广州胃病患者幽门螺杆菌多株感染的研究*
作者：曾志荣 陈湖 胡品津 崔 毅 陈 为 彭晓忠
单位：山医科大学附属一院消化内科 广东省广州市 510080
关键词：螺杆菌，幽门； 胃溃疡； 十二指肠溃疡； 胃炎；胃镜检查
世界华人消化杂志990206 摘 要
目的 了解我国Hp感染人群中的多株感染状况.
方法 取因上腹不适行内镜检查的20例Hp阳性患者(胃溃疡6例，十二指肠溃疡8例，慢性胃炎6例)的胃窦和胃体粘膜组织，进行Hp培养. 初代培养后，分别取胃窦和胃体各10个菌落进行传代，抽提各菌落DNA，应用聚合酶链反应随机引物扩增的DNA多态指模技术[RAPD-PCR]进行菌株鉴定.
结果 PCR扩增产物电泳分析显示有18例患者胃窦和胃体的Hp DNA指模一致，提示这18例患者均是单株感染；另有2例胃体菌株表现为两种指模形态，提示为2株Hp感染.
, 百拇医药
结论 广州地区存在Hp多株感染，但不普遍.
中国图书资料分类号 R573.1
Multiple strains of Helicobacter
pylori infection in patients with
gastropathy in Guangzhou*
ZENG Zhi-Rong, CHEN Min-Hu, HU Pin-Jin, CUI Yi, CHEN Wei and PENG Xiao-Zhong
Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Subject headings Helicobacter pylori; stomach ulcer; duodenal ulcer; gastritis; gastroscopy
Abstract
AIM To study multiple strains of Helicobacter pylori infection in Chinese subjects.
METHODS H.pylori isolated from 20 patients with gastropathy (gastric ulcer, 6 patients; duodenal ulcer, 8; and chronic gastritis, 6) were analyzed by PCR-based RAPD fingerprinting. Two biopsy samples taken from the gastric antrum and body were cultured, and generations of 20 colonies of H.pylori per subject (antrum 10 colonies, body 10 colonies) were analyzed.
, 百拇医药
RESULTS In 18 patients, DNA fingerprinting patterns of all colonies were identical, but 2 patients had two patterns in gastric body.
CONCLUSION Most H.pylori infection is of single strain, and multiple-strain infection is not popular in Guangzhou area.
0 引言
幽门螺杆菌(Hp)是一种重要的致病菌，根据是否表达CagA及VacA蛋白，在表型上主要可以分为Ⅰ型(CagA+，VacA+)和Ⅱ型(CagA-,VacA-)；而从基因水平来看，各株Hp在基因组序列上均存在一定差异. 在Hp感染人群中存在2株甚至2株以上Hp菌株的多株感染[1,2]. 有关我国Hp多株感染的流行病学研究甚少，多株感染资料不仅对流行病学而且对于了解我国与致病有关的特异基因型菌株都有重要意义. 为此，我们应用PCR随机引物扩增的DNA多态指模技术(RAPD-PCR)进行菌株鉴定[3]，研究我国Hp感染人群的多株感染发生率.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 因上腹不适行内镜检查病例20例，胃溃疡6例，十二指肠溃疡8例，慢性胃炎6例，其中男12例，女8例. 取胃窦和胃体粘膜组织各一块进行Hp培养，所有病例胃粘膜尿素酶试验均阳性.
1.2 方法 ①Hp培养：采用改良Skirrow培养基(含50g/L的脱纤维羊血及万古霉素、二性霉素、多粘菌素等抗生素). Hp的鉴定包括菌落形态、尿素酶、涂片观察形态等. 初代培养后，各取10个边界清楚的菌落再进行传代至有足够的细菌供以下的研究. ②DNA抽提：将培养菌放于400μL TE中混匀，经溶菌酶、SDS、蛋白酶K及氯仿-酚等处理，最后抽提的DNA溶于TE中，放于-20℃保存待用. ③RAPD-PCR反应条件[3]：引物序列为5＇-GTGGATGCGA-3＇(中山医科大学遗传研究室负责合成)，总反应体积25μL，含MgCl2 3mmol/L，引物20pmol，Taq酶(购自中山医科大学遗传研究室)2U，dNTPs浓度为250μmol/L、模板20ng等. 反应条件：94℃预变性300s，94℃ 30s，36℃ 30s, 72℃ 90s共35个循环，最后72℃后600s. ④PCR产物的分析：取产物10μL电泳，20g/L琼脂糖凝胶，60V，2h，EB染色.
, http://www.100md.com
2 结果
所有患者的胃窦、胃体粘膜Hp培养均为阳性，菌落边界清晰，各取10个单个菌落进行传代，经1～2次传代后Hp菌落明显增加，除收集部分细菌保存外余供DNA抽提. 按上述条件进行扩增和分析，结果显示20例患者的Hp菌株DNA指模完全不同，呈明显多态性，说明他们的感染是由不同Hp菌株引起(图1). 在20例患者中，有18例各自胃窦、胃体的20株Hp DNA指模完全一致，说明这18例患者均为单株感染；另有2例患者胃体分离菌表现为两种不同的DNA指模形态，而胃窦一致，提示该患者胃体感染2株不同菌株(图2).
图1 不同患者Hp DNA指模不同，M为DNA marker (PBR322 DNA/BstNⅠ)
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图2 一患者胃窦(1～5)和胃体(6～10)各5株Hp分离菌株的DNA指模，胃体表现为两种指模形态，M为DNA marker (PBR322 DNA/BstNⅠ)
3 讨论
目前用于Hp菌株鉴定的方法有PCR-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)、PCR-单链构像多态性技术(PCR-SSCP)和PCR-随机引物扩增的DNA多态指模技术(RAPD-PCR)等技术. 我们曾采用RAPD-PCR技术研究了40株由不同患者分离而得的Hp菌株，结果表明不同的Hp菌株有不同的指模；进而我们比较了5株传代10次以上Hp菌株的DNA指模，发现各株Hp传代前后的DNA指模相同，说明RAPD-PCR技术是稳定可靠的[3]. 近年研究表明，Hp在基因型上Hp菌株呈明显多样性. 本组20例患者的DNA指模各不相同也说明这一点. 由于人群的Hp高感染和交往的频繁，这就提出Hp的感染是否为混合感染 Owen et al[1]发现在Hp感染人群中，从胃粘膜不同部位分离而得的菌株具有明显的异质性，认为Hp的感染均为混合感染，类似的结果也见于Beji et al[2]的报道. 而Hirschl et al[4]研究发现在15例患者中仅有1例患者同时伴2株菌感染， 余14例患者均为单株感染. 我们应用RAPD-PCR技术分析了20例患者的胃窦、胃体各10株分离菌的DNA指模形态，表明在本地区Hp多株感染并不多见，而以单株感染为主. 和Owen et al的结果不同的原因可能与所研究的病例来源及研究方法不同有关. 虽然我们的结果表明多株感染发生率仅为10%，但我们的病例均为胃癌低发区的广州市，而对于我国胃癌高发区的Hp感染人群和家庭内的多株感染发生情况尚不明确，有待进一步研究.
, 百拇医药
作者简介:曾志荣，男，1966-09-16生，江西乐安县人，汉族. 1989年江西医学院医疗系毕业，1996年中山医科大学硕士毕业，现为中山医科大学附属一院消化内科博士研究生，主要从事幽门螺杆菌相关性疾病的研究，已发表论文6篇.
*高等学校博士点基金；广东省科委自然科学基金，No.970046.
通讯作者 曾志荣，510080，中山医科大学附属一院消化内科,广东省广州市.
*Supported by research funds from the National Education Commission and Natural Science Fundation of the Scientific Committee of Guangdong Province, No.970046.
, 百拇医药
Correspondence to:ZENG Zhi-Rong, Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Tel. +86.20.87755766 Ext. 8172, Fax. +86*20*87750632
4 参考文献
[1] Owen RJ, Desai M, Figura N, Bayeli PF, Di Gregorio L, Russi M. Comparison between degree of histological gastritis and DNA fingerprint, cytotoxicity and adhesivity of Helicobacter pylori from different gastric sites. Eur J Epidemiol, 1993;9:315-321
, http://www.100md.com
[2] Beji A, Vincent P, Dachis L, Husson MO, Cortol A, Leelere H. Evidence of gastritis with several Helicobacter pylori stains. Lancet, 1989;2:1402-1403
[3] 陈湖，曾志荣，胡品津. 多聚合酶链式反应随机引物扩增的DNA多态指模技术在幽门螺杆菌菌株鉴别中的应用. 现代消化病及内镜杂志，1996；1：285-288
[4] Hirschl AM, Richter M, Makristathis A, Pruckl PM, Willinger B, Schutze K. Single and multiple strain colonization in patients with Helicobacter pylori associated gastritis: detection by macrorestriction DNA analysis. J Infect Dis, 1994;170:473-475
收稿日期 1998-06-06, 百拇医药
单位：山医科大学附属一院消化内科 广东省广州市 510080
关键词：螺杆菌，幽门； 胃溃疡； 十二指肠溃疡； 胃炎；胃镜检查
世界华人消化杂志990206 摘 要
目的 了解我国Hp感染人群中的多株感染状况.
方法 取因上腹不适行内镜检查的20例Hp阳性患者(胃溃疡6例，十二指肠溃疡8例，慢性胃炎6例)的胃窦和胃体粘膜组织，进行Hp培养. 初代培养后，分别取胃窦和胃体各10个菌落进行传代，抽提各菌落DNA，应用聚合酶链反应随机引物扩增的DNA多态指模技术[RAPD-PCR]进行菌株鉴定.
结果 PCR扩增产物电泳分析显示有18例患者胃窦和胃体的Hp DNA指模一致，提示这18例患者均是单株感染；另有2例胃体菌株表现为两种指模形态，提示为2株Hp感染.
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结论 广州地区存在Hp多株感染，但不普遍.
中国图书资料分类号 R573.1
Multiple strains of Helicobacter
pylori infection in patients with
gastropathy in Guangzhou*
ZENG Zhi-Rong, CHEN Min-Hu, HU Pin-Jin, CUI Yi, CHEN Wei and PENG Xiao-Zhong
Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
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Subject headings Helicobacter pylori; stomach ulcer; duodenal ulcer; gastritis; gastroscopy
Abstract
AIM To study multiple strains of Helicobacter pylori infection in Chinese subjects.
METHODS H.pylori isolated from 20 patients with gastropathy (gastric ulcer, 6 patients; duodenal ulcer, 8; and chronic gastritis, 6) were analyzed by PCR-based RAPD fingerprinting. Two biopsy samples taken from the gastric antrum and body were cultured, and generations of 20 colonies of H.pylori per subject (antrum 10 colonies, body 10 colonies) were analyzed.
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RESULTS In 18 patients, DNA fingerprinting patterns of all colonies were identical, but 2 patients had two patterns in gastric body.
CONCLUSION Most H.pylori infection is of single strain, and multiple-strain infection is not popular in Guangzhou area.
0 引言
幽门螺杆菌(Hp)是一种重要的致病菌，根据是否表达CagA及VacA蛋白，在表型上主要可以分为Ⅰ型(CagA+，VacA+)和Ⅱ型(CagA-,VacA-)；而从基因水平来看，各株Hp在基因组序列上均存在一定差异. 在Hp感染人群中存在2株甚至2株以上Hp菌株的多株感染[1,2]. 有关我国Hp多株感染的流行病学研究甚少，多株感染资料不仅对流行病学而且对于了解我国与致病有关的特异基因型菌株都有重要意义. 为此，我们应用PCR随机引物扩增的DNA多态指模技术(RAPD-PCR)进行菌株鉴定[3]，研究我国Hp感染人群的多株感染发生率.
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1 材料和方法
1.1 材料 因上腹不适行内镜检查病例20例，胃溃疡6例，十二指肠溃疡8例，慢性胃炎6例，其中男12例，女8例. 取胃窦和胃体粘膜组织各一块进行Hp培养，所有病例胃粘膜尿素酶试验均阳性.
1.2 方法 ①Hp培养：采用改良Skirrow培养基(含50g/L的脱纤维羊血及万古霉素、二性霉素、多粘菌素等抗生素). Hp的鉴定包括菌落形态、尿素酶、涂片观察形态等. 初代培养后，各取10个边界清楚的菌落再进行传代至有足够的细菌供以下的研究. ②DNA抽提：将培养菌放于400μL TE中混匀，经溶菌酶、SDS、蛋白酶K及氯仿-酚等处理，最后抽提的DNA溶于TE中，放于-20℃保存待用. ③RAPD-PCR反应条件[3]：引物序列为5＇-GTGGATGCGA-3＇(中山医科大学遗传研究室负责合成)，总反应体积25μL，含MgCl2 3mmol/L，引物20pmol，Taq酶(购自中山医科大学遗传研究室)2U，dNTPs浓度为250μmol/L、模板20ng等. 反应条件：94℃预变性300s，94℃ 30s，36℃ 30s, 72℃ 90s共35个循环，最后72℃后600s. ④PCR产物的分析：取产物10μL电泳，20g/L琼脂糖凝胶，60V，2h，EB染色.
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2 结果
所有患者的胃窦、胃体粘膜Hp培养均为阳性，菌落边界清晰，各取10个单个菌落进行传代，经1～2次传代后Hp菌落明显增加，除收集部分细菌保存外余供DNA抽提. 按上述条件进行扩增和分析，结果显示20例患者的Hp菌株DNA指模完全不同，呈明显多态性，说明他们的感染是由不同Hp菌株引起(图1). 在20例患者中，有18例各自胃窦、胃体的20株Hp DNA指模完全一致，说明这18例患者均为单株感染；另有2例患者胃体分离菌表现为两种不同的DNA指模形态，而胃窦一致，提示该患者胃体感染2株不同菌株(图2).
图1 不同患者Hp DNA指模不同，M为DNA marker (PBR322 DNA/BstNⅠ)
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图2 一患者胃窦(1～5)和胃体(6～10)各5株Hp分离菌株的DNA指模，胃体表现为两种指模形态，M为DNA marker (PBR322 DNA/BstNⅠ)
3 讨论
目前用于Hp菌株鉴定的方法有PCR-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)、PCR-单链构像多态性技术(PCR-SSCP)和PCR-随机引物扩增的DNA多态指模技术(RAPD-PCR)等技术. 我们曾采用RAPD-PCR技术研究了40株由不同患者分离而得的Hp菌株，结果表明不同的Hp菌株有不同的指模；进而我们比较了5株传代10次以上Hp菌株的DNA指模，发现各株Hp传代前后的DNA指模相同，说明RAPD-PCR技术是稳定可靠的[3]. 近年研究表明，Hp在基因型上Hp菌株呈明显多样性. 本组20例患者的DNA指模各不相同也说明这一点. 由于人群的Hp高感染和交往的频繁，这就提出Hp的感染是否为混合感染 Owen et al[1]发现在Hp感染人群中，从胃粘膜不同部位分离而得的菌株具有明显的异质性，认为Hp的感染均为混合感染，类似的结果也见于Beji et al[2]的报道. 而Hirschl et al[4]研究发现在15例患者中仅有1例患者同时伴2株菌感染， 余14例患者均为单株感染. 我们应用RAPD-PCR技术分析了20例患者的胃窦、胃体各10株分离菌的DNA指模形态，表明在本地区Hp多株感染并不多见，而以单株感染为主. 和Owen et al的结果不同的原因可能与所研究的病例来源及研究方法不同有关. 虽然我们的结果表明多株感染发生率仅为10%，但我们的病例均为胃癌低发区的广州市，而对于我国胃癌高发区的Hp感染人群和家庭内的多株感染发生情况尚不明确，有待进一步研究.
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作者简介:曾志荣，男，1966-09-16生，江西乐安县人，汉族. 1989年江西医学院医疗系毕业，1996年中山医科大学硕士毕业，现为中山医科大学附属一院消化内科博士研究生，主要从事幽门螺杆菌相关性疾病的研究，已发表论文6篇.
*高等学校博士点基金；广东省科委自然科学基金，No.970046.
通讯作者 曾志荣，510080，中山医科大学附属一院消化内科,广东省广州市.
*Supported by research funds from the National Education Commission and Natural Science Fundation of the Scientific Committee of Guangdong Province, No.970046.
, 百拇医药
Correspondence to:ZENG Zhi-Rong, Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Tel. +86.20.87755766 Ext. 8172, Fax. +86*20*87750632
4 参考文献
[1] Owen RJ, Desai M, Figura N, Bayeli PF, Di Gregorio L, Russi M. Comparison between degree of histological gastritis and DNA fingerprint, cytotoxicity and adhesivity of Helicobacter pylori from different gastric sites. Eur J Epidemiol, 1993;9:315-321
, http://www.100md.com
[2] Beji A, Vincent P, Dachis L, Husson MO, Cortol A, Leelere H. Evidence of gastritis with several Helicobacter pylori stains. Lancet, 1989;2:1402-1403
[3] 陈湖，曾志荣，胡品津. 多聚合酶链式反应随机引物扩增的DNA多态指模技术在幽门螺杆菌菌株鉴别中的应用. 现代消化病及内镜杂志，1996；1：285-288
[4] Hirschl AM, Richter M, Makristathis A, Pruckl PM, Willinger B, Schutze K. Single and multiple strain colonization in patients with Helicobacter pylori associated gastritis: detection by macrorestriction DNA analysis. J Infect Dis, 1994;170:473-475
收稿日期 1998-06-06, 百拇医药