人松质骨成骨细胞的培养
作者：王海彬 石印玉 赵咏芳 张兴凯 沈培芝
单位：王海彬 石印玉 赵咏芳，上海市曙光医院骨科 (200032 上海)；张兴凯，上海第二医科大学骨科研究所；沈培芝，上海中医药大学骨科研究所
关键词：成骨细胞；培养；骨钙素
中国中医骨伤科990201 摘要 以成年老年人股骨颈部松质骨为材料，采用酶法建立人成骨细胞体外模型，结果示：(1)来源于松质骨的成骨细胞早期以多角形、梭形为主，后期以梭形为主；(2)成骨细胞早期有黑色颗粒分泌，2周后出现黑色结节；(3)骨钙素的分泌以第14天左右达到最高，以后则递减。本法有取材方便，可得到大量、纯化的成骨细胞的优点。
Human Osteoblastic Cells Derived from Trabecular Bone Culture in Vitro
, 百拇医药
Wang Haibin,Zhang Xinkai,Shi Yinyu,et al
The Dept Orthopedic,Shuguang Hospital of Shanghai City 200032,Shanghai
ABSTRACT Human trabecular bone specimans of femoral neck from younger and older patients were obtained.The model of osteoblast In Vitro was built by zymolysis.The result show:(1)Osteoblast derived from trabecular bone existed by polygonal or spidle-shaped in the early time and shidle-shaped in the late.(2)Black granules produced by osteoblast in early time.Black nodules apeared after two weeks.(3)the amount of bone morphogenetic protein (BGP) produced in the forteens is more than the other days.It can obtain more and pure osteoblast by this method.
, http://www.100md.com
KEY WORDS Osteoblast Culture BGP
骨科的发展，需要对成骨细胞本身进行研究，国内已有部分报道，[1，2]但取松质骨采用酶法培养成骨细胞未见报道，我们采用股骨颈部松质骨作材料，成功地得到了大量纯化的成骨细胞，现报告如下。
材料和方法
1 培养液 DMEM：F-12按1∶1配成(GIBCO)、L-谷氨酰胺(华美生物工程公司)、HEPES(SIGMA)、使用时配成20%小牛血清(中国科学院上海细胞所)。
2 试剂 胰蛋白酶(SIGMA)、胶原酶(SIGMA)、碱性磷酸酶试剂盒(上海虹桥医用试剂研究所)、骨钙素试剂盆(中国原子能研究所)。
3 取材 均取股骨颈头下型骨折的病人，取材在骨折1周内进行，取材全部为松质骨，男2例，女1例，年龄32～76岁。松质骨应保持无菌，存在4°C冰箱中，12h内分离骨细胞。
, 百拇医药
4 细胞分离培养 剔除骨内全部软组织，生理盐水反复冲洗骨质，冲洗液澄清后，用D-Hanlcs液冲洗2遍，用手术剪剪碎骨组织，大小1mm×1mm。然后骨粒放于锥形瓶中，0.01%胶原酶37°C消化30分钟，同时并给予旋转搅拌，倒去上清，再用2.5%胰酶消化3次，每次37°C振荡消化30分钟，取上清过150目尼龙网后，1200转离心10分钟，收集细胞，分别接种于3个培养皿中，置37℃饱和温度，5%CO2孵育箱中培养，置入后第3天换液，以后每2～3天换液一次。原代细胞融合成单层后，用2.5%胰酶消化，计数后以2×105个接种于6孔板中。
5 体外培养成骨细胞的鉴定
5.1 培养皿中加入盖玻片，分别于7，14天取出玻片，生理盐水冲洗，冷风吹干，饱和丙酮固定，双蒸水冲洗，碱性磷酸酶试剂盒染色。
5.2 接种于培养瓶中的细胞，每2天换液，观察细胞分泌情况和骨小结节的形成。
, 百拇医药
5.3 于培养第7、14、21、28天取上清检测骨钙素的含量，注意测BGP时，培养液换成含5%的小牛血清，培养24h取上清。
5.4 形态学观察 用倒置显微镜观察细胞的生长及形态特征。
结果
1 细胞种植4h后，可见有个别细胞已贴壁，三天后，可见较多的细胞贴壁，以梭形，多角形多见，给予换液，以后每2～3天换液一次。12～15天左右细胞形成单层，此时细胞多为梭形，胞浆丰富，透明度高，并可见有黑色颗粒分泌。传代培养后，细胞多为棱形和多角形，细胞核大，有多个突起，突起相互交叉，连接成片，培养液中有大量黑色颗粒，随着细胞增殖，细胞聚集重叠，出现大块黑色结节，在黑色结节处，可见大量的半透明小泡，培养30天左右，有多处黑色结节形成，细胞梭形排列，成叠瓦状。
2 采用偶氮偶联法，对细胞进行碱性磷酸酶染色，见第7、14天骨细胞为多角形，细胞均出现淡紫红色染色。
, 百拇医药
3 采用BGP放免试剂盆，检测BGP的含量，其结果为第二周分泌最高，在第三、四周后递减。
讨论
1 随着人们对骨科疾病如骨质疏松、骨折的研究深入，体外培养骨细胞，研究其生理代谢和病理环境下的改变，已成为不可缺少的内容。[3]目前国内外已对大鼠，鸡等动物的成骨细胞的培养进行了大量研究，方法已比较成熟。[4]对人的成骨细胞的培养，国内外采用人骨膜培养，骨粒培养法等都取得了成功。[5，6]近年来我所采用人的松质骨，用酶法可取得大量的较纯化的成骨细胞。在临床上，股骨颈骨折的病例大量存在，可为培养细胞提供大量的原材料，从而开辟了一种新的取得成骨细胞的方法。
2 本方法成骨细胞的来源，可认为是原骨基质中的骨细胞在消化后，成为活跃的骨细胞，再进行分裂增殖转变为成骨细胞。[7]细胞的纯化是成骨细胞培养的重要步骤，王氏采用机械刮除，反复贴壁法认为可取得ALP染色90%阳性的效果，而本法采用反复冲洗后，用胶原酶消化等预处理，再用胰酶消化取得大量纯化的成骨细胞，对于消化后的骨粒保存于培养液中，存放在CO2培养箱中，一周内再次用胰酶消化仍可得到成骨细胞。此法取得的成骨细胞比单纯用胶原酶消化后取得的细胞纯化度高。
, 百拇医药
3 成骨细胞的鉴定 (1)从定位上讲有细胞的ALP染色强阳性，钙结节形成。[7]研究发现，成骨细胞在培养二周内均有ALP强阳性的表现。早期成骨细胞的培养见有黑色颗粒出现，随着细胞的增殖，出现黑色结节形成，外围有大量半透明小泡，徐氏认为是骨小结节和骨小片雏型，是观察成骨现象的一个很好的模型。[8](2)从定性上讲，成骨细胞和成纤维细胞比，有大量Ⅰ型胶原的分泌，而无Ⅲ型胶原的分泌；经Pnl刺激后，细胞内cAMP浓度升高；大量骨钙素的分泌等均为骨细胞存活的特征。[9]本实验观察BGP含量在第二周进入最佳分泌期，以后逐渐减少，细胞走向衰亡。(3)从形态上讲成骨细胞有立方形，多角形和梭形等，不同部位的取材其细胞的形态不同，人松质骨来源的成骨细胞早期以多角形为主，晚期可演变成梭形，[10]所以体外培养的成骨细胞的鉴定应从形态观察、定位和定性三方面综合，以得出完整的结论。
参考文献
, 百拇医药 1.郭昭庆，党耕町，王志国，等.成人成骨细胞培养.中华骨科杂志，1995，9：627～630
2.欧阳钧，王前，王国英，等.人骨膜成骨细胞培养及初步观察.中华骨科杂志，1995，11：789～790
3.Roodman G.D Ibbotson L.J et al.1,25-Dihydroxyvitamin D3 cayses formation of multinucleated cells with several osteoclast characeristics in cultures of primate marrow.Medical Scienses,1985,8213～8217
4.侯健，刘祖德，张玲珍，等.大鼠成骨细胞白细胞介素6分泌作用及其调控.中华血液学杂志，1994，11：574～576
, 百拇医药
5.Ramela P.G,Termine J.D.Human bone cell In Vitro Calcif Tissue Int ,1985,37：453～460
6.Koshihara Y,Kawamura Met al.Establishment of human osteablastic cells derived from periosteum in culture.In Vitro Cellular & Developmental biology,1989,25:37～39
7.王前，钟世镇，龚文汇，等.鼠颅盖骨成骨细胞体外培养后ALP免疫组化法鉴别纯化.中华骨科杂志，1995，6：364～366
8.徐荣辉，柴木甫，朱雅萍，等.丹参注射液对鸡胚额骨分离细胞培养生长影响的组化学观察.中华骨科杂志，1994，185～188
9.司徒镇强，吴军正.细胞培养.世界图书降出版社，1996，111
10.柴木甫，汤雪明，徐荣辉，等.活体外鸡胚颅盖骨细胞样细胞的扫描电镜观察.中华骨科杂志，1995，2：104～106
(收稿：1998-6-4), 百拇医药
单位：王海彬 石印玉 赵咏芳，上海市曙光医院骨科 (200032 上海)；张兴凯，上海第二医科大学骨科研究所；沈培芝，上海中医药大学骨科研究所
关键词：成骨细胞；培养；骨钙素
中国中医骨伤科990201 摘要 以成年老年人股骨颈部松质骨为材料，采用酶法建立人成骨细胞体外模型，结果示：(1)来源于松质骨的成骨细胞早期以多角形、梭形为主，后期以梭形为主；(2)成骨细胞早期有黑色颗粒分泌，2周后出现黑色结节；(3)骨钙素的分泌以第14天左右达到最高，以后则递减。本法有取材方便，可得到大量、纯化的成骨细胞的优点。
Human Osteoblastic Cells Derived from Trabecular Bone Culture in Vitro
, 百拇医药
Wang Haibin,Zhang Xinkai,Shi Yinyu,et al
The Dept Orthopedic,Shuguang Hospital of Shanghai City 200032,Shanghai
ABSTRACT Human trabecular bone specimans of femoral neck from younger and older patients were obtained.The model of osteoblast In Vitro was built by zymolysis.The result show:(1)Osteoblast derived from trabecular bone existed by polygonal or spidle-shaped in the early time and shidle-shaped in the late.(2)Black granules produced by osteoblast in early time.Black nodules apeared after two weeks.(3)the amount of bone morphogenetic protein (BGP) produced in the forteens is more than the other days.It can obtain more and pure osteoblast by this method.
, http://www.100md.com
KEY WORDS Osteoblast Culture BGP
骨科的发展，需要对成骨细胞本身进行研究，国内已有部分报道，[1，2]但取松质骨采用酶法培养成骨细胞未见报道，我们采用股骨颈部松质骨作材料，成功地得到了大量纯化的成骨细胞，现报告如下。
材料和方法
1 培养液 DMEM：F-12按1∶1配成(GIBCO)、L-谷氨酰胺(华美生物工程公司)、HEPES(SIGMA)、使用时配成20%小牛血清(中国科学院上海细胞所)。
2 试剂 胰蛋白酶(SIGMA)、胶原酶(SIGMA)、碱性磷酸酶试剂盒(上海虹桥医用试剂研究所)、骨钙素试剂盆(中国原子能研究所)。
3 取材 均取股骨颈头下型骨折的病人，取材在骨折1周内进行，取材全部为松质骨，男2例，女1例，年龄32～76岁。松质骨应保持无菌，存在4°C冰箱中，12h内分离骨细胞。
, 百拇医药
4 细胞分离培养 剔除骨内全部软组织，生理盐水反复冲洗骨质，冲洗液澄清后，用D-Hanlcs液冲洗2遍，用手术剪剪碎骨组织，大小1mm×1mm。然后骨粒放于锥形瓶中，0.01%胶原酶37°C消化30分钟，同时并给予旋转搅拌，倒去上清，再用2.5%胰酶消化3次，每次37°C振荡消化30分钟，取上清过150目尼龙网后，1200转离心10分钟，收集细胞，分别接种于3个培养皿中，置37℃饱和温度，5%CO2孵育箱中培养，置入后第3天换液，以后每2～3天换液一次。原代细胞融合成单层后，用2.5%胰酶消化，计数后以2×105个接种于6孔板中。
5 体外培养成骨细胞的鉴定
5.1 培养皿中加入盖玻片，分别于7，14天取出玻片，生理盐水冲洗，冷风吹干，饱和丙酮固定，双蒸水冲洗，碱性磷酸酶试剂盒染色。
5.2 接种于培养瓶中的细胞，每2天换液，观察细胞分泌情况和骨小结节的形成。
, 百拇医药
5.3 于培养第7、14、21、28天取上清检测骨钙素的含量，注意测BGP时，培养液换成含5%的小牛血清，培养24h取上清。
5.4 形态学观察 用倒置显微镜观察细胞的生长及形态特征。
结果
1 细胞种植4h后，可见有个别细胞已贴壁，三天后，可见较多的细胞贴壁，以梭形，多角形多见，给予换液，以后每2～3天换液一次。12～15天左右细胞形成单层，此时细胞多为梭形，胞浆丰富，透明度高，并可见有黑色颗粒分泌。传代培养后，细胞多为棱形和多角形，细胞核大，有多个突起，突起相互交叉，连接成片，培养液中有大量黑色颗粒，随着细胞增殖，细胞聚集重叠，出现大块黑色结节，在黑色结节处，可见大量的半透明小泡，培养30天左右，有多处黑色结节形成，细胞梭形排列，成叠瓦状。
2 采用偶氮偶联法，对细胞进行碱性磷酸酶染色，见第7、14天骨细胞为多角形，细胞均出现淡紫红色染色。
, 百拇医药
3 采用BGP放免试剂盆，检测BGP的含量，其结果为第二周分泌最高，在第三、四周后递减。
讨论
1 随着人们对骨科疾病如骨质疏松、骨折的研究深入，体外培养骨细胞，研究其生理代谢和病理环境下的改变，已成为不可缺少的内容。[3]目前国内外已对大鼠，鸡等动物的成骨细胞的培养进行了大量研究，方法已比较成熟。[4]对人的成骨细胞的培养，国内外采用人骨膜培养，骨粒培养法等都取得了成功。[5，6]近年来我所采用人的松质骨，用酶法可取得大量的较纯化的成骨细胞。在临床上，股骨颈骨折的病例大量存在，可为培养细胞提供大量的原材料，从而开辟了一种新的取得成骨细胞的方法。
2 本方法成骨细胞的来源，可认为是原骨基质中的骨细胞在消化后，成为活跃的骨细胞，再进行分裂增殖转变为成骨细胞。[7]细胞的纯化是成骨细胞培养的重要步骤，王氏采用机械刮除，反复贴壁法认为可取得ALP染色90%阳性的效果，而本法采用反复冲洗后，用胶原酶消化等预处理，再用胰酶消化取得大量纯化的成骨细胞，对于消化后的骨粒保存于培养液中，存放在CO2培养箱中，一周内再次用胰酶消化仍可得到成骨细胞。此法取得的成骨细胞比单纯用胶原酶消化后取得的细胞纯化度高。
, 百拇医药
3 成骨细胞的鉴定 (1)从定位上讲有细胞的ALP染色强阳性，钙结节形成。[7]研究发现，成骨细胞在培养二周内均有ALP强阳性的表现。早期成骨细胞的培养见有黑色颗粒出现，随着细胞的增殖，出现黑色结节形成，外围有大量半透明小泡，徐氏认为是骨小结节和骨小片雏型，是观察成骨现象的一个很好的模型。[8](2)从定性上讲，成骨细胞和成纤维细胞比，有大量Ⅰ型胶原的分泌，而无Ⅲ型胶原的分泌；经Pnl刺激后，细胞内cAMP浓度升高；大量骨钙素的分泌等均为骨细胞存活的特征。[9]本实验观察BGP含量在第二周进入最佳分泌期，以后逐渐减少，细胞走向衰亡。(3)从形态上讲成骨细胞有立方形，多角形和梭形等，不同部位的取材其细胞的形态不同，人松质骨来源的成骨细胞早期以多角形为主，晚期可演变成梭形，[10]所以体外培养的成骨细胞的鉴定应从形态观察、定位和定性三方面综合，以得出完整的结论。
参考文献
, 百拇医药 1.郭昭庆，党耕町，王志国，等.成人成骨细胞培养.中华骨科杂志，1995，9：627～630
2.欧阳钧，王前，王国英，等.人骨膜成骨细胞培养及初步观察.中华骨科杂志，1995，11：789～790
3.Roodman G.D Ibbotson L.J et al.1,25-Dihydroxyvitamin D3 cayses formation of multinucleated cells with several osteoclast characeristics in cultures of primate marrow.Medical Scienses,1985,8213～8217
4.侯健，刘祖德，张玲珍，等.大鼠成骨细胞白细胞介素6分泌作用及其调控.中华血液学杂志，1994，11：574～576
, 百拇医药
5.Ramela P.G,Termine J.D.Human bone cell In Vitro Calcif Tissue Int ,1985,37：453～460
6.Koshihara Y,Kawamura Met al.Establishment of human osteablastic cells derived from periosteum in culture.In Vitro Cellular & Developmental biology,1989,25:37～39
7.王前，钟世镇，龚文汇，等.鼠颅盖骨成骨细胞体外培养后ALP免疫组化法鉴别纯化.中华骨科杂志，1995，6：364～366
8.徐荣辉，柴木甫，朱雅萍，等.丹参注射液对鸡胚额骨分离细胞培养生长影响的组化学观察.中华骨科杂志，1994，185～188
9.司徒镇强，吴军正.细胞培养.世界图书降出版社，1996，111
10.柴木甫，汤雪明，徐荣辉，等.活体外鸡胚颅盖骨细胞样细胞的扫描电镜观察.中华骨科杂志，1995，2：104～106
(收稿：1998-6-4), 百拇医药