反向被动血凝试验检测人胃液潜血的探讨
作者：杨本付 王润田 王涛
单位：杨本付 济宁医学院流行病学教研室(272113)；王润田 王涛 北京医科大学流行病学教研室
关键词：血凝试验；胃液；潜血；胃肿瘤
中国慢性病预防与控制990203 摘要 目的：研究一种检测微量胃液潜血的新方法。方法：建立用反向被动血凝试验(RPHA)检测人胃液潜血的方法，检测正常人和胃癌及其癌前疾病等患者共185份胃液标本。结果：RPHA法检测血红蛋白(Hb)的最低浓度为0.6 μg/ml,最低检出量为15 ng。以胃癌和不典型增生阳性率最高(100%)，其次是萎缩性胃炎(84.62%)。正常空腹胃液(pH1.5)对Hb的抗原性仅有轻度影响。结论：本RPHA法具有特异性强、敏感性高、方法简便、抗体用量少、无需特殊仪器、结果易观察等优点。适于在胃癌及其癌前疾病的人群筛检中推广应用。
The Study of Gastric Juice Occult Blood Test with Reverse Passive Hemagglutination(RPHA)
, http://www.100md.com
Yang Benfu,et al;Department of Epidemiology,Jining Medical College,Jining(272113)
Abstract Objective:To explore a new method to detect occult blood in gastric juice.Method:The RPHA was established in this study to examine occult blood in human gastric juice.185 samples of stomach cancers,precancerous conditions and normals were examined.Results:Minimum detectable hemoglobin(Hb) in hemolysate of the RPHA was 0.6 μg/ml.The patients with sto-mach cancer and dysplasia had the highest positive rate(100%) of RPHA.The next is atrophic gastritis(84.62%).The normal fasting gastric juice(pH1.5) just had a slight effect on the antigenicity of Hb.Conclusion:The RPHA has a high specificity and sensitivity.The method is simple and easy to observe the endpoint.It just needs a few antibody without special instruments.It will be of some application value in the screening of stomach cancer and precancerous conditions.
, 百拇医药
Key words Reverse passive hemagglutination(RPHA) Gastric juice Occult blood Gastric cancer
国内外长期采用化学法(如联苯胺试验、愈创木脂试验等)检测大便或胃液潜血。化学法检测微量胃液潜血的特异性和敏感性皆不够理想，受食物或药物影响较大，以致在不控制食物或药物的情况下采取胃液会引起较高的假阳性或假阴性率〔1〕。近年来用免疫法检测大便潜血的研究报道较多，但免疫法检测胃液潜血的研究尚无报道，我们建立了检测胃液潜血的反向被动血凝试验(RPHA)方法，探讨其特异性、敏感性以及作为胃癌及其癌前疾病筛检试验的可能性。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料 ①人血红蛋白(HbAo)与兔抗人HbAo-IgG抗体按文献〔1〕方法制备及纯化。②RPHA试剂：采用新鲜绵羊红细胞以1%戊二醛醛化，1∶20 000鞣酸液处理，兔抗人HbAo-IgG致敏。以pH7.2的磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS)将致敏血球配成0.75%悬液[含0.25%牛血清白蛋白(BSA)]，保存待用。③样本稀释液：含0.25% BSA的pH7.2 PBS缓冲液。④人及多种动物的溶血液。⑤动物性食物(肉和血)及多种蔬菜的提取液。⑥正常人及不同胃病患者的胃液。
, 百拇医药
1.2 方法 用无创伤性微量胃液采集器〔2〕采集空腹胃液1.5～2 ml，用稀释棒沾取25 μl胃液，置96孔“V”型微量稀释板内，用事先加入孔内的样本稀释液和稀释棒作倍比稀释(稀释板内的稀释倍数第1孔为1∶21，第二孔为1∶22，以此类推)，用特制滴头向每孔加入25 μl 0.75% RPHA试剂，振荡混匀，然后将“V”型板置37℃ 2小时，观察结果。以红细胞沉于孔底呈点状为不凝集，均匀铺散于孔底为凝集。以稀释孔序3(即血凝稀释倍数为1∶23)出现凝集(2+～4+)判断为阳性，同时设阳性及阴性对照。
2 结果与讨论
2.1 RPHA法检测胃液潜血的特异性 以10%鸡、鸭、兔、猪、牛、羊和人的溶血液作RPHA试验，除人溶血液外，均未发生凝集反应。以20%猪肉、猪肝、牛肉、羊肉、鱼肉、鸡肉、鸭肉以及马铃薯、甘薯、包心菜、大白菜、胡萝卜等浸出液作RPHA试验，除猪肝、生牛肉出现弱阳性反应外，均未发生凝集。猪肝、生牛肉一经煮沸，即转为阴性。33份正常人胃液使用本法检测，全部呈阴性反应。该结果同周佩珩〔3〕及Barrows等〔4〕报道的免疫法检测大便潜血结果一致，具有较强的特异性，因而本RPHA法可排除因胃内残留动物性食品引起的潜血假阳性反应。
, 百拇医药
2.2 RPHA法检测胃液潜血的敏感性 用紫外分光光度计准确测量提纯的人HbAo溶液浓度。按E1%1 cm，541 nm=8.63〔3〕计，结果为70.6 mg/ml。取25 μl此溶液用25 ml蒸馏水稀释，取25 μl上述稀释液在“V”型微量稀释板上作倍比稀释，稀释至第7孔尚出现凝集反应，故RPHA法检测Hb的最低浓度为0.6 μg/ml，最低检出量为15 ng。其敏感性与周佩珩等〔3〕报道的一致。而祝文娴等〔5〕报道的敏感性为8.5 ng/ml，可能因其所用鸡血球不同于本试验的绵羊血球所致。免疫法检测胃液或大便潜血的最大优点是特异性强，不受食物和药物的干扰，敏感性随所用的免疫学方法而不同。本试验的敏感性比对流免疫电泳(CIEP)(96 μg/ml)、单向免疫扩散(SRID)(24 μg/ml)和双向琼脂扩散试验(DID)(192 μg/ml)〔6〕分别提高160倍、40倍和320倍，而Kazuo Uchida等〔7〕报道的ELISA的敏感性为15 ng/ml。
, 百拇医药
另取正常人潜血阴性胃液(pH1.5)2 ml，加入25 μl上述HbAo稀释液及10 ml水，混匀，37℃孵育12小时，同法测得类似结果。即本RPHA对正常空腹胃液(pH1.5)中的Hb的最低检出浓度为1.2 μg/ml，说明胃液对Hb抗原性有轻度影响。如果以每天分泌胃液2 000 ml计，则胃失血0.024 ml(相当于2.4 mg Hb)时，即可被本法检出。Burton等〔8〕证实，在pH2.0的环境中，Hb与胃蛋白酶作用10分钟，Hb抗原活性完全消失。空腹时胃蛋白酶的分泌极少，不致于对少量Hb产生大的影响。如果为新鲜(胃内)出血或胃液pH值高于2.0(如萎缩性胃炎时)，则Hb的抗原性改变更小，在这种情况下，RPHA法可检出更微量的胃内出血。
2.3 RPHA法检测胃液潜血的重复性 取3份病理性胃液，每份作10次检测，10次检测结果一致。说明方法重复性很好。1份胃癌患者胃液保存于不同温度(-20℃、0℃、37℃)以不同时间间隔(2、6、12、24小时)作RPHA试验，所得结果一致。血凝稀释倍数皆为1∶25。说明保存温度和时间对检测结果无明显影响。
, 百拇医药
2.4 正常人和胃癌等不同疾病患者185份胃液检测结果 早期胃癌(φ≤1.2 cm)患者3例，不典型增生2例，萎缩性胃炎13例，肠化生50例，胃溃疡16例，胃粘膜糜烂68例，正常人33例，共计185份人的胃液。使用RPHA法检测，结果胃癌及不典型增生均为阳性，萎缩性胃炎阳性率为84.62%(11/13)，肠化生80%(40/50)，胃溃疡62.5%(10/16)，正常人无一例阳性。
本RPHA法敏感性高，无需特殊仪器，操作简便，不需限制饮食，加之无创伤性的微量胃液采集器的应用，使得用RPHA法检测胃液潜血作为一种简便易行的初筛手段，值得在胃癌及其癌前疾病的人群筛检中推广应用。
参考文献
1 汤海洋，等.免疫法检测人粪便隐血的试验研究.Ⅰ.人血红蛋白及羊抗人血红蛋白抗体的提纯与鉴定.浙江医科大学学报，1984，13(5)∶227
, http://www.100md.com
2 王润田，等.胃癌的超微量胃液系列筛查法的研究.北京医科大学学报，1991，23(1)∶9
3 周佩珩，等.反向间接血凝试验检测大便潜血的探讨.中华医学杂志，1987，67(12)∶671
4 Barrows GH,et al.Immunochemical detection of human blood in feces.Am Soc Clin Pathol,1978,69∶342
5 祝文娴，等.检测人粪便潜血的反向间接血凝试验(RPHA)试剂盒的研制与应用.实用肿瘤杂志，1988，3(3)∶146
6 祝文娴，等.免疫法检测人粪便隐血的实验研究.Ⅱ.免疫法的特异性、敏感性和临床标本检测.浙江医科大学学报，1984，13(5)∶231
7 Kazuo Uchida,et al.Immunochemical detection of human blood in feces.Clinica Chimica Acta,1990,189∶267
8 Burton RM,et al.Appearance,properties,and origin of altered human hemoglobin in feces.Lab Invest,1976,35(2)∶111
(收稿：1998-09-03), http://www.100md.com
单位：杨本付 济宁医学院流行病学教研室(272113)；王润田 王涛 北京医科大学流行病学教研室
关键词：血凝试验；胃液；潜血；胃肿瘤
中国慢性病预防与控制990203 摘要 目的：研究一种检测微量胃液潜血的新方法。方法：建立用反向被动血凝试验(RPHA)检测人胃液潜血的方法，检测正常人和胃癌及其癌前疾病等患者共185份胃液标本。结果：RPHA法检测血红蛋白(Hb)的最低浓度为0.6 μg/ml,最低检出量为15 ng。以胃癌和不典型增生阳性率最高(100%)，其次是萎缩性胃炎(84.62%)。正常空腹胃液(pH1.5)对Hb的抗原性仅有轻度影响。结论：本RPHA法具有特异性强、敏感性高、方法简便、抗体用量少、无需特殊仪器、结果易观察等优点。适于在胃癌及其癌前疾病的人群筛检中推广应用。
The Study of Gastric Juice Occult Blood Test with Reverse Passive Hemagglutination(RPHA)
, http://www.100md.com
Yang Benfu,et al;Department of Epidemiology,Jining Medical College,Jining(272113)
Abstract Objective:To explore a new method to detect occult blood in gastric juice.Method:The RPHA was established in this study to examine occult blood in human gastric juice.185 samples of stomach cancers,precancerous conditions and normals were examined.Results:Minimum detectable hemoglobin(Hb) in hemolysate of the RPHA was 0.6 μg/ml.The patients with sto-mach cancer and dysplasia had the highest positive rate(100%) of RPHA.The next is atrophic gastritis(84.62%).The normal fasting gastric juice(pH1.5) just had a slight effect on the antigenicity of Hb.Conclusion:The RPHA has a high specificity and sensitivity.The method is simple and easy to observe the endpoint.It just needs a few antibody without special instruments.It will be of some application value in the screening of stomach cancer and precancerous conditions.
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Key words Reverse passive hemagglutination(RPHA) Gastric juice Occult blood Gastric cancer
国内外长期采用化学法(如联苯胺试验、愈创木脂试验等)检测大便或胃液潜血。化学法检测微量胃液潜血的特异性和敏感性皆不够理想，受食物或药物影响较大，以致在不控制食物或药物的情况下采取胃液会引起较高的假阳性或假阴性率〔1〕。近年来用免疫法检测大便潜血的研究报道较多，但免疫法检测胃液潜血的研究尚无报道，我们建立了检测胃液潜血的反向被动血凝试验(RPHA)方法，探讨其特异性、敏感性以及作为胃癌及其癌前疾病筛检试验的可能性。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料 ①人血红蛋白(HbAo)与兔抗人HbAo-IgG抗体按文献〔1〕方法制备及纯化。②RPHA试剂：采用新鲜绵羊红细胞以1%戊二醛醛化，1∶20 000鞣酸液处理，兔抗人HbAo-IgG致敏。以pH7.2的磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS)将致敏血球配成0.75%悬液[含0.25%牛血清白蛋白(BSA)]，保存待用。③样本稀释液：含0.25% BSA的pH7.2 PBS缓冲液。④人及多种动物的溶血液。⑤动物性食物(肉和血)及多种蔬菜的提取液。⑥正常人及不同胃病患者的胃液。
, 百拇医药
1.2 方法 用无创伤性微量胃液采集器〔2〕采集空腹胃液1.5～2 ml，用稀释棒沾取25 μl胃液，置96孔“V”型微量稀释板内，用事先加入孔内的样本稀释液和稀释棒作倍比稀释(稀释板内的稀释倍数第1孔为1∶21，第二孔为1∶22，以此类推)，用特制滴头向每孔加入25 μl 0.75% RPHA试剂，振荡混匀，然后将“V”型板置37℃ 2小时，观察结果。以红细胞沉于孔底呈点状为不凝集，均匀铺散于孔底为凝集。以稀释孔序3(即血凝稀释倍数为1∶23)出现凝集(2+～4+)判断为阳性，同时设阳性及阴性对照。
2 结果与讨论
2.1 RPHA法检测胃液潜血的特异性 以10%鸡、鸭、兔、猪、牛、羊和人的溶血液作RPHA试验，除人溶血液外，均未发生凝集反应。以20%猪肉、猪肝、牛肉、羊肉、鱼肉、鸡肉、鸭肉以及马铃薯、甘薯、包心菜、大白菜、胡萝卜等浸出液作RPHA试验，除猪肝、生牛肉出现弱阳性反应外，均未发生凝集。猪肝、生牛肉一经煮沸，即转为阴性。33份正常人胃液使用本法检测，全部呈阴性反应。该结果同周佩珩〔3〕及Barrows等〔4〕报道的免疫法检测大便潜血结果一致，具有较强的特异性，因而本RPHA法可排除因胃内残留动物性食品引起的潜血假阳性反应。
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2.2 RPHA法检测胃液潜血的敏感性 用紫外分光光度计准确测量提纯的人HbAo溶液浓度。按E1%1 cm，541 nm=8.63〔3〕计，结果为70.6 mg/ml。取25 μl此溶液用25 ml蒸馏水稀释，取25 μl上述稀释液在“V”型微量稀释板上作倍比稀释，稀释至第7孔尚出现凝集反应，故RPHA法检测Hb的最低浓度为0.6 μg/ml，最低检出量为15 ng。其敏感性与周佩珩等〔3〕报道的一致。而祝文娴等〔5〕报道的敏感性为8.5 ng/ml，可能因其所用鸡血球不同于本试验的绵羊血球所致。免疫法检测胃液或大便潜血的最大优点是特异性强，不受食物和药物的干扰，敏感性随所用的免疫学方法而不同。本试验的敏感性比对流免疫电泳(CIEP)(96 μg/ml)、单向免疫扩散(SRID)(24 μg/ml)和双向琼脂扩散试验(DID)(192 μg/ml)〔6〕分别提高160倍、40倍和320倍，而Kazuo Uchida等〔7〕报道的ELISA的敏感性为15 ng/ml。
, 百拇医药
另取正常人潜血阴性胃液(pH1.5)2 ml，加入25 μl上述HbAo稀释液及10 ml水，混匀，37℃孵育12小时，同法测得类似结果。即本RPHA对正常空腹胃液(pH1.5)中的Hb的最低检出浓度为1.2 μg/ml，说明胃液对Hb抗原性有轻度影响。如果以每天分泌胃液2 000 ml计，则胃失血0.024 ml(相当于2.4 mg Hb)时，即可被本法检出。Burton等〔8〕证实，在pH2.0的环境中，Hb与胃蛋白酶作用10分钟，Hb抗原活性完全消失。空腹时胃蛋白酶的分泌极少，不致于对少量Hb产生大的影响。如果为新鲜(胃内)出血或胃液pH值高于2.0(如萎缩性胃炎时)，则Hb的抗原性改变更小，在这种情况下，RPHA法可检出更微量的胃内出血。
2.3 RPHA法检测胃液潜血的重复性 取3份病理性胃液，每份作10次检测，10次检测结果一致。说明方法重复性很好。1份胃癌患者胃液保存于不同温度(-20℃、0℃、37℃)以不同时间间隔(2、6、12、24小时)作RPHA试验，所得结果一致。血凝稀释倍数皆为1∶25。说明保存温度和时间对检测结果无明显影响。
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2.4 正常人和胃癌等不同疾病患者185份胃液检测结果 早期胃癌(φ≤1.2 cm)患者3例，不典型增生2例，萎缩性胃炎13例，肠化生50例，胃溃疡16例，胃粘膜糜烂68例，正常人33例，共计185份人的胃液。使用RPHA法检测，结果胃癌及不典型增生均为阳性，萎缩性胃炎阳性率为84.62%(11/13)，肠化生80%(40/50)，胃溃疡62.5%(10/16)，正常人无一例阳性。
本RPHA法敏感性高，无需特殊仪器，操作简便，不需限制饮食，加之无创伤性的微量胃液采集器的应用，使得用RPHA法检测胃液潜血作为一种简便易行的初筛手段，值得在胃癌及其癌前疾病的人群筛检中推广应用。
参考文献
1 汤海洋，等.免疫法检测人粪便隐血的试验研究.Ⅰ.人血红蛋白及羊抗人血红蛋白抗体的提纯与鉴定.浙江医科大学学报，1984，13(5)∶227
, http://www.100md.com
2 王润田，等.胃癌的超微量胃液系列筛查法的研究.北京医科大学学报，1991，23(1)∶9
3 周佩珩，等.反向间接血凝试验检测大便潜血的探讨.中华医学杂志，1987，67(12)∶671
4 Barrows GH,et al.Immunochemical detection of human blood in feces.Am Soc Clin Pathol,1978,69∶342
5 祝文娴，等.检测人粪便潜血的反向间接血凝试验(RPHA)试剂盒的研制与应用.实用肿瘤杂志，1988，3(3)∶146
6 祝文娴，等.免疫法检测人粪便隐血的实验研究.Ⅱ.免疫法的特异性、敏感性和临床标本检测.浙江医科大学学报，1984，13(5)∶231
7 Kazuo Uchida,et al.Immunochemical detection of human blood in feces.Clinica Chimica Acta,1990,189∶267
8 Burton RM,et al.Appearance,properties,and origin of altered human hemoglobin in feces.Lab Invest,1976,35(2)∶111
(收稿：1998-09-03), http://www.100md.com