非小细胞肺癌Ki-ras基因第12位密码子突变与吸烟的关系
作者：胡毅玲 吴一龙 云径平 池桂波 王声
单位：胡毅玲 池桂波 王声 暨南大学医学院流行病学教研室， 广东 广州 510632；吴一龙 云径平 中山医科大学附属肿瘤医院，广东 广州 510060
关键词：肺癌；Ki-ras基因；吸烟
疾病控制杂志990207
【摘要】 目的 探讨Ki-ras基因突变在肺癌不同病理型中的分布及与吸烟的关系。方法 采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测40例肺癌病理标本Ki-ras基因第12位密码子点突变。结果 检出6例突变者，突变率为15%。腺癌和鳞癌的突变率分别为17.4%(4/23)和13.3%(2/15)，无显著性差异(χ2=1.43,P>0.05)。有吸烟史的肺癌突变率为6.45%(2/31)，非吸烟肺癌中突变率为44.4%(4/9)。结论 在非小细胞肺癌中未发现Ki-ras基因突变与吸烟有关。
, http://www.100md.com
【中图分类号】 R734.2； R446 【文献标识码】 A 【文章编号】 1008-6013(1999)02-0088-02
Association of mutation in codon 12 of Ki-ras with tobacco smoking in non-small-cell lung cancer
HU Yi-ling, WU Yi-long, YUN Jin-ping, CHI Gui-bo, WANG Sheng-yong.
Department of Epidemiology, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632, China
【Abstract】 Objective To study the relationship between smoking related lung cancer and mutation in codon 12 of Ki-ras in non-small-cell lung cancer. Method Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products (PCR-SSCP) with silver staining was used to detect the mutation in codon 12 of Ki-ras in the paraffin-embedded lung cancer tissue. Results Six of 40 cases (15 percent) were found with mutations in codon 12 of Ki-ras. The frequence of mutation was 17.4 percent for adenocarcinoma and 13.3 percent for squamous cell carcinoma in subtype analysis, respectively (P>0.05). The mutation was more frequent in nonsmokers (44.4%) than in smokers (6.45%). Conclusion The results failed to prove that mutation in codon 12 of Ki-ras mutations is associated with tobacco smoking in non-small-cell lung cancer.
, 百拇医药
【Key words】 lung neoplasm; Ki-ras oncogene; smoking
Ki-ras基因编码的蛋白通过细胞膜的信号传导调节细胞的增殖，Ki-ras基因突变被认为是造成细胞癌变的分子生物学基础之一[1]。Vachtenheim曾报道非小细胞肺癌(NSCLC)中Ki-ras基因突变率在30%左右，主要见于吸烟的肺腺癌患者[2]。Ki-ras基因是否是烟草致癌物作用的靶基因目前尚不清楚。本文采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测了肺癌Ki-ras基因第12位密码子突变，初步探讨Ki-ras基因突变与肺癌病理型以及与吸烟的关系，现报道如下。
1 对象与方法
1.1 标本来源 40例肺癌病人石蜡包埋的病理标本，其中暨南大学医学院附属华侨医院21例，中山医科大学肿瘤医院19例。病人均有详细的流行病学调查资料。每例标本采用自身未转移淋巴组织或癌旁正常组织作阴性对照。40例肺癌(男性32人，女性8人)确诊时间为1990～1992年，年龄在32岁～66岁，平均52.5岁。鳞癌15例(37.5%)，腺癌23例(57.5%)，大细胞肺癌2例(5.0%)。
, http://www.100md.com
1.2 突变检测
1.2.1 PCR扩增 石蜡包埋的病理组织DNA抽提见文献[3]。引物序列按Verlaan-De报道[4]，由中科院上海细胞生物研究所合成。扩增片段为108 bp。25 μl反应体系中含10 mmol。L-1 Tris。HCl(pH 8.3),50 mmol。L-1 KCl, 3.0 mmol。L-1 MgCl2，0.01%明胶，0.1% TritonX-100，4种dNTPs各200 μmol。L-1，引物各0.6 μmol。L-1，模板100～300 pg，TaqDNA聚合酶0.75 U。反应条件：97℃预变性5 min，94℃ 30 sec，55℃ 45 sec，72℃ 60 sec，35个循环后，72℃延伸10 min。
, 百拇医药
1.2.2 SSCP 取5 μl扩增产物，加等体积载样缓冲液混合，95℃变性5 min后立刻置冰浴10 min，取5 μl混合液上样。电泳在Multiphor Ⅱ多用电泳仪上进行。12%聚丙烯酰胺凝胶，1×TBE，13℃，电压400 V，电泳至溴酚兰接近凝胶下缘。
1.2.3 银染 将凝胶在10%乙醇和5%乙酸中固定10 min，0.2%的硝酸银染色15 min，用水洗2～3次，0.75 mol。L-1 NaOH-0.8%甲醛显色10～15 min，固定后观察并拍照。
每例标本均按上述步骤重复两次。
1.3 统计分析 资料采用SAS(6.03版)软件进行Mantel-Haenzel χ2检验。
2 结果
, http://www.100md.com
检测出6例标本(男女各3例)Ki-ras基因第12位密码子扩增DNA带电泳异常(图1)，突变率为15%，鳞癌占13.3%(2/15)，腺癌占17.4%(4/23)，鳞癌和腺癌以及男女之间分布差异均无显著性(P>0.05)。31名吸烟肺癌中有2例(6.5%)呈现Ki-ras基因突变，而在9名非吸烟肺癌却有4例突变者(P<0.05)。
图1 SSCP检测Ki-ras基因第12位密码子点突变
N：癌旁正常组织或未转移的淋巴组织
T：肿瘤组织；箭头所指是突变DNA带；ssDNA：单链带；dsDNA：双链带
3 讨论
Ki-ras基因常见突变部位是第12、13和61位密码子，其中第12位密码子突变率最高。文献报道的突变率颇不一致。Shiono等[5]报道肺腺癌突变率为19%。本研究总的突变率为15%，肺腺癌突变率(17.4%)略高于肺鳞癌(13.3%)。Sugio[6]等报道男性中突变率高于女性，本结果未发现Ki-ras基因突变男女性别差异，可能与样本的构成不同有关。
, http://www.100md.com
有报道[7～9]吸烟的肺腺癌中Ki-ras突变率可达30%，显著高于非吸烟肺腺癌(7%)，推测Ki-ras基因是烟草致癌物作用部位。但是，未发现突变与吸烟的量和吸烟年数存在剂量反应关系。Urban等[10]在暴露于烟草的人肺组织中未检测到Ki-ras第12位密码子的突变，提示吸烟并非是引起突变的直接原因。本研究也有相似结论。大量的流行病学研究[11]表明吸烟主要诱发肺鳞癌，而Ki-ras突变在肺鳞癌中却不常见，这不符合生物学作用效应关系。此外，已有的研究还不能确定Ki-ras基因突变与肿瘤的发生还是发展有关。Ki-ras突变是烟草致癌物作用的结果或只是细胞异常分化过程中的基因变异有待于进一步证实。
本研究采用的银染PCR-SSCP的方法简便易行，适用于分子流行病学研究，是大样本筛选突变基因有效手段。总之，我们的实验结果不支持Ki-ras基因突变主要发生在肺腺癌及与吸烟有关，这仍需要扩大样本量做深入的研究。
, 百拇医药
基金项目：国务院侨办重点科研基金资助项目(93-95-1)
作者简介：胡毅玲，女，42岁，副教授，硕士生导师
参考文献
[1] Boguski MS, McCormick F. Protein regulating ras and its relative. Nature, 1993，366(16):643～654.
[2] Vachtenheim J. Occurrence of ras mutations in human lung cancer minireview. Neoplasma, 1997，44(3):145～149.
[3] 胡毅玲，王声
，池桂波，等. 应用PCR-SSCP方法检测人肺癌Ki-ras基因第12位密码子点突变.暨南大学学报(自然科学与医学版)，1996，17(增刊)：9～13.
, 百拇医药
[4] Verlaan-De VV, Bongaard ME, van den Elst H, et al. A dot-blot screening procedure for mutated ras oncogenes using synthetic oligodeoxyncleotide. Gene, 1986，50(1-3):31～320.
[5] Shiono S, Omoe K, Endo A. Ki-ras gene mutation in sputum samples containing atypical cells and adenocarcinoma cells in the lung. Carcinogenesis, 1996，17(8):1683～1686.
[6] Sugio K, Ishida T, Yokoyama H, et al. Ras gene mutations as a prognostic marker in adenocarcinoma of the human lung without lymph node metastasis. Cancer Res,1992，52(10):2903～2906.
, 百拇医药
[7] Husgafvel-Pursiainen K, Hackman P, Rida-npaa M, et al. Ki-ras mutations in human adenocarcinoma of the lung: Association with smoking and occupational exposure to asbestos. Int J Cancer, 1993，53:250～256.
[8] Mills NE, Fishman CL, Rom WN, et al. Increased prevalence of Ki-ras oncogene mutations in lung adenocarcinoma. Cancer Res, 1995，55(7):1444～1447.
[9] Westra WH, Slebos RJC, Offerhaus GJA, et al. Ki-ras oncogene activation in lung adenocarcinomas from former smokers. Cancer, 1993，72(2):432～438.
[10] Urban T, Ricci S, Lacave R, et al. Codon 12 Ki-ras mutation in non-small-cell lung cancer: comparative evaluation in tumoural and non-tumoural lung. Br J Cancer, 1996，74(7):1051～1055.
[11] Travis WD, Travis LB, Devesa SS. Lung cancer. Cancer, 1995，75(1):191～202.
收稿日期 1998-12-07, 百拇医药
单位：胡毅玲 池桂波 王声 暨南大学医学院流行病学教研室， 广东 广州 510632；吴一龙 云径平 中山医科大学附属肿瘤医院，广东 广州 510060
关键词：肺癌；Ki-ras基因；吸烟
疾病控制杂志990207
【摘要】 目的 探讨Ki-ras基因突变在肺癌不同病理型中的分布及与吸烟的关系。方法 采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测40例肺癌病理标本Ki-ras基因第12位密码子点突变。结果 检出6例突变者，突变率为15%。腺癌和鳞癌的突变率分别为17.4%(4/23)和13.3%(2/15)，无显著性差异(χ2=1.43,P>0.05)。有吸烟史的肺癌突变率为6.45%(2/31)，非吸烟肺癌中突变率为44.4%(4/9)。结论 在非小细胞肺癌中未发现Ki-ras基因突变与吸烟有关。
, http://www.100md.com
【中图分类号】 R734.2； R446 【文献标识码】 A 【文章编号】 1008-6013(1999)02-0088-02
Association of mutation in codon 12 of Ki-ras with tobacco smoking in non-small-cell lung cancer
HU Yi-ling, WU Yi-long, YUN Jin-ping, CHI Gui-bo, WANG Sheng-yong.
Department of Epidemiology, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632, China
【Abstract】 Objective To study the relationship between smoking related lung cancer and mutation in codon 12 of Ki-ras in non-small-cell lung cancer. Method Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products (PCR-SSCP) with silver staining was used to detect the mutation in codon 12 of Ki-ras in the paraffin-embedded lung cancer tissue. Results Six of 40 cases (15 percent) were found with mutations in codon 12 of Ki-ras. The frequence of mutation was 17.4 percent for adenocarcinoma and 13.3 percent for squamous cell carcinoma in subtype analysis, respectively (P>0.05). The mutation was more frequent in nonsmokers (44.4%) than in smokers (6.45%). Conclusion The results failed to prove that mutation in codon 12 of Ki-ras mutations is associated with tobacco smoking in non-small-cell lung cancer.
, 百拇医药
【Key words】 lung neoplasm; Ki-ras oncogene; smoking
Ki-ras基因编码的蛋白通过细胞膜的信号传导调节细胞的增殖，Ki-ras基因突变被认为是造成细胞癌变的分子生物学基础之一[1]。Vachtenheim曾报道非小细胞肺癌(NSCLC)中Ki-ras基因突变率在30%左右，主要见于吸烟的肺腺癌患者[2]。Ki-ras基因是否是烟草致癌物作用的靶基因目前尚不清楚。本文采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测了肺癌Ki-ras基因第12位密码子突变，初步探讨Ki-ras基因突变与肺癌病理型以及与吸烟的关系，现报道如下。
1 对象与方法
1.1 标本来源 40例肺癌病人石蜡包埋的病理标本，其中暨南大学医学院附属华侨医院21例，中山医科大学肿瘤医院19例。病人均有详细的流行病学调查资料。每例标本采用自身未转移淋巴组织或癌旁正常组织作阴性对照。40例肺癌(男性32人，女性8人)确诊时间为1990～1992年，年龄在32岁～66岁，平均52.5岁。鳞癌15例(37.5%)，腺癌23例(57.5%)，大细胞肺癌2例(5.0%)。
, http://www.100md.com
1.2 突变检测
1.2.1 PCR扩增 石蜡包埋的病理组织DNA抽提见文献[3]。引物序列按Verlaan-De报道[4]，由中科院上海细胞生物研究所合成。扩增片段为108 bp。25 μl反应体系中含10 mmol。L-1 Tris。HCl(pH 8.3),50 mmol。L-1 KCl, 3.0 mmol。L-1 MgCl2，0.01%明胶，0.1% TritonX-100，4种dNTPs各200 μmol。L-1，引物各0.6 μmol。L-1，模板100～300 pg，TaqDNA聚合酶0.75 U。反应条件：97℃预变性5 min，94℃ 30 sec，55℃ 45 sec，72℃ 60 sec，35个循环后，72℃延伸10 min。
, 百拇医药
1.2.2 SSCP 取5 μl扩增产物，加等体积载样缓冲液混合，95℃变性5 min后立刻置冰浴10 min，取5 μl混合液上样。电泳在Multiphor Ⅱ多用电泳仪上进行。12%聚丙烯酰胺凝胶，1×TBE，13℃，电压400 V，电泳至溴酚兰接近凝胶下缘。
1.2.3 银染 将凝胶在10%乙醇和5%乙酸中固定10 min，0.2%的硝酸银染色15 min，用水洗2～3次，0.75 mol。L-1 NaOH-0.8%甲醛显色10～15 min，固定后观察并拍照。
每例标本均按上述步骤重复两次。
1.3 统计分析 资料采用SAS(6.03版)软件进行Mantel-Haenzel χ2检验。
2 结果
, http://www.100md.com
检测出6例标本(男女各3例)Ki-ras基因第12位密码子扩增DNA带电泳异常(图1)，突变率为15%，鳞癌占13.3%(2/15)，腺癌占17.4%(4/23)，鳞癌和腺癌以及男女之间分布差异均无显著性(P>0.05)。31名吸烟肺癌中有2例(6.5%)呈现Ki-ras基因突变，而在9名非吸烟肺癌却有4例突变者(P<0.05)。
图1 SSCP检测Ki-ras基因第12位密码子点突变
N：癌旁正常组织或未转移的淋巴组织
T：肿瘤组织；箭头所指是突变DNA带；ssDNA：单链带；dsDNA：双链带
3 讨论
Ki-ras基因常见突变部位是第12、13和61位密码子，其中第12位密码子突变率最高。文献报道的突变率颇不一致。Shiono等[5]报道肺腺癌突变率为19%。本研究总的突变率为15%，肺腺癌突变率(17.4%)略高于肺鳞癌(13.3%)。Sugio[6]等报道男性中突变率高于女性，本结果未发现Ki-ras基因突变男女性别差异，可能与样本的构成不同有关。
, http://www.100md.com
有报道[7～9]吸烟的肺腺癌中Ki-ras突变率可达30%，显著高于非吸烟肺腺癌(7%)，推测Ki-ras基因是烟草致癌物作用部位。但是，未发现突变与吸烟的量和吸烟年数存在剂量反应关系。Urban等[10]在暴露于烟草的人肺组织中未检测到Ki-ras第12位密码子的突变，提示吸烟并非是引起突变的直接原因。本研究也有相似结论。大量的流行病学研究[11]表明吸烟主要诱发肺鳞癌，而Ki-ras突变在肺鳞癌中却不常见，这不符合生物学作用效应关系。此外，已有的研究还不能确定Ki-ras基因突变与肿瘤的发生还是发展有关。Ki-ras突变是烟草致癌物作用的结果或只是细胞异常分化过程中的基因变异有待于进一步证实。
本研究采用的银染PCR-SSCP的方法简便易行，适用于分子流行病学研究，是大样本筛选突变基因有效手段。总之，我们的实验结果不支持Ki-ras基因突变主要发生在肺腺癌及与吸烟有关，这仍需要扩大样本量做深入的研究。
, 百拇医药
基金项目：国务院侨办重点科研基金资助项目(93-95-1)
作者简介：胡毅玲，女，42岁，副教授，硕士生导师
参考文献
[1] Boguski MS, McCormick F. Protein regulating ras and its relative. Nature, 1993，366(16):643～654.
[2] Vachtenheim J. Occurrence of ras mutations in human lung cancer minireview. Neoplasma, 1997，44(3):145～149.
[3] 胡毅玲，王声
，池桂波，等. 应用PCR-SSCP方法检测人肺癌Ki-ras基因第12位密码子点突变.暨南大学学报(自然科学与医学版)，1996，17(增刊)：9～13., 百拇医药
[4] Verlaan-De VV, Bongaard ME, van den Elst H, et al. A dot-blot screening procedure for mutated ras oncogenes using synthetic oligodeoxyncleotide. Gene, 1986，50(1-3):31～320.
[5] Shiono S, Omoe K, Endo A. Ki-ras gene mutation in sputum samples containing atypical cells and adenocarcinoma cells in the lung. Carcinogenesis, 1996，17(8):1683～1686.
[6] Sugio K, Ishida T, Yokoyama H, et al. Ras gene mutations as a prognostic marker in adenocarcinoma of the human lung without lymph node metastasis. Cancer Res,1992，52(10):2903～2906.
, 百拇医药
[7] Husgafvel-Pursiainen K, Hackman P, Rida-npaa M, et al. Ki-ras mutations in human adenocarcinoma of the lung: Association with smoking and occupational exposure to asbestos. Int J Cancer, 1993，53:250～256.
[8] Mills NE, Fishman CL, Rom WN, et al. Increased prevalence of Ki-ras oncogene mutations in lung adenocarcinoma. Cancer Res, 1995，55(7):1444～1447.
[9] Westra WH, Slebos RJC, Offerhaus GJA, et al. Ki-ras oncogene activation in lung adenocarcinomas from former smokers. Cancer, 1993，72(2):432～438.
[10] Urban T, Ricci S, Lacave R, et al. Codon 12 Ki-ras mutation in non-small-cell lung cancer: comparative evaluation in tumoural and non-tumoural lung. Br J Cancer, 1996，74(7):1051～1055.
[11] Travis WD, Travis LB, Devesa SS. Lung cancer. Cancer, 1995，75(1):191～202.
收稿日期 1998-12-07, 百拇医药