HPLC法测定离体透皮接受液中丹参酮ⅡA的浓度△
作者：钟 伟 王 鹏 邹恒琴
单位：第一军医大学珠江医院中医科(广州510282)
关键词：丹参酮ⅡA；渗透液浓度；HPLC
中草药/990207摘 要 建立了测定离体透皮接受液中丹参酮ⅡA的HPLC测定法。流动相：甲醇-水(85∶15)；紫外检测波长254 nm，流速1 mL/min。实验表明在230～2 300 ng/mL浓度范围内，丹参酮ⅡA的浓度与峰高的线性关系良好，r＝0.9984。皮肤渗透液中的丹参酮ⅡA的平均回收率为101.62%，日内、日间RSD分别为4.45%及4.23%。该法简便，分离完全，结果可靠，适用于丹参酮ⅡA的离体透皮液浓度的测定。
丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA，Tan ⅡA)是丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的脂溶性成分之一，具有抗心肌缺血作用。近年来，有人用以丹参为主的活血化瘀中药制成透皮制剂治疗冠心病，取得了较好的疗效。但由于丹参的化学成分结构复杂、成分较多，有关其透皮特点的基础研究比较困难，为此我们从单一成分入手，选择Tan ⅡA作为定量研究其透皮特点的有效成分，建立了检测离体透皮吸收量的HPLC法。
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Determination of Tanshinone ⅡA in vitro
Permeability Concentration by HPLC
Zhong Wei, Wang Peng and Zou Hengqin
(Zhujiang Hospital of the First Military Medical University , Guangzhou, 510282)
Abstract HPLC method was established for the determination of Tanshinone ⅡA (Tan ⅡA) concentration in the Valia-Chien diffusion cell. The mobile phase consisted of methanol : water (85∶15). The detected wave length was 254 nm and flow rate was 1 ml/min. The assay linearity was determined over the range of 230-2300 ng/ml in 5% PEG 600 permeability solution (r＝0.9984). The mean recovery of Tan ⅡA was 101.62%. The within day and day to day variations were 4.45% and 4.23% respectively which were both less than 10%. The method is simple, rapid, and reliable. It is suitable for the determination of Tan ⅡA concentration.
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Key words Tanshinone ⅡA in vitro permeability concentration HPLC
1 仪器、样品与试剂
日本岛津LC-6A高效液相色谱仪；紫外可见检测器SPD-6AV；柱恒温箱CTD-6A；C-R4A Chormatopac数据处理仪；色谱柱：Nucleosil TC 18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；20 μL进样器(澳大利亚)；Valia-Chien双室扩散池(上海医科大学药剂教研室定做)。
Tan ⅡA对照品由广东药学院提供，Tan ⅡA样品：由广州市医药工业研究所用CO2超临界流体萃取技术从紫丹参中萃取所得。所用试剂为分析纯。
2 实验方法与结果
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2.1 对照品溶液：精密称取TanⅡA对照品2.3 mg放入100 mL量瓶中，用少量乙醇溶解后加5% PEG 600至刻度成为23 μg/mL的Tan ⅡA对照品溶液。
2.2 分析测定方法
2.2.1 色谱条件：流动相为甲醇-水(85∶15)，流速：1.00 mL/min，检测波长254 nm，灵敏度0.01 AUFS，纸速2 mm/min。
在上述色谱条件下测得的TanⅡA对照品色谱图见图1。
*为Tan ⅡA，余为杂质峰
图1 TanⅡA对照品色谱图
, 百拇医药
2.2.2 标准曲线的制备：取10 mL量瓶10支，分别加入TanⅡA对照品溶液0.1～1.0 mL，然后加入5% PEG 600至刻度，使其终浓度分别为230、460、690、920、1 150、1 380、1 610、1 840、2 070、2 300 ng/mL。各进样15 μL，对照品色谱峰的峰高(H)与浓度(C)在230～2 300 ng/mL范围内呈良好的线性关系，回归方程：C＝72.1739+0.4788H，r＝0.9984，P<0.01。
2.2.3 回收率试验：在5%PEG 600的皮肤渗透接受液样品(浓度为575、1 265、1 955 ng/mL)中精密加入一定量的TanⅡA对照品，按上述方法测定TanⅡA浓度，结果回收率为101.62%(n＝3)。
2.2.4 精密度试验：将上述3种浓度的TanⅡA对照品皮肤渗液样品按标准曲线项下方法测定对照品峰高，同日内测定日内误差，连续3 d测定日间误差，结果日内RSD＝4.45%，日间RSD＝4.23%(n＝3)。
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2.2.5 样品测定：脱毛并去除皮下脂肪的SD大鼠腹部皮肤置于Valia-Chien双室扩散池中，以5%PEG 600为TanⅡA经皮渗透的接受液，在预定时间内从接受液中取样15 μL，按上述方法测定TanⅡA峰高，见图2。
*为TanⅡA，余为杂质峰
图2 渗透接受液中TanⅡA样品色谱图
3 讨论
本文参考了以往用HPLC法测定丹参药材中TanⅡA含量的做法〔3〕，但在流动相中所用甲醇浓度有所不同，当流动相为85%的甲醇时，在TanⅡA对照品色谱图中，其保留时间为9 min，在TanⅡA经皮渗透液样品的色谱图中其保留时间同样为9 min，与在此之前出现的杂质峰得到了基线分离。整个操作过程简单，保留时间短，分离完全，结果可靠。目前用于中药离体透皮实验的方法已有许多，高玉升等用UV三阶导数和HPLC法测定了丹参酮Ⅰ的透皮吸收率〔4〕，但用HPLC法测定TanⅡA的离体透皮量尚未见报道。本文用该法进行TanⅡA的离体透皮研究初获成功，值得进一步加以推广应用。
, 百拇医药
*Address:Zhong Wei ,Zhujiang Hospital of First Military Medical University ,Guangzhou
作者简介：钟伟 女，第一军医大学珠江医院中医科副主任医师，副教授。1984年7月毕业于第一军医大学军医系并留校任教，1988年9月考入上海中医学院攻读硕士学位研究生，1991年7月毕业获得硕士学位，其后一直在珠江医院中医科从事中西医结合内科的医，教，研工作，主要从事中西医结合心血管的临床与实验研究工作。
△国家自然科学基金资助课题 批准号39400180
参 考 文 献
[1] 贝自强，等.中医杂志，1985，26(8)：32
[2] 蔡文元.江苏中医杂志，1986，7(12)：7
[3] 王慕邹，等.药物分析杂志，1985，5(6)：348
[4] 高玉升，等.中草药，1992，23(9)：465
(1998-03-08收稿), http://www.100md.com
单位：第一军医大学珠江医院中医科(广州510282)
关键词：丹参酮ⅡA；渗透液浓度；HPLC
中草药/990207摘 要 建立了测定离体透皮接受液中丹参酮ⅡA的HPLC测定法。流动相：甲醇-水(85∶15)；紫外检测波长254 nm，流速1 mL/min。实验表明在230～2 300 ng/mL浓度范围内，丹参酮ⅡA的浓度与峰高的线性关系良好，r＝0.9984。皮肤渗透液中的丹参酮ⅡA的平均回收率为101.62%，日内、日间RSD分别为4.45%及4.23%。该法简便，分离完全，结果可靠，适用于丹参酮ⅡA的离体透皮液浓度的测定。
丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA，Tan ⅡA)是丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的脂溶性成分之一，具有抗心肌缺血作用。近年来，有人用以丹参为主的活血化瘀中药制成透皮制剂治疗冠心病，取得了较好的疗效。但由于丹参的化学成分结构复杂、成分较多，有关其透皮特点的基础研究比较困难，为此我们从单一成分入手，选择Tan ⅡA作为定量研究其透皮特点的有效成分，建立了检测离体透皮吸收量的HPLC法。
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Determination of Tanshinone ⅡA in vitro
Permeability Concentration by HPLC
Zhong Wei, Wang Peng and Zou Hengqin
(Zhujiang Hospital of the First Military Medical University , Guangzhou, 510282)
Abstract HPLC method was established for the determination of Tanshinone ⅡA (Tan ⅡA) concentration in the Valia-Chien diffusion cell. The mobile phase consisted of methanol : water (85∶15). The detected wave length was 254 nm and flow rate was 1 ml/min. The assay linearity was determined over the range of 230-2300 ng/ml in 5% PEG 600 permeability solution (r＝0.9984). The mean recovery of Tan ⅡA was 101.62%. The within day and day to day variations were 4.45% and 4.23% respectively which were both less than 10%. The method is simple, rapid, and reliable. It is suitable for the determination of Tan ⅡA concentration.
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Key words Tanshinone ⅡA in vitro permeability concentration HPLC
1 仪器、样品与试剂
日本岛津LC-6A高效液相色谱仪；紫外可见检测器SPD-6AV；柱恒温箱CTD-6A；C-R4A Chormatopac数据处理仪；色谱柱：Nucleosil TC 18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；20 μL进样器(澳大利亚)；Valia-Chien双室扩散池(上海医科大学药剂教研室定做)。
Tan ⅡA对照品由广东药学院提供，Tan ⅡA样品：由广州市医药工业研究所用CO2超临界流体萃取技术从紫丹参中萃取所得。所用试剂为分析纯。
2 实验方法与结果
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2.1 对照品溶液：精密称取TanⅡA对照品2.3 mg放入100 mL量瓶中，用少量乙醇溶解后加5% PEG 600至刻度成为23 μg/mL的Tan ⅡA对照品溶液。
2.2 分析测定方法
2.2.1 色谱条件：流动相为甲醇-水(85∶15)，流速：1.00 mL/min，检测波长254 nm，灵敏度0.01 AUFS，纸速2 mm/min。
在上述色谱条件下测得的TanⅡA对照品色谱图见图1。
*为Tan ⅡA，余为杂质峰
图1 TanⅡA对照品色谱图
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2.2.2 标准曲线的制备：取10 mL量瓶10支，分别加入TanⅡA对照品溶液0.1～1.0 mL，然后加入5% PEG 600至刻度，使其终浓度分别为230、460、690、920、1 150、1 380、1 610、1 840、2 070、2 300 ng/mL。各进样15 μL，对照品色谱峰的峰高(H)与浓度(C)在230～2 300 ng/mL范围内呈良好的线性关系，回归方程：C＝72.1739+0.4788H，r＝0.9984，P<0.01。
2.2.3 回收率试验：在5%PEG 600的皮肤渗透接受液样品(浓度为575、1 265、1 955 ng/mL)中精密加入一定量的TanⅡA对照品，按上述方法测定TanⅡA浓度，结果回收率为101.62%(n＝3)。
2.2.4 精密度试验：将上述3种浓度的TanⅡA对照品皮肤渗液样品按标准曲线项下方法测定对照品峰高，同日内测定日内误差，连续3 d测定日间误差，结果日内RSD＝4.45%，日间RSD＝4.23%(n＝3)。
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2.2.5 样品测定：脱毛并去除皮下脂肪的SD大鼠腹部皮肤置于Valia-Chien双室扩散池中，以5%PEG 600为TanⅡA经皮渗透的接受液，在预定时间内从接受液中取样15 μL，按上述方法测定TanⅡA峰高，见图2。
*为TanⅡA，余为杂质峰
图2 渗透接受液中TanⅡA样品色谱图
3 讨论
本文参考了以往用HPLC法测定丹参药材中TanⅡA含量的做法〔3〕，但在流动相中所用甲醇浓度有所不同，当流动相为85%的甲醇时，在TanⅡA对照品色谱图中，其保留时间为9 min，在TanⅡA经皮渗透液样品的色谱图中其保留时间同样为9 min，与在此之前出现的杂质峰得到了基线分离。整个操作过程简单，保留时间短，分离完全，结果可靠。目前用于中药离体透皮实验的方法已有许多，高玉升等用UV三阶导数和HPLC法测定了丹参酮Ⅰ的透皮吸收率〔4〕，但用HPLC法测定TanⅡA的离体透皮量尚未见报道。本文用该法进行TanⅡA的离体透皮研究初获成功，值得进一步加以推广应用。
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*Address:Zhong Wei ,Zhujiang Hospital of First Military Medical University ,Guangzhou
作者简介：钟伟 女，第一军医大学珠江医院中医科副主任医师，副教授。1984年7月毕业于第一军医大学军医系并留校任教，1988年9月考入上海中医学院攻读硕士学位研究生，1991年7月毕业获得硕士学位，其后一直在珠江医院中医科从事中西医结合内科的医，教，研工作，主要从事中西医结合心血管的临床与实验研究工作。
△国家自然科学基金资助课题 批准号39400180
参 考 文 献
[1] 贝自强，等.中医杂志，1985，26(8)：32
[2] 蔡文元.江苏中医杂志，1986，7(12)：7
[3] 王慕邹，等.药物分析杂志，1985，5(6)：348
[4] 高玉升，等.中草药，1992，23(9)：465
(1998-03-08收稿), http://www.100md.com