IL-1、IL-6和活化枯否细胞培养上清液对约氏疟原虫红外期发育的影响
作者：郝宏兴 黄复生 况明书 段建华
单位：第三军医大学基础医学部寄生虫学教研室 重庆，400038
关键词：白细胞介素-1；白细胞介素-6；枯否细胞；约氏疟原虫红外期
第三军医大学学报990210
提要 目的：研究IL-1、IL-6和活化枯否细胞(Kc)产物对约氏疟原虫红外期(EEF)发育的影响。方法：大鼠腹腔注射IL-1、IL-6或合用，3 h后接种子孢子(Sp)，42 h后观察EEF发育情况；建立大鼠肝细胞-约氏疟原虫体外培养模型，Sp接种后2 h加IL-1、IL-6及激活后Kc培养上清，观察对EEF发育的影响。结果：IL-1组、合用组Sp发育率明显降低，IL-6组无明显下降；IL-1、IL-6明显抑制培养的EEF发育；激活Kc培养上清也可抑制EEF发育，EEF成熟度低、体积小。结论：IL-1、IL-6在体内外和接种Sp前后均可抑制EEF的发育。
, 百拇医药
中图法分类号 R531.3
Effects of cytokines and supernatant of cultured activated Kuppfer cells on development of exo-erythrocytic forms of Plasmodium yoelii in rats
Hao Hongxing, Huang Fusheng, Kuang Mingshu, Duan Jianhua
(Department of Parasitology, Faculty of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
Abstract Objective: To study the effects of IL-1 and IL-6 and supernatant of cultured activated Kuppfer cells on the development of exo-erythrocytic forms (EEFs) of Plasmodium yoelii (P. yoelii). Methods: Rats were injected intraperitoneally with IL-1, IL-6 or both and inoculated with sporozoites (SP) 3 h later. At the 42nd h after the inoculation, the SP viability and the diameter of EEFs were determined. After the model of in vitro culture of hepatic cell-P. yoelii was established in rats, the animals were inoculated with SP. At the 2nd h after the inoculation, IL-1, IL-6 and the supernatant of cultured activated Kuppfer cells were added to observe their effects on the development of EEFs of P. yoelii. Results: The SP viability of the IL-1 group was decreased to 41.32%. IL-1+IL-6 group presented the complete inhibition of EEF development. In the IL-6 group, the size of EEFs was much smaller than that in the control (P<0.001) though no significant changes of the SP viability were found. In vitro, the percentage of inhibition of the EEF development was 37.8% and 60.6% respectively in the 20 U/ml IL-1 group and 20 U/ml IL-6 group. The development of EEFs was also significantly inhibited in the hepatic cells cultured with the supernatant of the cultured activated Kuppfer cells. Conclusion: IL-1, IL-6 and the supernatant of cultured activated Kuppfer cells can inhibit the EEF development of P. yoelii.
, 百拇医药
Key words IL-1; IL-6; Kuppfer cell; Plasmodium yoelii; exo-erythrocytic form; rat
枯否细胞(Kc)可吞噬侵入机体的子孢子(Sp)[1]，并合成TNF-α、IL-1和IL-6等活性物质以抑制疟原虫红外期(EEF)的发育[2]。以往实验均为单纯计算EEF数/cm2，未考虑肝脏体积，误差较大。本研究选用较真实反映EEF发育情况的Sp发育率，探讨IL-1和IL-6及活化后Kc产物对EEF发育的影响。
1 材料和方法
约氏疟原虫BY265株，斯氏按蚊Hor株，本室常规饲养。Wistar大鼠。rhIL-1，rhIL-6(北京邦定公司)。
大鼠肝细胞分离 参照Seglen[3]报道的方法。
, http://www.100md.com
Sp的分离：无菌解剖感染后17 d按蚊唾液腺，洗3次后压碎，加培养基收集Sp并计数(体外培养用)；或将蚊胸部剪下，加5%葡萄糖盐水研磨，500 r/min，离心3 min，共2次，收集上清液并计数Sp数量(体内实验用)。
激活Kc培养上清液制备：每2万Kc加BCG 75 μg和LPS 10 μg，收集18 h培养上清(SKc)，-20℃保存备用。
实验组大鼠腹腔注射0.5 ml PBS，内含细胞因子。第一组：IL-1，5×103U；第二组：IL-6，1×104U；第三组：IL-1，IL-6各1×104 U；第四组：0.5 ml PBS作对照，3 h后经尾静脉接种Sp 30万/只，42 h后活杀动物，常规制片，计数检出EEF数量，计算Sp发育率[4]，测定原虫直径。
24孔板(内放10×10 mm盖片)每孔接种肝细胞2万，培养12 h后接种Sp 2万/孔，2 h后换液并加入含细胞因子的培养基继续培养，每天换液一次，48 h时取出盖片，常规处理，Giemsa染色，计数EEF数目，与对照组比较，计算抑制率，并观察EEF的形态、结构。
, 百拇医药
2 结果
2.1 IL-1、IL-6对大鼠体内约氏疟原虫Sp入侵和EEF发育的影响
实验组的Sp发育率分别为1.38%、2.46%和0.01%，对照组是3.34%。可见5×103U IL-1能使Sp发育率降低近2/3(P<0.05)；而1×104U的IL-6无明显影响；合用组仅发现一个原虫，EEF的发育被显著抑制。EEF呈圆形和椭圆形，内含大量细小的裂殖子。IL-1、IL-6组EEF的直径分别是16.38 μm和17.41 μm，均明显小于对照组(21.62 μm，P<0.05)。合用组肝组织中可见大量白细胞浸润灶，提示细胞因子可能影响并损伤EEF发育，诱致肝组织发生急性期反应。
2.2 IL-1、Kc上清和IL-6对培养肝细胞内EEF发育的影响
从表1、2可见，IL-1的浓度越大，EEF发育的抑制率越高，浓度为100 U/ml时，抑制率达88.3%～91.9%。Kc上清组平均检出5～6个原虫，抑制率是47.0%～59.5%。对照组EEF体积较大，核数量多，发育较成熟，见图1。实验组EEF体积小，核数量少，有的可见空泡化等退变表现，见图2。IL-6抑制EEF发育的作用也呈剂量依赖特点，EEF形态与IL-1组类似。100 U/ml组和IL-1，6合用组未见原虫。
, 百拇医药
表1 IL-1和Kc上清对培养肝细胞内EEF发育的影响
Tab 1 Effects of IL-1 and the SKc on the development of EEF in vitro IL-1
Ⅰ EEF/cm2
Inhibition
Ⅱ EEF/cm2
Inhibition
(U/ml)
(x±s)
%
(x±s)
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%
20
7.7±0.6
32.3
7.0±2.0
43.2
40
5.0±1.0
55.9
5.3±1.2
56.8
100
1.3±0.6
, http://www.100md.com
88.3
1.0±1.0
91.9
SKc 0.5 ml
6.0±1.0
47.0
5.0±1.7
59.5
Control
11.3±2.3
12.3±2.1
3 wells/group, Ⅰ Ⅱ：Expt series表2 IL-6对培养肝细胞内EEF发育的影响
, http://www.100md.com
Tab 2 Effects of IL-6 on the development of EEF in vitro IL-6
Ⅰ EEF/cm2
Inhibition
Ⅱ EEF/cm2
Inhibition
(U/ml)
(
±s)
%
(±s)
, 百拇医药
%
20
3.7±0.5
65.6
4.0±1.0
55.6
40
1.3±0.6
87.5
0.7±0.6
93.7
100
0.0±0.0
, 百拇医药
100.0
0.0±0.0
100.0
Control
10.7±3.1
9.0±1.0
3 wells/group, Ⅰ Ⅱ:Expt series
图1 对照组培养的EEF，体积大，核多 (姬姆萨染色×1 000)
Fig 1 Cultured EEF with larger size and more nuclei in control group (Giemsa stain×1 000)
, 百拇医药
图2 IL-1组培养的EEF，体积小，核数量少，虫体空泡化 (姬姆萨染色×1 000)
Fig 2 Cultured EEF size smaller with fewer nuclei and vacuoles formation in IL-1 group (Giemsa stain×1 000)
3 讨论
Vreden等[2]报道，Sp接种前106U IL-6或与2.5×103U IL-1合用，几乎完全抑制伯氏疟原虫EEF的发育，接种6、24 h后，IL-6的抑制率降低为62%和35%。本结果显示，接种Sp前3 h，给大鼠腹腔注射IL-6、IL-1各104U合用可显著抑制约氏疟原虫EEF的发育；注入5×103U IL-1，Sp发育率亦明显降低；而104U IL-6没有明显影响，但EEF明显小于对照组，说明该剂量可推迟EEF的成熟。本实验与Vreden的结果有一定差异，原因可能与下列因素有关：①注入细胞因子的时间不同。注入IL-1或IL-6后，血中IL-6的水平大约3 h达到高峰[2]，故注入时间不同对EEF的作用程度可能不同。②我们用的IL-6的剂量比Vreden的小得多。③观察EEF发育数量的指标不同。不同大鼠其体重和肝体积相差较多，单纯计算EEF数/cm2误差较大，Sp转化率能更准确反映实际结果[4]。④重组人IL-6的来源不同，其活性大小可能有差异，即使剂量高达106U也不能完全抑制EEF的发育。
, 百拇医药
在体外，低剂量的IL-1，IL-6即可干扰EEF的发育。本结果表明，接种Sp 2 h后，加入较大浓度的IL-1、IL-6，且每天换液时补加细胞因子，20U IL-1和20U IL-6对EEF发育的抑制率分别为32%～43%和55%～65%，且EEF体积小，核数量少，提示EEF的发育受到抑制。激活的Kc可释放多种活性物质，如BCG刺激Kc可使其释放H2O2的量增加一倍[5]。本结果显示，活化的Kc培养上清对已侵入肝细胞的Sp和EEF的发育都有一定的影响。接种Sp可引起肝内迅速的细胞炎症反应[6]，TNF、超氧阴离子和其它毒性氧自由基及损伤性溶酶体酶等急性反应介质均可对肝细胞损伤起到介导作用。但是，细胞因子和活化Kc产物是否直接杀伤疟原虫或通过损伤肝细胞从而造成疟原虫EEF发育受阻，还有待进一步研究。
国家自然科学基金资助项目，No.39370630
作者简介：郝宏兴，男，30岁，讲师，硕士
, 百拇医药
参考文献
1 黄复生，王兴相，曹晓东，等.约氏疟原虫子孢子入侵Wistar大鼠肝内的扫描电镜观察.寄生虫与医学昆虫学报，1996，3(1)：1
2 Vreden S G S, Van Den Broek F M, Oettinger M C，et al. Cytokines inhibit the development of the malaria parasite Plasmodium berghei in vivo. Eur J Immunol,1992，22(9):2271
3 Seglen P O. Treparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol,1976，13(1):29
4 王兴相，黄复生.环磷酰胺对大鼠体内约氏疟原虫红外期发育的影响.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1987，5(3)：80
5 白咸勇，顾云娣，朱继红，等.生物免疫制剂对大鼠枯否细胞释放过氧化氢的影响.解剖学杂志，1994，17(4)：331
6 黄复生，王兴相，况明书，等.枯否细胞、肝细胞对疟原虫子孢子感染和发育的影响.中国寄生虫病防治杂志，1996，9(3)：173
(收稿：1998-03-05；修回：1998-09-17), http://www.100md.com
单位：第三军医大学基础医学部寄生虫学教研室 重庆，400038
关键词：白细胞介素-1；白细胞介素-6；枯否细胞；约氏疟原虫红外期
第三军医大学学报990210
提要 目的：研究IL-1、IL-6和活化枯否细胞(Kc)产物对约氏疟原虫红外期(EEF)发育的影响。方法：大鼠腹腔注射IL-1、IL-6或合用，3 h后接种子孢子(Sp)，42 h后观察EEF发育情况；建立大鼠肝细胞-约氏疟原虫体外培养模型，Sp接种后2 h加IL-1、IL-6及激活后Kc培养上清，观察对EEF发育的影响。结果：IL-1组、合用组Sp发育率明显降低，IL-6组无明显下降；IL-1、IL-6明显抑制培养的EEF发育；激活Kc培养上清也可抑制EEF发育，EEF成熟度低、体积小。结论：IL-1、IL-6在体内外和接种Sp前后均可抑制EEF的发育。
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中图法分类号 R531.3
Effects of cytokines and supernatant of cultured activated Kuppfer cells on development of exo-erythrocytic forms of Plasmodium yoelii in rats
Hao Hongxing, Huang Fusheng, Kuang Mingshu, Duan Jianhua
(Department of Parasitology, Faculty of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
Abstract Objective: To study the effects of IL-1 and IL-6 and supernatant of cultured activated Kuppfer cells on the development of exo-erythrocytic forms (EEFs) of Plasmodium yoelii (P. yoelii). Methods: Rats were injected intraperitoneally with IL-1, IL-6 or both and inoculated with sporozoites (SP) 3 h later. At the 42nd h after the inoculation, the SP viability and the diameter of EEFs were determined. After the model of in vitro culture of hepatic cell-P. yoelii was established in rats, the animals were inoculated with SP. At the 2nd h after the inoculation, IL-1, IL-6 and the supernatant of cultured activated Kuppfer cells were added to observe their effects on the development of EEFs of P. yoelii. Results: The SP viability of the IL-1 group was decreased to 41.32%. IL-1+IL-6 group presented the complete inhibition of EEF development. In the IL-6 group, the size of EEFs was much smaller than that in the control (P<0.001) though no significant changes of the SP viability were found. In vitro, the percentage of inhibition of the EEF development was 37.8% and 60.6% respectively in the 20 U/ml IL-1 group and 20 U/ml IL-6 group. The development of EEFs was also significantly inhibited in the hepatic cells cultured with the supernatant of the cultured activated Kuppfer cells. Conclusion: IL-1, IL-6 and the supernatant of cultured activated Kuppfer cells can inhibit the EEF development of P. yoelii.
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Key words IL-1; IL-6; Kuppfer cell; Plasmodium yoelii; exo-erythrocytic form; rat
枯否细胞(Kc)可吞噬侵入机体的子孢子(Sp)[1]，并合成TNF-α、IL-1和IL-6等活性物质以抑制疟原虫红外期(EEF)的发育[2]。以往实验均为单纯计算EEF数/cm2，未考虑肝脏体积，误差较大。本研究选用较真实反映EEF发育情况的Sp发育率，探讨IL-1和IL-6及活化后Kc产物对EEF发育的影响。
1 材料和方法
约氏疟原虫BY265株，斯氏按蚊Hor株，本室常规饲养。Wistar大鼠。rhIL-1，rhIL-6(北京邦定公司)。
大鼠肝细胞分离 参照Seglen[3]报道的方法。
, http://www.100md.com
Sp的分离：无菌解剖感染后17 d按蚊唾液腺，洗3次后压碎，加培养基收集Sp并计数(体外培养用)；或将蚊胸部剪下，加5%葡萄糖盐水研磨，500 r/min，离心3 min，共2次，收集上清液并计数Sp数量(体内实验用)。
激活Kc培养上清液制备：每2万Kc加BCG 75 μg和LPS 10 μg，收集18 h培养上清(SKc)，-20℃保存备用。
实验组大鼠腹腔注射0.5 ml PBS，内含细胞因子。第一组：IL-1，5×103U；第二组：IL-6，1×104U；第三组：IL-1，IL-6各1×104 U；第四组：0.5 ml PBS作对照，3 h后经尾静脉接种Sp 30万/只，42 h后活杀动物，常规制片，计数检出EEF数量，计算Sp发育率[4]，测定原虫直径。
24孔板(内放10×10 mm盖片)每孔接种肝细胞2万，培养12 h后接种Sp 2万/孔，2 h后换液并加入含细胞因子的培养基继续培养，每天换液一次，48 h时取出盖片，常规处理，Giemsa染色，计数EEF数目，与对照组比较，计算抑制率，并观察EEF的形态、结构。
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2 结果
2.1 IL-1、IL-6对大鼠体内约氏疟原虫Sp入侵和EEF发育的影响
实验组的Sp发育率分别为1.38%、2.46%和0.01%，对照组是3.34%。可见5×103U IL-1能使Sp发育率降低近2/3(P<0.05)；而1×104U的IL-6无明显影响；合用组仅发现一个原虫，EEF的发育被显著抑制。EEF呈圆形和椭圆形，内含大量细小的裂殖子。IL-1、IL-6组EEF的直径分别是16.38 μm和17.41 μm，均明显小于对照组(21.62 μm，P<0.05)。合用组肝组织中可见大量白细胞浸润灶，提示细胞因子可能影响并损伤EEF发育，诱致肝组织发生急性期反应。
2.2 IL-1、Kc上清和IL-6对培养肝细胞内EEF发育的影响
从表1、2可见，IL-1的浓度越大，EEF发育的抑制率越高，浓度为100 U/ml时，抑制率达88.3%～91.9%。Kc上清组平均检出5～6个原虫，抑制率是47.0%～59.5%。对照组EEF体积较大，核数量多，发育较成熟，见图1。实验组EEF体积小，核数量少，有的可见空泡化等退变表现，见图2。IL-6抑制EEF发育的作用也呈剂量依赖特点，EEF形态与IL-1组类似。100 U/ml组和IL-1，6合用组未见原虫。
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表1 IL-1和Kc上清对培养肝细胞内EEF发育的影响
Tab 1 Effects of IL-1 and the SKc on the development of EEF in vitro IL-1
Ⅰ EEF/cm2
Inhibition
Ⅱ EEF/cm2
Inhibition
(U/ml)
(x±s)
%
(x±s)
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%
20
7.7±0.6
32.3
7.0±2.0
43.2
40
5.0±1.0
55.9
5.3±1.2
56.8
100
1.3±0.6
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88.3
1.0±1.0
91.9
SKc 0.5 ml
6.0±1.0
47.0
5.0±1.7
59.5
Control
11.3±2.3
12.3±2.1
3 wells/group, Ⅰ Ⅱ：Expt series表2 IL-6对培养肝细胞内EEF发育的影响
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Tab 2 Effects of IL-6 on the development of EEF in vitro IL-6
Ⅰ EEF/cm2
Inhibition
Ⅱ EEF/cm2
Inhibition
(U/ml)
(
±s)%
(
±s), 百拇医药
%
20
3.7±0.5
65.6
4.0±1.0
55.6
40
1.3±0.6
87.5
0.7±0.6
93.7
100
0.0±0.0
, 百拇医药
100.0
0.0±0.0
100.0
Control
10.7±3.1
9.0±1.0
3 wells/group, Ⅰ Ⅱ:Expt series
图1 对照组培养的EEF，体积大，核多 (姬姆萨染色×1 000)
Fig 1 Cultured EEF with larger size and more nuclei in control group (Giemsa stain×1 000)
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图2 IL-1组培养的EEF，体积小，核数量少，虫体空泡化 (姬姆萨染色×1 000)
Fig 2 Cultured EEF size smaller with fewer nuclei and vacuoles formation in IL-1 group (Giemsa stain×1 000)
3 讨论
Vreden等[2]报道，Sp接种前106U IL-6或与2.5×103U IL-1合用，几乎完全抑制伯氏疟原虫EEF的发育，接种6、24 h后，IL-6的抑制率降低为62%和35%。本结果显示，接种Sp前3 h，给大鼠腹腔注射IL-6、IL-1各104U合用可显著抑制约氏疟原虫EEF的发育；注入5×103U IL-1，Sp发育率亦明显降低；而104U IL-6没有明显影响，但EEF明显小于对照组，说明该剂量可推迟EEF的成熟。本实验与Vreden的结果有一定差异，原因可能与下列因素有关：①注入细胞因子的时间不同。注入IL-1或IL-6后，血中IL-6的水平大约3 h达到高峰[2]，故注入时间不同对EEF的作用程度可能不同。②我们用的IL-6的剂量比Vreden的小得多。③观察EEF发育数量的指标不同。不同大鼠其体重和肝体积相差较多，单纯计算EEF数/cm2误差较大，Sp转化率能更准确反映实际结果[4]。④重组人IL-6的来源不同，其活性大小可能有差异，即使剂量高达106U也不能完全抑制EEF的发育。
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在体外，低剂量的IL-1，IL-6即可干扰EEF的发育。本结果表明，接种Sp 2 h后，加入较大浓度的IL-1、IL-6，且每天换液时补加细胞因子，20U IL-1和20U IL-6对EEF发育的抑制率分别为32%～43%和55%～65%，且EEF体积小，核数量少，提示EEF的发育受到抑制。激活的Kc可释放多种活性物质，如BCG刺激Kc可使其释放H2O2的量增加一倍[5]。本结果显示，活化的Kc培养上清对已侵入肝细胞的Sp和EEF的发育都有一定的影响。接种Sp可引起肝内迅速的细胞炎症反应[6]，TNF、超氧阴离子和其它毒性氧自由基及损伤性溶酶体酶等急性反应介质均可对肝细胞损伤起到介导作用。但是，细胞因子和活化Kc产物是否直接杀伤疟原虫或通过损伤肝细胞从而造成疟原虫EEF发育受阻，还有待进一步研究。
国家自然科学基金资助项目，No.39370630
作者简介：郝宏兴，男，30岁，讲师，硕士
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参考文献
1 黄复生，王兴相，曹晓东，等.约氏疟原虫子孢子入侵Wistar大鼠肝内的扫描电镜观察.寄生虫与医学昆虫学报，1996，3(1)：1
2 Vreden S G S, Van Den Broek F M, Oettinger M C，et al. Cytokines inhibit the development of the malaria parasite Plasmodium berghei in vivo. Eur J Immunol,1992，22(9):2271
3 Seglen P O. Treparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol,1976，13(1):29
4 王兴相，黄复生.环磷酰胺对大鼠体内约氏疟原虫红外期发育的影响.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1987，5(3)：80
5 白咸勇，顾云娣，朱继红，等.生物免疫制剂对大鼠枯否细胞释放过氧化氢的影响.解剖学杂志，1994，17(4)：331
6 黄复生，王兴相，况明书，等.枯否细胞、肝细胞对疟原虫子孢子感染和发育的影响.中国寄生虫病防治杂志，1996，9(3)：173
(收稿：1998-03-05；修回：1998-09-17), http://www.100md.com