肿瘤DNA含量、p53表达和PCNA表达对预测食管癌预后的意义
作者：钟少文 戎铁华* 林汉良
单位：钟少文 戎铁华(中山医科大学肿瘤医院胸科(广州，510060))；林汉良(中山医科大学病理学教研室；*导师)
关键词：食管肿瘤；DNA含量；p53表达；PCNA表达；预后
癌症/990220
【摘要】目的：探讨Ig样物质是否在多种肿瘤细胞内存在广泛的表达，筛选出Ig样蛋白高表达细胞株。方法：通过免疫组织化学方法(直接法、APAAP法)，分别用抗人IgG多克隆抗体、抗人IgG重链、轻链单抗，对乳腺癌(T47-D、MCF-7)、大肠癌(HT-29、HCT-8)、卵巢癌(SKOV3、Ca)、肺癌(A549)、口腔上皮样癌(A431)、肝癌(BCL-7402)、宫颈癌(S3、MR)等上皮性恶性肿瘤及部分造血系统肿瘤传代细胞(Raji、HL-60、K562)的胞浆内Ig样物质进行了检测。结果：当用抗人IgG多抗进行检测时，所有的上皮性恶性肿瘤细胞同阳性对照(杂交瘤)一样，都呈阳性反应；而在造血系统肿瘤中，除Raji细胞呈弱阳性反应外，K562、HL-60为阴性反应。用抗人IgG轻、重链单抗进行APAAP法检测时，所得结果基本同直接法，但在上皮性恶性肿瘤细胞株中显示了明显的阳性强度差异，如：HeLaMR、CaOV3、MCF-7、T47-D、对抗人IgG重链单抗呈强阳性反应；而HCT-8、A549、A431、BCL-7402、等细胞株为弱阳性，SKOV3则为阴性。抗人IgGκ链阳性率高于λ链。结论：Ig样物质在所检测的上皮性恶性肿瘤传代细胞系中存在广泛的表达。
, 百拇医药
中图号：R73-3；R730-43 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)02-0180-02
Ig-Like protein existed in many epithelial malignant tumor cell lines
QIU Xiao-yan HOU Chun-mei LI Xiou-se, et al
Intitute of bastc medical science. Acaademy of military medical sciences, Beijing 100850， Chian
【Abstract】 Purpose： To elucidate whether the Ig-like protein was extensively existed in many epithelial malignant tumor cell lines and screen the tumor cell lines with Ig-like protein overexpression. Methods：： We used anti-human IgG γ 、κ 、λ chain monoclonal antibody (McAb)、goat anti human IgG-HRP to analyse the Ig-like protein in breast carcinoma cell lines (T47-D、MCF-7)、colon carcinoma cell lines (HT-29、HCT-8)、cervical carcinoma cell line (HeLaS3、HeLaMR)、liver carcinoma (BEL-7402)、lung carcinoma cell line (A549)、(A431)、ovarian carcinoma cell lines (SKOV3、CaOV3) and leukemia cell lines (HL-60、K562、Raji). Results：： when used anti-human IgG-HRP by direct method of immunohistological there were significant positive reaction in all epithelial malignant tumor cytoplasm but weak positive reaction in Raji and negative reactoin in HL-60、K562, when used anti-human IgG H、κ 、λ chain (McAb) by APAAP method to analyse those cell lines, epithelial malignant tumor cells also showed positive reaction, but significant different of positive degree in epithelial malignant tumor cell line. for example, significant positive reaction in HeLaMR、CaOV3、MCF-7、T47-D、and weak positive reaction in HCT-8、A549、A431、BcL-7402. negative reaction in SKOV3 and HL-60、K562, the anti-human Ig κ chain positive rate in epithelial tumor cell lines is higher than anti-human Ig λ . Conclusion：： Ig-like protein extensiely expressed in many epithelial malignant tumor cell lines.
, 百拇医药
Key words： Tumor; Immunohistochemistry; Tumor cell line; Anti-human Ig antibody
我们的前期工作已经发现，在乳腺癌组织等多种上皮性恶性肿瘤细胞内存在着与免疫球蛋白抗原性相同、分子结构极相似的物质，并且，在乳腺癌传代细胞系(T47-D)、大肠癌传代细胞系(HT-29)等部分上皮性恶性肿瘤细胞内发现Ig基因重排结构[1]。为了探讨这种Ig样物质在不同组织来源的肿瘤细胞内的分布差异，寻找稳定、表达高水平Ig样物质的肿瘤传代细胞株，我们对HT-29等14种肿瘤传代细胞系进行了检测。
1 材料和方法
1.1 细胞系
T47-D、HT-29购自北京市肿瘤防治研究所；HCT-8、BCL-7402购自中国医科院药物研究所；MCF-7、A431、A549、SKOV3、CaOV3、HeLaS3、HeLaMR、Raji、K562、HL-60、杂交瘤为本室传代的细胞系。抗体：抗人IgG-HRP的多、单克隆抗体购自日本COSMO公司；抗人IgG轻链(κ、λ)购自北京中山生物技术公司；APAAP显色试剂盒购自北京邦定公司。
, 百拇医药
1.2 实验方法
上述细胞系经含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养，0.01mol/L的PBS洗后，用甩片机制备肿瘤细胞涂片，然后，①用抗人IgG多抗进行免疫组化直接法：羊抗人IgG-HRP→PBS→DAB染色→显微镜观察；对照组以羊抗鼠IgG-HRP代替羊抗人IgG-HRP；②抗人IgG重链、轻链的单抗作为第一抗体，进行碱性磷酸酶标记的免疫组化桥接法染色：抗人IgG重链、轻链的单抗→PBS→羊抗鼠IgG→PBS→鼠APAAP→PBS→坚固红染色(按APAAP显色试剂盒说明书操作)→显微镜观察。
2 结果
当用抗人IgG多抗进行检测时，所有的上皮性恶性肿瘤细胞同阳性对照(杂交瘤)一样，都呈阳性反应(图1)；而在造血系统肿瘤中，除Raji细胞呈弱阳性反应外，K562、HL-60同对照组一样为阴性反应。用抗人IgG轻、重链单抗进行APAAP法检测时，在上皮性恶性肿瘤细胞株中显示了明显的阳性强度差异，如：HeLaMR、MCF-7、T47-D、对抗人IgG重链单抗呈强阳性反应)(图2、3)；而HCT-8、A549、BCL-7402、A431、HeLaS3等细胞株有阳性反应，但阳性细胞只占5%以下；SKOV3则为阴性。而造血细胞基本为阴性反应。抗人IgGκ链阳性率高于λ链。(见附表)
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图1 CaOV3用羊抗人IgG-HRP免疫组化染色结果200×；
图 2HeLaMR用抗人IgG H链单抗免疫组化染色结果200×；
图3 MCF-7用抗人Igκ单抗免疫组化染色结果200×
附表 各种肿瘤细胞系用抗人IgG抗体进行免疫组化染色的结果 细胞系
IgG多抗
IgG H链单抗
Igκ链单抗
Igλ链单抗
T47-D
+
, 百拇医药
+
+
-
MCF-7
+
++
+
+-
HT-29
+
+
+
+-
HCT-8
, 百拇医药
+
+-
+-
+-
CKOV3
+
-
+
-
CaOV3
++
+
+
-
, 百拇医药
HeLaMR
+
+++
++
+-
HeLaS3
+
+-
+-
-
A549
+
+
, 百拇医药 +
+-
A431
+
+-
+-
+
BCL-7402
++
+-
+-
+-
Raji
+-
, 百拇医药
-
+-
+-
HL-60
-
-
-
+-
K562
-
-
-
-
-：无阳性反应；+-：阳性细胞占5%以上；+：阳性细胞占50%以下；++：阳性细胞占50%～80%；+++：阳性细胞占100%
, 百拇医药
3 讨论
在体细胞恶变过程中，可出现一些新的肿瘤相关蛋白和异源蛋白的表达，其中有些蛋白可用于肿瘤的诊断和发病学的研究。然而，在恶性肿瘤细胞内出现与Ig抗原性相同的物质更有其独特的意义，它不但可为恶性肿瘤的发病、诊断及生物治疗的研究提供一条新的思路，而且涉及到目前重要的免疫学理论及方法的问题。因为目前的免疫学理论认为，Ig是B细胞的特有产物，其他的体细胞不应有Ig的产生。如果证明它是Ig将具有重要的理论意义，单从其抗原性和分子结构来看，它的存在，也将对免疫组化等免疫学方法的应用产生一定的影响。比如，这种Ig样物质不但可与抗人IgG抗体，而且与葡萄球菌A蛋白发生特异结合[2]，并且与羊、兔等抗体有交叉反应。这样，如果在某些实验中用葡萄球菌A蛋白或羊抗兔等抗体作为二抗，检测某种肿瘤细胞蛋白，很可能出现假阳性结果。此外，在通常情况下，免疫球蛋白作为B细胞的功能标志而用于体液免疫功能的研究，然而，这种肿瘤细胞内的Ig样物质在分子结构上也与人IgG相似，并且也是一种分泌性蛋白[3]，故用常规的免疫球蛋白检测方法去评价恶性肿瘤患者体液免疫功能，难以得到真实的结果。目前，有关报道认为，恶性肿瘤患者血清中Ig水平增高，体液免疫功能增强[4]，可能就是这个原故。这些Ig样物质的生物学意义及分子结构与Ig的关系更有待于进一步探讨。
, http://www.100md.com
我们选择细胞株均为国际标准化的细胞株，除乳腺癌、大肠癌外，同时选择了肝癌、肺癌、口腔上皮样癌、卵巢癌、宫颈癌共11个上皮性恶性肿瘤细胞系。检测结果表明，上述所有的细胞系对抗人IgG多抗均呈阳性反应。用单克隆抗体检测时，各细胞系间的阳性强度显示了明显的差异，其中宫颈癌(HeLa)的两个亚型的阳性差异就是典型的代表；卵巢癌的两个细胞系虽然对多抗都呈明显的阳性反应，但对抗人IgG重链单抗却呈弱阳性反应，其中SKOV3始终呈阴性反应，而对抗轻链单抗呈阳性反应，说明各个细胞系间的Ig样物质在分子结构上有一定的差异。作为对照组，除杂交瘤外，其它三个细胞系均为阴性反应。值得说明的是，Raji细胞为B细胞瘤的传代细胞系，在基因水平上有Ig基因的重排，但在我们检测的过程中，不论是用多抗还是单抗都未见到明显的阳性反应，可能Raji处于B细胞分化早期阶段有关。
基金项目：由国家教委归国人员基金资助
参考文献
, http://www.100md.com 1 邱晓彦，杨贵贞.上皮性恶性肿瘤细胞的Ig基因分析〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志，1997，4(2)：157.
2 邱晓彦，杨贵贞.上皮性恶性肿瘤细胞内存在Ig样物质〔J〕.白求恩医科大学学报，1996，6：573.
3 邱晓彦，杨贵贞.恶性肿瘤细胞内呈现的Ig样蛋白特性及Ig基因结构分析〔J〕.中国免疫学杂志，1996，5：296.
4 Oiubuyidc IO, salimonu IS, Adeniran SO. Soluble immune complexes and immunogloblin (IgG. IgA AND IgM) levels in Mgerians with primary liver cell carcinoma〔J〕. Afr J Med-Sci, 1993, 22(4):57.
收稿日期：1998-05-18；修回日期：1998-11-03, 百拇医药
单位：钟少文 戎铁华(中山医科大学肿瘤医院胸科(广州，510060))；林汉良(中山医科大学病理学教研室；*导师)
关键词：食管肿瘤；DNA含量；p53表达；PCNA表达；预后
癌症/990220
【摘要】目的：探讨Ig样物质是否在多种肿瘤细胞内存在广泛的表达，筛选出Ig样蛋白高表达细胞株。方法：通过免疫组织化学方法(直接法、APAAP法)，分别用抗人IgG多克隆抗体、抗人IgG重链、轻链单抗，对乳腺癌(T47-D、MCF-7)、大肠癌(HT-29、HCT-8)、卵巢癌(SKOV3、Ca)、肺癌(A549)、口腔上皮样癌(A431)、肝癌(BCL-7402)、宫颈癌(S3、MR)等上皮性恶性肿瘤及部分造血系统肿瘤传代细胞(Raji、HL-60、K562)的胞浆内Ig样物质进行了检测。结果：当用抗人IgG多抗进行检测时，所有的上皮性恶性肿瘤细胞同阳性对照(杂交瘤)一样，都呈阳性反应；而在造血系统肿瘤中，除Raji细胞呈弱阳性反应外，K562、HL-60为阴性反应。用抗人IgG轻、重链单抗进行APAAP法检测时，所得结果基本同直接法，但在上皮性恶性肿瘤细胞株中显示了明显的阳性强度差异，如：HeLaMR、CaOV3、MCF-7、T47-D、对抗人IgG重链单抗呈强阳性反应；而HCT-8、A549、A431、BCL-7402、等细胞株为弱阳性，SKOV3则为阴性。抗人IgGκ链阳性率高于λ链。结论：Ig样物质在所检测的上皮性恶性肿瘤传代细胞系中存在广泛的表达。
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中图号：R73-3；R730-43 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)02-0180-02
Ig-Like protein existed in many epithelial malignant tumor cell lines
QIU Xiao-yan HOU Chun-mei LI Xiou-se, et al
Intitute of bastc medical science. Acaademy of military medical sciences, Beijing 100850， Chian
【Abstract】 Purpose： To elucidate whether the Ig-like protein was extensively existed in many epithelial malignant tumor cell lines and screen the tumor cell lines with Ig-like protein overexpression. Methods：： We used anti-human IgG γ 、κ 、λ chain monoclonal antibody (McAb)、goat anti human IgG-HRP to analyse the Ig-like protein in breast carcinoma cell lines (T47-D、MCF-7)、colon carcinoma cell lines (HT-29、HCT-8)、cervical carcinoma cell line (HeLaS3、HeLaMR)、liver carcinoma (BEL-7402)、lung carcinoma cell line (A549)、(A431)、ovarian carcinoma cell lines (SKOV3、CaOV3) and leukemia cell lines (HL-60、K562、Raji). Results：： when used anti-human IgG-HRP by direct method of immunohistological there were significant positive reaction in all epithelial malignant tumor cytoplasm but weak positive reaction in Raji and negative reactoin in HL-60、K562, when used anti-human IgG H、κ 、λ chain (McAb) by APAAP method to analyse those cell lines, epithelial malignant tumor cells also showed positive reaction, but significant different of positive degree in epithelial malignant tumor cell line. for example, significant positive reaction in HeLaMR、CaOV3、MCF-7、T47-D、and weak positive reaction in HCT-8、A549、A431、BcL-7402. negative reaction in SKOV3 and HL-60、K562, the anti-human Ig κ chain positive rate in epithelial tumor cell lines is higher than anti-human Ig λ . Conclusion：： Ig-like protein extensiely expressed in many epithelial malignant tumor cell lines.
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Key words： Tumor; Immunohistochemistry; Tumor cell line; Anti-human Ig antibody
我们的前期工作已经发现，在乳腺癌组织等多种上皮性恶性肿瘤细胞内存在着与免疫球蛋白抗原性相同、分子结构极相似的物质，并且，在乳腺癌传代细胞系(T47-D)、大肠癌传代细胞系(HT-29)等部分上皮性恶性肿瘤细胞内发现Ig基因重排结构[1]。为了探讨这种Ig样物质在不同组织来源的肿瘤细胞内的分布差异，寻找稳定、表达高水平Ig样物质的肿瘤传代细胞株，我们对HT-29等14种肿瘤传代细胞系进行了检测。
1 材料和方法
1.1 细胞系
T47-D、HT-29购自北京市肿瘤防治研究所；HCT-8、BCL-7402购自中国医科院药物研究所；MCF-7、A431、A549、SKOV3、CaOV3、HeLaS3、HeLaMR、Raji、K562、HL-60、杂交瘤为本室传代的细胞系。抗体：抗人IgG-HRP的多、单克隆抗体购自日本COSMO公司；抗人IgG轻链(κ、λ)购自北京中山生物技术公司；APAAP显色试剂盒购自北京邦定公司。
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1.2 实验方法
上述细胞系经含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养，0.01mol/L的PBS洗后，用甩片机制备肿瘤细胞涂片，然后，①用抗人IgG多抗进行免疫组化直接法：羊抗人IgG-HRP→PBS→DAB染色→显微镜观察；对照组以羊抗鼠IgG-HRP代替羊抗人IgG-HRP；②抗人IgG重链、轻链的单抗作为第一抗体，进行碱性磷酸酶标记的免疫组化桥接法染色：抗人IgG重链、轻链的单抗→PBS→羊抗鼠IgG→PBS→鼠APAAP→PBS→坚固红染色(按APAAP显色试剂盒说明书操作)→显微镜观察。
2 结果
当用抗人IgG多抗进行检测时，所有的上皮性恶性肿瘤细胞同阳性对照(杂交瘤)一样，都呈阳性反应(图1)；而在造血系统肿瘤中，除Raji细胞呈弱阳性反应外，K562、HL-60同对照组一样为阴性反应。用抗人IgG轻、重链单抗进行APAAP法检测时，在上皮性恶性肿瘤细胞株中显示了明显的阳性强度差异，如：HeLaMR、MCF-7、T47-D、对抗人IgG重链单抗呈强阳性反应)(图2、3)；而HCT-8、A549、BCL-7402、A431、HeLaS3等细胞株有阳性反应，但阳性细胞只占5%以下；SKOV3则为阴性。而造血细胞基本为阴性反应。抗人IgGκ链阳性率高于λ链。(见附表)
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图1 CaOV3用羊抗人IgG-HRP免疫组化染色结果200×；
图 2HeLaMR用抗人IgG H链单抗免疫组化染色结果200×；
图3 MCF-7用抗人Igκ单抗免疫组化染色结果200×
附表 各种肿瘤细胞系用抗人IgG抗体进行免疫组化染色的结果 细胞系
IgG多抗
IgG H链单抗
Igκ链单抗
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HL-60
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-：无阳性反应；+-：阳性细胞占5%以上；+：阳性细胞占50%以下；++：阳性细胞占50%～80%；+++：阳性细胞占100%
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3 讨论
在体细胞恶变过程中，可出现一些新的肿瘤相关蛋白和异源蛋白的表达，其中有些蛋白可用于肿瘤的诊断和发病学的研究。然而，在恶性肿瘤细胞内出现与Ig抗原性相同的物质更有其独特的意义，它不但可为恶性肿瘤的发病、诊断及生物治疗的研究提供一条新的思路，而且涉及到目前重要的免疫学理论及方法的问题。因为目前的免疫学理论认为，Ig是B细胞的特有产物，其他的体细胞不应有Ig的产生。如果证明它是Ig将具有重要的理论意义，单从其抗原性和分子结构来看，它的存在，也将对免疫组化等免疫学方法的应用产生一定的影响。比如，这种Ig样物质不但可与抗人IgG抗体，而且与葡萄球菌A蛋白发生特异结合[2]，并且与羊、兔等抗体有交叉反应。这样，如果在某些实验中用葡萄球菌A蛋白或羊抗兔等抗体作为二抗，检测某种肿瘤细胞蛋白，很可能出现假阳性结果。此外，在通常情况下，免疫球蛋白作为B细胞的功能标志而用于体液免疫功能的研究，然而，这种肿瘤细胞内的Ig样物质在分子结构上也与人IgG相似，并且也是一种分泌性蛋白[3]，故用常规的免疫球蛋白检测方法去评价恶性肿瘤患者体液免疫功能，难以得到真实的结果。目前，有关报道认为，恶性肿瘤患者血清中Ig水平增高，体液免疫功能增强[4]，可能就是这个原故。这些Ig样物质的生物学意义及分子结构与Ig的关系更有待于进一步探讨。
, http://www.100md.com
我们选择细胞株均为国际标准化的细胞株，除乳腺癌、大肠癌外，同时选择了肝癌、肺癌、口腔上皮样癌、卵巢癌、宫颈癌共11个上皮性恶性肿瘤细胞系。检测结果表明，上述所有的细胞系对抗人IgG多抗均呈阳性反应。用单克隆抗体检测时，各细胞系间的阳性强度显示了明显的差异，其中宫颈癌(HeLa)的两个亚型的阳性差异就是典型的代表；卵巢癌的两个细胞系虽然对多抗都呈明显的阳性反应，但对抗人IgG重链单抗却呈弱阳性反应，其中SKOV3始终呈阴性反应，而对抗轻链单抗呈阳性反应，说明各个细胞系间的Ig样物质在分子结构上有一定的差异。作为对照组，除杂交瘤外，其它三个细胞系均为阴性反应。值得说明的是，Raji细胞为B细胞瘤的传代细胞系，在基因水平上有Ig基因的重排，但在我们检测的过程中，不论是用多抗还是单抗都未见到明显的阳性反应，可能Raji处于B细胞分化早期阶段有关。
基金项目：由国家教委归国人员基金资助
参考文献
, http://www.100md.com 1 邱晓彦，杨贵贞.上皮性恶性肿瘤细胞的Ig基因分析〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志，1997，4(2)：157.
2 邱晓彦，杨贵贞.上皮性恶性肿瘤细胞内存在Ig样物质〔J〕.白求恩医科大学学报，1996，6：573.
3 邱晓彦，杨贵贞.恶性肿瘤细胞内呈现的Ig样蛋白特性及Ig基因结构分析〔J〕.中国免疫学杂志，1996，5：296.
4 Oiubuyidc IO, salimonu IS, Adeniran SO. Soluble immune complexes and immunogloblin (IgG. IgA AND IgM) levels in Mgerians with primary liver cell carcinoma〔J〕. Afr J Med-Sci, 1993, 22(4):57.
收稿日期：1998-05-18；修回日期：1998-11-03, 百拇医药