药的作用
作者：郑清波 施杞
单位：上海中医药大学 (200032 上海)
关键词：脊髓压迫；血管通透性；消炎痛；益气化瘀利水方药；伊文思蓝法
中国中医骨伤科990202 摘要 目的：观察血管通透性在脊髓受压后的改变和益气化瘀利水方药的药理机制。方法：通过注射106Walker 256瘤细胞液到大鼠T13椎体前，建立脊髓硬膜外压迫实验模型，通过伊文思蓝法定量测定脊髓血管通透性。结果：脊髓受压后血管通透性明显升高(P<0.01)，消炎痛和益气化瘀利水方药能明显抑制血管通透性，但消炎痛的作用强于益气化瘀利水方药(P<0.01)，颈痛灵对血管通透性则无影响(P>0.05)。结论：脊髓受压后的水肿为血管源性水肿，益气化瘀利水方药通过减轻水肿，来延缓脊髓继发性损害的产生。
The Vascular Permeability Changes and the Effect of Recipe for Replenishing Qi,Removing Blood Stasis and Inducing Diureses
, http://www.100md.com
Zheng Qingbo,Shi Qi
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine & Pharmacology,Shanghai 200032
ABSTRACT Objective:To clarify whether the change of vascular permeability in the spinal cord compressed segments and the effect of the recipe for replenishing Qi,removing blood stasis and inducing diureses on vascular permeability.Methods:The cord compression was induced im Wistar rats by percutaneous inoculation of 106 cells of walker 256 carcinoma cell suspension anterior to the T13vertebral body.Vascular permeability of the spinal cord was quantitated by measuring tissue staining with Evans blue dye.Results:In saline-treated compressed rats a signififcant increase in vascular permeability was present in the compressed segments (P<0.01).Treatment with either Indomethacin or the recipe for replenishing Qi,removing blood stasis and inducing diureses significantly reduced elevated vascular permeability when compared to saline-treated compressed rats (P<0.01),but the recipe for replenishing Qi,removing blood stasis and inducing diureses was significantly less potent than Indomethacin in reducing the increased vascular permeability.Jing Tong Ling failed to reduce the increased vascular permeability of the compressed segments (P>0.05).Conclusion:The spinal cord compressed causes vasogenic edema in the compressed segments.The recipe for replenishing Qi,removing blood stasis and inducing dirueses is effective in reducing spinal cord edema and protract the course to secondary damage of the cord.
, 百拇医药
KEY WORDS Spinal cord compressio Vascular permeability Indomethacin Evans bluedye method Recipe for replenishing Qi Removing blood stasis and inducing diureses
目前对脊髓压迫综合症的研究主要集中在脊髓的外在压迫因素，对其机理的认识仅限于对脊髓组织的机械性压迫，对其的治疗主要是解除压迫，以期神经功能的自行恢复。[1]对脊髓损伤的研究表明：脊髓损伤后将产生水肿，血流量减少，Ca2+浓度改变，兴奋性氨基酸释放等继发性损害，而这些继发性损害是引起神经功能障碍的主要因素。[2]脊髓受压后是否产生继发性损害，其病生机制是否与脊髓损伤相似，目前知之甚少。[3]施杞教授在几十年的临证中，采用益气化瘀利水方药，治疗脊髓型颈椎病，取得良好临床疗效。由于血管通透性的改变是水肿产生的基础，为此，本文建立大鼠实验性压迫模型，定量测定脊髓血管通透性，探讨脊髓受压后的病生机制及益气化瘀利水方药的药理机制。
, 百拇医药
材料与方法
1 动物模型制作 取出保存在液氮罐内的W256组织块(由上海医药工业研究院药理室提供)，37℃水浴下融化，加入一定量的1640培养液，用组织研磨器制作细胞悬液，接种于重40g左右的Wistar雌性大鼠腹腔内，接种后6～7天，大鼠腹部明显膨隆，此时肿瘤处于生长旺盛期。常规消毒，切开腹腔表皮，用7号针头抽出腹水液，置于1640培养液中，离心，弃上清液，稀释，细胞计数，将瘤细胞液调整至1×107ml，台盼蓝试验示细胞活力在98%以上。取体重150g左右的雌性wistar大鼠，随机分为正常对照组、压迫对照组、益气化瘀利水方药组、消炎痛组、颈痛灵组、每组8只动物。乙醚轻度麻醉，用4号针头，抽吸0.1mlW256瘤细胞液，无菌操作下，经皮穿刺种植到大鼠T13椎体前方。正常对照组注射0.1ml生理盐水。接种后次日，采用每日1次灌胃方式，分别给予生理盐水、消炎痛、益气化瘀利水方药、颈痛灵1.5m1。消炎痛用4%阿拉伯树胶配成0.667mg/ml的混悬液，服用剂量6.67mg/ml；益气化瘀利水方药，制成汤剂，每毫升含生药1g，服用剂量10g/kg，组方：黄芪、大黄、川芎、白术、汉防己、泽泻、薏苡仁、生甘草等：颈痛灵服用剂量10ml/mg。每天观察动物后肢瘫痪情况。
, 百拇医药
2 伊文思蓝荧光法定量测定脊髓血管壁通透性，所有试剂均购自上海化学试剂商店，为分析纯。
2.1 测定原理 伊文思蓝与血清白蛋白有高亲和力，注射入血后数秒钟即与白蛋白稳定结合，测定伊文思蓝的含量可以反映血管通透性的变化。
2.2 血管壁通透性的制作 动物瘫痪前24小时，在乙醚轻度麻醉下，按2ml/kg尾静脉注射2%伊文思蓝，片刻，大鼠足趾、耳朵、眼睛、口唇出现蓝染着色，然后，用戊巴比妥钠麻醉，尾静脉注入肝素抗凝，作胸部前正中切口，显示大鼠心脏，切开左心室，以左心室插管到主动脉，丝线结扎固定导管，右心房切开引流，动物37℃水浴，在100mmHg压力下用生理盐水灌注冲洗，直至右心房无血液流出，约需生理盐水150m1。
2.3 血管壁通透性的测定 取后路切口切除椎板，取出包有硬膜的脊髓，放在蜡板上，剥去硬膜，取T13-L3段脊髓，准确称重后，按3ml/100mg脊髓组织加入一定量的甲酰胺，匀浆，置50℃隔水式培养箱中温育24h，然后12000rpm/min离心20分钟，取上清液，用721型分光光度计在λ620nm处进行比色。根据标准曲线算出伊文思蓝的含量。含量为mg/g组织湿重。
, 百拇医药
2.4 标准曲线的制作 将2%伊文思蓝稀释1000倍成20mg/ml，以后依次对半 稀释，配成10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156mg/ml，在721型分光光度计λ620nm处进行比色，作出标准曲线。
3 统计学分析 采用方差分析和t检验方法，所有数据以之上
表示。
结果
脊髓血管壁通透性的变化 正常对照组脊髓血管通透性为1.703±0.168μg/mg；脊髓压迫对照组脊髓血管通透性明显升高(4.060±0.116μg/mg，P<0.01)：益气化瘀利水方药治疗组脊髓血管通透性为2.615±0.113μg/mg，高于正常对照组与消炎痛治疗组(P<0.01)，但比脊髓压迫对照组显著降低(P<0.01)；消炎痛治疗组脊髓血管通透性为2.223μg/mg±0.075，高于正常对照组(P<0.01)，明显低于脊髓压迫对照组(P<0.01)，颈痛灵治疗组脊髓血管通透性为4.049μg/mg±0.152，与脊髓压迫对照组无明显差别(P>0.05)(见表)。
, 百拇医药
表1 大鼠脊髓血管通透性 (μg/mg湿重) 组 别
n
血管通透性
正常对照组
8
1.703±0.168
脊髓压迫对照组
8
4.060±0.116*
益气化瘀利水方药组
8
, 百拇医药
2.615±0.113*△☆
消炎痛组
8
2.223±0.075*☆
颈痛灵组
8
4.049±0.152▲
* 与正常对照组比P<0.01；☆ 与脊髓压迫组相比P<0.01；
▲ 与脊髓压迫组相比P>0.05；△ 与消炎痛组相比P<0.01讨论
我们按Ushio的方法将W256肿瘤细胞种植到大鼠T13椎体前，肿瘤细胞通过椎间孔扩散，进入硬膜外腔，生长压迫脊髓，肿瘤细胞种植后，平均16天大鼠双后肢瘫痪，从而建立了脊髓亚急性压迫的动物模型。[4]Siegal发现，消炎痛能有效地减轻脊髓水肿，地塞米松则无抗脊髓水肿作用，故本文选用消炎痛作为治疗药物，实验证实，脊髓受压后受压段脊髓水含量明显增加，[5]这说明脊髓产生了水肿，由于受到软膜及硬膜的约束，脊髓无法向外肿胀扩张，脊髓内压不断增高，从而引起脊髓损害。
, 百拇医药
用伊文思蓝法定量测定脊髓血管通透性，是由于伊文思蓝与血清白蛋白有高度亲和力，注射入血后即刻与白蛋白结合，用伊文思蓝法测定血管通透性，不能取组织直接测定，需要用有机溶剂甲酰胺将漏入组织中的伊文思蓝提取出来，用比色法进行定量，在灌注清除血管内的伊文思蓝后，测定组织样品中残余的伊文思蓝量就表示外渗的蛋白量。[6，7]实验证实，脑水肿、外渗蛋白、外渗的伊文思蓝和白蛋白的复合物具有高度相关性，该方法能很好地反映血管壁的通透性。[8]正常血-脊髓屏障毛细血管通透性很低，只容许一些小分子溶质通过，用该法测得的脊髓压迫对照组血管通透性明显升高(P<0.01)，因此，脊髓受压的水肿是血管源性的，其机制主要是毛细血管通透性升高。至于PGE2、5-HT等因子在血管通透性改变中的作用则有待于进一步研究。
颈痛灵对血管通透性无抑制作用，故无抗脊髓水肿的功效。同消炎痛相比，益气化瘀利水方药中等程度抑制血管通透性，有可能通过作用于PGE2、5-HT等环节，以达到减轻脊髓水肿的目的，这也是益气化瘀利水方药临床屡奏疗效的机制。
, http://www.100md.com
参考文献
1.王沛，郭世跋.脊髓型颈椎病(综述).中华骨科杂志，1996，16(2)：128
2.Tator CH,Fehings MG:Review of the secondary injury theory of acute spinal cord trauma with emphasis on vascular machanisms.J Neurosurg,1991,75:15
3.Bernhardt M,Hyn es RA,Blume HW,et al:Current conception review.Cervical spondylitic mylopathy.J Bone Joint Surg(Am),1993,75:119
4.Ushioy Y,Posner R,Posner JB,et al:Experimental spinal cord compression by epidural neoplasms.Neurology,1977,5:422
, 百拇医药
5.Siegal T,Siegal TZ,Shohami B,et al:comparison of soluble dexamethasone and indomethacin in treatment experimental neoplastic spinal cord compression.Spine,1988,13:1171
6.李少华，吴中立.伊文思蓝荧光法测定肺血管壁通透性.中国病理生理杂志，1990，6(4)：220
7.戴顺龄，薛全福，王树山，等.山莨菪碱及川芎嗪预防大鼠肺水肿的实验研究-肺血管壁通透性变化.中国病理生理杂志，1989，5(6)：354
8.Reichman,HR,Rarrell CL,Maestro RF:Effects of steroids and nonsteroid anti-inflammatory agents on vascular permeaility in a rat glioma model J Neurosurg,1986,65:233
(收稿：1998-7-24), 百拇医药
单位：上海中医药大学 (200032 上海)
关键词：脊髓压迫；血管通透性；消炎痛；益气化瘀利水方药；伊文思蓝法
中国中医骨伤科990202 摘要 目的：观察血管通透性在脊髓受压后的改变和益气化瘀利水方药的药理机制。方法：通过注射106Walker 256瘤细胞液到大鼠T13椎体前，建立脊髓硬膜外压迫实验模型，通过伊文思蓝法定量测定脊髓血管通透性。结果：脊髓受压后血管通透性明显升高(P<0.01)，消炎痛和益气化瘀利水方药能明显抑制血管通透性，但消炎痛的作用强于益气化瘀利水方药(P<0.01)，颈痛灵对血管通透性则无影响(P>0.05)。结论：脊髓受压后的水肿为血管源性水肿，益气化瘀利水方药通过减轻水肿，来延缓脊髓继发性损害的产生。
The Vascular Permeability Changes and the Effect of Recipe for Replenishing Qi,Removing Blood Stasis and Inducing Diureses
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Zheng Qingbo,Shi Qi
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine & Pharmacology,Shanghai 200032
ABSTRACT Objective:To clarify whether the change of vascular permeability in the spinal cord compressed segments and the effect of the recipe for replenishing Qi,removing blood stasis and inducing diureses on vascular permeability.Methods:The cord compression was induced im Wistar rats by percutaneous inoculation of 106 cells of walker 256 carcinoma cell suspension anterior to the T13vertebral body.Vascular permeability of the spinal cord was quantitated by measuring tissue staining with Evans blue dye.Results:In saline-treated compressed rats a signififcant increase in vascular permeability was present in the compressed segments (P<0.01).Treatment with either Indomethacin or the recipe for replenishing Qi,removing blood stasis and inducing diureses significantly reduced elevated vascular permeability when compared to saline-treated compressed rats (P<0.01),but the recipe for replenishing Qi,removing blood stasis and inducing diureses was significantly less potent than Indomethacin in reducing the increased vascular permeability.Jing Tong Ling failed to reduce the increased vascular permeability of the compressed segments (P>0.05).Conclusion:The spinal cord compressed causes vasogenic edema in the compressed segments.The recipe for replenishing Qi,removing blood stasis and inducing dirueses is effective in reducing spinal cord edema and protract the course to secondary damage of the cord.
, 百拇医药
KEY WORDS Spinal cord compressio Vascular permeability Indomethacin Evans bluedye method Recipe for replenishing Qi Removing blood stasis and inducing diureses
目前对脊髓压迫综合症的研究主要集中在脊髓的外在压迫因素，对其机理的认识仅限于对脊髓组织的机械性压迫，对其的治疗主要是解除压迫，以期神经功能的自行恢复。[1]对脊髓损伤的研究表明：脊髓损伤后将产生水肿，血流量减少，Ca2+浓度改变，兴奋性氨基酸释放等继发性损害，而这些继发性损害是引起神经功能障碍的主要因素。[2]脊髓受压后是否产生继发性损害，其病生机制是否与脊髓损伤相似，目前知之甚少。[3]施杞教授在几十年的临证中，采用益气化瘀利水方药，治疗脊髓型颈椎病，取得良好临床疗效。由于血管通透性的改变是水肿产生的基础，为此，本文建立大鼠实验性压迫模型，定量测定脊髓血管通透性，探讨脊髓受压后的病生机制及益气化瘀利水方药的药理机制。
, 百拇医药
材料与方法
1 动物模型制作 取出保存在液氮罐内的W256组织块(由上海医药工业研究院药理室提供)，37℃水浴下融化，加入一定量的1640培养液，用组织研磨器制作细胞悬液，接种于重40g左右的Wistar雌性大鼠腹腔内，接种后6～7天，大鼠腹部明显膨隆，此时肿瘤处于生长旺盛期。常规消毒，切开腹腔表皮，用7号针头抽出腹水液，置于1640培养液中，离心，弃上清液，稀释，细胞计数，将瘤细胞液调整至1×107ml，台盼蓝试验示细胞活力在98%以上。取体重150g左右的雌性wistar大鼠，随机分为正常对照组、压迫对照组、益气化瘀利水方药组、消炎痛组、颈痛灵组、每组8只动物。乙醚轻度麻醉，用4号针头，抽吸0.1mlW256瘤细胞液，无菌操作下，经皮穿刺种植到大鼠T13椎体前方。正常对照组注射0.1ml生理盐水。接种后次日，采用每日1次灌胃方式，分别给予生理盐水、消炎痛、益气化瘀利水方药、颈痛灵1.5m1。消炎痛用4%阿拉伯树胶配成0.667mg/ml的混悬液，服用剂量6.67mg/ml；益气化瘀利水方药，制成汤剂，每毫升含生药1g，服用剂量10g/kg，组方：黄芪、大黄、川芎、白术、汉防己、泽泻、薏苡仁、生甘草等：颈痛灵服用剂量10ml/mg。每天观察动物后肢瘫痪情况。
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2 伊文思蓝荧光法定量测定脊髓血管壁通透性，所有试剂均购自上海化学试剂商店，为分析纯。
2.1 测定原理 伊文思蓝与血清白蛋白有高亲和力，注射入血后数秒钟即与白蛋白稳定结合，测定伊文思蓝的含量可以反映血管通透性的变化。
2.2 血管壁通透性的制作 动物瘫痪前24小时，在乙醚轻度麻醉下，按2ml/kg尾静脉注射2%伊文思蓝，片刻，大鼠足趾、耳朵、眼睛、口唇出现蓝染着色，然后，用戊巴比妥钠麻醉，尾静脉注入肝素抗凝，作胸部前正中切口，显示大鼠心脏，切开左心室，以左心室插管到主动脉，丝线结扎固定导管，右心房切开引流，动物37℃水浴，在100mmHg压力下用生理盐水灌注冲洗，直至右心房无血液流出，约需生理盐水150m1。
2.3 血管壁通透性的测定 取后路切口切除椎板，取出包有硬膜的脊髓，放在蜡板上，剥去硬膜，取T13-L3段脊髓，准确称重后，按3ml/100mg脊髓组织加入一定量的甲酰胺，匀浆，置50℃隔水式培养箱中温育24h，然后12000rpm/min离心20分钟，取上清液，用721型分光光度计在λ620nm处进行比色。根据标准曲线算出伊文思蓝的含量。含量为mg/g组织湿重。
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2.4 标准曲线的制作 将2%伊文思蓝稀释1000倍成20mg/ml，以后依次对半 稀释，配成10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156mg/ml，在721型分光光度计λ620nm处进行比色，作出标准曲线。
3 统计学分析 采用方差分析和t检验方法，所有数据以之上
表示。结果
脊髓血管壁通透性的变化 正常对照组脊髓血管通透性为1.703±0.168μg/mg；脊髓压迫对照组脊髓血管通透性明显升高(4.060±0.116μg/mg，P<0.01)：益气化瘀利水方药治疗组脊髓血管通透性为2.615±0.113μg/mg，高于正常对照组与消炎痛治疗组(P<0.01)，但比脊髓压迫对照组显著降低(P<0.01)；消炎痛治疗组脊髓血管通透性为2.223μg/mg±0.075，高于正常对照组(P<0.01)，明显低于脊髓压迫对照组(P<0.01)，颈痛灵治疗组脊髓血管通透性为4.049μg/mg±0.152，与脊髓压迫对照组无明显差别(P>0.05)(见表)。
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表1 大鼠脊髓血管通透性
(μg/mg湿重) 组 别n
血管通透性
正常对照组
8
1.703±0.168
脊髓压迫对照组
8
4.060±0.116*
益气化瘀利水方药组
8
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2.615±0.113*△☆
消炎痛组
8
2.223±0.075*☆
颈痛灵组
8
4.049±0.152▲
* 与正常对照组比P<0.01；☆ 与脊髓压迫组相比P<0.01；
▲ 与脊髓压迫组相比P>0.05；△ 与消炎痛组相比P<0.01讨论
我们按Ushio的方法将W256肿瘤细胞种植到大鼠T13椎体前，肿瘤细胞通过椎间孔扩散，进入硬膜外腔，生长压迫脊髓，肿瘤细胞种植后，平均16天大鼠双后肢瘫痪，从而建立了脊髓亚急性压迫的动物模型。[4]Siegal发现，消炎痛能有效地减轻脊髓水肿，地塞米松则无抗脊髓水肿作用，故本文选用消炎痛作为治疗药物，实验证实，脊髓受压后受压段脊髓水含量明显增加，[5]这说明脊髓产生了水肿，由于受到软膜及硬膜的约束，脊髓无法向外肿胀扩张，脊髓内压不断增高，从而引起脊髓损害。
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用伊文思蓝法定量测定脊髓血管通透性，是由于伊文思蓝与血清白蛋白有高度亲和力，注射入血后即刻与白蛋白结合，用伊文思蓝法测定血管通透性，不能取组织直接测定，需要用有机溶剂甲酰胺将漏入组织中的伊文思蓝提取出来，用比色法进行定量，在灌注清除血管内的伊文思蓝后，测定组织样品中残余的伊文思蓝量就表示外渗的蛋白量。[6，7]实验证实，脑水肿、外渗蛋白、外渗的伊文思蓝和白蛋白的复合物具有高度相关性，该方法能很好地反映血管壁的通透性。[8]正常血-脊髓屏障毛细血管通透性很低，只容许一些小分子溶质通过，用该法测得的脊髓压迫对照组血管通透性明显升高(P<0.01)，因此，脊髓受压的水肿是血管源性的，其机制主要是毛细血管通透性升高。至于PGE2、5-HT等因子在血管通透性改变中的作用则有待于进一步研究。
颈痛灵对血管通透性无抑制作用，故无抗脊髓水肿的功效。同消炎痛相比，益气化瘀利水方药中等程度抑制血管通透性，有可能通过作用于PGE2、5-HT等环节，以达到减轻脊髓水肿的目的，这也是益气化瘀利水方药临床屡奏疗效的机制。
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参考文献
1.王沛，郭世跋.脊髓型颈椎病(综述).中华骨科杂志，1996，16(2)：128
2.Tator CH,Fehings MG:Review of the secondary injury theory of acute spinal cord trauma with emphasis on vascular machanisms.J Neurosurg,1991,75:15
3.Bernhardt M,Hyn es RA,Blume HW,et al:Current conception review.Cervical spondylitic mylopathy.J Bone Joint Surg(Am),1993,75:119
4.Ushioy Y,Posner R,Posner JB,et al:Experimental spinal cord compression by epidural neoplasms.Neurology,1977,5:422
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5.Siegal T,Siegal TZ,Shohami B,et al:comparison of soluble dexamethasone and indomethacin in treatment experimental neoplastic spinal cord compression.Spine,1988,13:1171
6.李少华，吴中立.伊文思蓝荧光法测定肺血管壁通透性.中国病理生理杂志，1990，6(4)：220
7.戴顺龄，薛全福，王树山，等.山莨菪碱及川芎嗪预防大鼠肺水肿的实验研究-肺血管壁通透性变化.中国病理生理杂志，1989，5(6)：354
8.Reichman,HR,Rarrell CL,Maestro RF:Effects of steroids and nonsteroid anti-inflammatory agents on vascular permeaility in a rat glioma model J Neurosurg,1986,65:233
(收稿：1998-7-24), 百拇医药