小鼠外周血网织红细胞微核吖啶橙染色法的研究
作者：李尊爱 杨树媛 王静 张静 方金福
单位：天津市劳动卫生职业病研究所 (300204)
关键词：
卫生毒理学杂志990224 微核试验是遗传毒理学中一个重要的监测指标，但现采用的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核Giemsa染色法，染色特异性差、伪核难辨，不能进行连续动态的观察。近年来日本的Hayashi[1]报道了一种小鼠外周血网织红细胞微核吖啶橙染色新方法。该方法染色特异性强，对评价化学物质的诱变性有较大的实用价值。为此，我们在建立该方法的基础上，对染色步骤进行了改进，使之更加简便和完善。以6种染色体诱变剂探讨了不同年龄，不同性别小鼠外周血网织红细胞微核的变化，微核出现高峰的时间。为该方法的推广应用提供依据。
材料与方法
一.材料
, 百拇医药
1.染料：吖啶橙(Acridine Orange，AO)由德国进口，上海试剂站分装。用蒸馏水配成1mg/ml的染液(pH 6.2)冰箱保存。
2. 6种染色体诱变剂：丝裂霉素C(MMC)日本，环磷酰胺(CYP)上海，秋水仙素(COl)美国，甲基苄肼(PCZ)瑞典，苯(BEN)丹东，溴酸钾(KBrO3)天津。
3.荧光显微镜：日本Olympus，激发滤光片波长488nm。障碍滤光片波长515nm。
二.方法
1.实验动物分组与染毒：由天津市医学实验动物中心提供昆明种小鼠，每种染色体诱变剂设2个周龄组(4～6周和10～17周)，每周龄组10只，雌雄各半。一次染毒，甲基苄肼和苯混悬于玉米油内经口灌胃。其余4种均由生理盐水溶解后腹腔注射染毒。
, 百拇医药
2.小鼠外周血网织红细胞微核测定：引用本实验室建立的方法，在干净的玻片上先滴加AO染液10μl，自小鼠尾部取血5μl直接滴在染液内，混均后盖片，室温(18℃左右)静置2～3小时即可计数。观察染毒后0，24，48，72小时外周血1000个Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型网织红细胞微核的发生率。
结 果
一.吖啶橙染色形态学的观察
小鼠外周血网织红细胞经吖啶橙染色后，细胞形态是完整的，网织结构在细胞中占的比例不同染出桔红色荧光。微核为圆形，大小不一，常见一个也可见两个，发出很强的黄绿色荧光，易于分辨。
二.微核出现高峰的时间
用6种染色体诱变剂对4～6周龄雄性小鼠进行染毒(MMC 1.5mg/kg，CYP 75mg/kg，COl 2.0mg/kg,PCZ 200mg/kg，BEN 200mg/kg，KBrO3 100mg/kg)。于染毒后不同时间连续取血测定微核的发生率，结果见附图。
, http://www.100md.com
附图 6种染色体诱变剂微核出现的高峰时间
+—MMC ×—CYP ○—COl
—PCZ □—BEN 
—KBrO3
由图可看出，6种染色体诱变剂微核检出率均出现很好的时间-反应关系，微核出现高峰时间是染毒后48小时。
三.小鼠鼠龄对微核检出率的影响
6种诱变剂染毒4～6周和10～17周龄雄性小鼠，48小时取血其微核测定结果见表1。
, 百拇医药
表1 不同鼠龄小鼠外周血网织红细胞微核率(‰)
诱变剂
剂量
(mg/kg)
4～6周
(
±s)
10～17周
(±s)
, 百拇医药
MMC
1.5
24.8±3.2
22.0±2.9
CYP
75
21.0±4.2**
12.4±4.4
COl
2.0
12.0±4.2
9.2±2.3
, http://www.100md.com
PCZ
200
11.6±2.2
9.4±2.3
BEN
200
20.6±2.0**
11.2±3.9
KBrO3
100
11.2±3.0*
6.8±1.5
, http://www.100md.com
两种鼠龄微核率比较 *P<0.05**P<0.01
由表1可看出，6种诱变剂对4～6周龄小鼠外周血网织红细胞微核有较强的诱导作用，微核率均高于10～17周龄小鼠。经统计学处理后CYP和BEN差异有显著性(P<0.01)，KBrO3差异有显著性(P<0.05)。
四.小鼠性别对微核检出率的影响
6种诱变剂对4～6周龄雄性，雌性小鼠进行染毒，检测48小时外周血网织红细胞微核率。结果见表2。
表2 4～6周龄小鼠外周血微核率(‰)的变化(±s)
, http://www.100md.com 诱变剂
剂量(mg/kg)
雄性鼠
雌性鼠
MMC
1.5
24.8±3.2
23.0±2.0
CYP
75
21.0±4.2
19.5±3.8
COl
, http://www.100md.com
2.0
12.0±4.2
10.7±3.0
PCZ
200
11.6±2.2
9.8±2.5
BEN
200
20.6±2.0*
12.8±2.3
KBrO3
, 百拇医药
100
11.2±3.0
10.4±2.2
雄性和雌性比较 *P<0.05
由表2可看出，6种诱变剂染毒4～6周龄小鼠48小时微核检出率表现出雄性高于雌性的趋势，经统计学处理只有苯对雄性小鼠微核诱导作用明显高于雌性(P<0.05)。
讨 论
一.外周血网织红细胞可以作为微核靶细胞
Macgregor等[2]首先在外周血涂片中发现了微核，并证明小鼠外周血和骨髓嗜多染红细胞微核率出现了类似的剂量-效应关系。Styles[3]和Stelnbeheleer[4]用不同种系的小鼠进行了微核研究。结果表明外周血和骨髓嗜多染红细胞微核均有显著增加，两者的敏感性相同。许发茂[5]还发现，外周血和骨髓微核有显著相关。外周血微核试验，尽管简单、方便，但因在常规的染色法(Giemsa)中幼稚红细胞和成熟红细胞区分效果不明显，给微核试验评价带来困难。
, 百拇医药
近年来Hayashi[1]报道了一种小鼠外周血网织红细胞微核吖啶橙活体细胞染色法，该染色方法很容易区分幼稚和成熟红细胞，特异性染色强，计数微核快而准确。日本环境致突剂协会微核联合研究组[6]用已知23种染色体诱变剂，在46个实验室内进行了外周血网织红细胞微核试验。其结论是该方法对评价化学物质的致突变性很实用，与骨髓嗜多染红细胞微核试验同样敏感。
二.外周血网织红细胞微核吖啶橙染色法的建立
吖啶橙是一种荧光色素，它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光即着色特异性强。本次研究在建立Hayashi方法的试验中发现将血液滴在含有吖啶橙染液的染料膜上，血液的粘稠度不同，限制了其在吖啶橙染液涂片上的扩散，荧光的强度也由细胞分布薄厚不一而不一致。因此我们改进了染色方法将血液和染液直接混合在一起进行染色，简化了实验步骤，提高了染色效果，增加了观察的有效面积，使微核的计数更加随机化和标准化。
, http://www.100md.com
三.小鼠外周血网织红细胞微核吖啶橙染色法的测定
用6种染色体诱变剂染毒小鼠后，外周血网织红细胞微核率呈现出很好的时间-反应关系，微核出现高峰是在染毒后48小时，比骨髓晚24小时，这延迟的24小时被认为[7]是由骨髓释放入血的时间。本次实验检测的外周血网织红细胞微核率比日本Hara等[8～13]对这6种诱变剂诱导微核率偏高，故认为可能与本实验所用动物年龄有关。
6种染色体诱变剂对4～6周龄雄性小鼠微核效应诱导作用较强，于染毒后48小时微核率均高于10～17周雄性小鼠。(CYP、BEN、KBrO3)有明显的统计学意义。这一结果是否与年轻小鼠造血机能旺盛，外周血网织红细胞多增加了出现微核的机率有关。Schlegel[2]也发现，刚离乳的小鼠比年龄大的更适合作微核研究，因外周血中有较多的嗜多染红细胞。提高了染色体诱变剂的阳性检出率。
, 百拇医药
6种诱变剂的检测结果还表明，4～6周龄雄性小鼠对诱变剂的敏感性高于同年龄组雌鼠。
本次研究在建立了Hayashi方法的基础上对染色步骤进行了改进，为微核图像自动化分析奠定了良好的基础。
方金福为指导老师。
本课题由天津市卫生局科技基金资助
参考文献
1.Hayashi M.Mut.Res,1990,245:245.
2.MacGregor JT,et al. Environ Mutagen,1980,2:509.
3.Styles J A,et al. Mut.Res,1983,113:481.
, 百拇医药
4.Stelnhelder G,et al. Cell.Biol.Toxicol,1985,1:197.
5.许发茂，等.遗传与疾病，1986,3:107.
6.The summary report of the collaborative study by CSGMT/JEMS,MMS,Mut.Res,1992,278:83.
7.MacGregor JT.Fund.Appl.Toxicol,1991,14:513.
8.Hara M,et al.Mut.Res,1992,278:175.
9.Hatanaka Y,et al.Mut.Res,1992,278:99.
10.Awogl T,et al.Mut.Res,1992,278:181.
11.Konclo Y,et al.Mut,Res,1992,278:187.
12.Hata Keyama Y,et al.Mut.Res,1992,278:193.
13.Romagma F,et al.Mut,Res,1992,278:197.
(修回日期 1998年11月), 百拇医药
单位：天津市劳动卫生职业病研究所 (300204)
关键词：
卫生毒理学杂志990224 微核试验是遗传毒理学中一个重要的监测指标，但现采用的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核Giemsa染色法，染色特异性差、伪核难辨，不能进行连续动态的观察。近年来日本的Hayashi[1]报道了一种小鼠外周血网织红细胞微核吖啶橙染色新方法。该方法染色特异性强，对评价化学物质的诱变性有较大的实用价值。为此，我们在建立该方法的基础上，对染色步骤进行了改进，使之更加简便和完善。以6种染色体诱变剂探讨了不同年龄，不同性别小鼠外周血网织红细胞微核的变化，微核出现高峰的时间。为该方法的推广应用提供依据。
材料与方法
一.材料
, 百拇医药
1.染料：吖啶橙(Acridine Orange，AO)由德国进口，上海试剂站分装。用蒸馏水配成1mg/ml的染液(pH 6.2)冰箱保存。
2. 6种染色体诱变剂：丝裂霉素C(MMC)日本，环磷酰胺(CYP)上海，秋水仙素(COl)美国，甲基苄肼(PCZ)瑞典，苯(BEN)丹东，溴酸钾(KBrO3)天津。
3.荧光显微镜：日本Olympus，激发滤光片波长488nm。障碍滤光片波长515nm。
二.方法
1.实验动物分组与染毒：由天津市医学实验动物中心提供昆明种小鼠，每种染色体诱变剂设2个周龄组(4～6周和10～17周)，每周龄组10只，雌雄各半。一次染毒，甲基苄肼和苯混悬于玉米油内经口灌胃。其余4种均由生理盐水溶解后腹腔注射染毒。
, 百拇医药
2.小鼠外周血网织红细胞微核测定：引用本实验室建立的方法，在干净的玻片上先滴加AO染液10μl，自小鼠尾部取血5μl直接滴在染液内，混均后盖片，室温(18℃左右)静置2～3小时即可计数。观察染毒后0，24，48，72小时外周血1000个Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型网织红细胞微核的发生率。
结 果
一.吖啶橙染色形态学的观察
小鼠外周血网织红细胞经吖啶橙染色后，细胞形态是完整的，网织结构在细胞中占的比例不同染出桔红色荧光。微核为圆形，大小不一，常见一个也可见两个，发出很强的黄绿色荧光，易于分辨。
二.微核出现高峰的时间
用6种染色体诱变剂对4～6周龄雄性小鼠进行染毒(MMC 1.5mg/kg，CYP 75mg/kg，COl 2.0mg/kg,PCZ 200mg/kg，BEN 200mg/kg，KBrO3 100mg/kg)。于染毒后不同时间连续取血测定微核的发生率，结果见附图。
, http://www.100md.com
附图 6种染色体诱变剂微核出现的高峰时间
+—MMC ×—CYP ○—COl
—PCZ □—BEN —KBrO3由图可看出，6种染色体诱变剂微核检出率均出现很好的时间-反应关系，微核出现高峰时间是染毒后48小时。
三.小鼠鼠龄对微核检出率的影响
6种诱变剂染毒4～6周和10～17周龄雄性小鼠，48小时取血其微核测定结果见表1。
, 百拇医药
表1 不同鼠龄小鼠外周血网织红细胞微核率(‰)
诱变剂
剂量
(mg/kg)
4～6周
(
±s)10～17周
(
±s), 百拇医药
MMC
1.5
24.8±3.2
22.0±2.9
CYP
75
21.0±4.2**
12.4±4.4
COl
2.0
12.0±4.2
9.2±2.3
, http://www.100md.com
PCZ
200
11.6±2.2
9.4±2.3
BEN
200
20.6±2.0**
11.2±3.9
KBrO3
100
11.2±3.0*
6.8±1.5
, http://www.100md.com
两种鼠龄微核率比较 *P<0.05**P<0.01
由表1可看出，6种诱变剂对4～6周龄小鼠外周血网织红细胞微核有较强的诱导作用，微核率均高于10～17周龄小鼠。经统计学处理后CYP和BEN差异有显著性(P<0.01)，KBrO3差异有显著性(P<0.05)。
四.小鼠性别对微核检出率的影响
6种诱变剂对4～6周龄雄性，雌性小鼠进行染毒，检测48小时外周血网织红细胞微核率。结果见表2。
表2 4～6周龄小鼠外周血微核率(‰)的变化(
±s), http://www.100md.com 诱变剂
剂量(mg/kg)
雄性鼠
雌性鼠
MMC
1.5
24.8±3.2
23.0±2.0
CYP
75
21.0±4.2
19.5±3.8
COl
, http://www.100md.com
2.0
12.0±4.2
10.7±3.0
PCZ
200
11.6±2.2
9.8±2.5
BEN
200
20.6±2.0*
12.8±2.3
KBrO3
, 百拇医药
100
11.2±3.0
10.4±2.2
雄性和雌性比较 *P<0.05
由表2可看出，6种诱变剂染毒4～6周龄小鼠48小时微核检出率表现出雄性高于雌性的趋势，经统计学处理只有苯对雄性小鼠微核诱导作用明显高于雌性(P<0.05)。
讨 论
一.外周血网织红细胞可以作为微核靶细胞
Macgregor等[2]首先在外周血涂片中发现了微核，并证明小鼠外周血和骨髓嗜多染红细胞微核率出现了类似的剂量-效应关系。Styles[3]和Stelnbeheleer[4]用不同种系的小鼠进行了微核研究。结果表明外周血和骨髓嗜多染红细胞微核均有显著增加，两者的敏感性相同。许发茂[5]还发现，外周血和骨髓微核有显著相关。外周血微核试验，尽管简单、方便，但因在常规的染色法(Giemsa)中幼稚红细胞和成熟红细胞区分效果不明显，给微核试验评价带来困难。
, 百拇医药
近年来Hayashi[1]报道了一种小鼠外周血网织红细胞微核吖啶橙活体细胞染色法，该染色方法很容易区分幼稚和成熟红细胞，特异性染色强，计数微核快而准确。日本环境致突剂协会微核联合研究组[6]用已知23种染色体诱变剂，在46个实验室内进行了外周血网织红细胞微核试验。其结论是该方法对评价化学物质的致突变性很实用，与骨髓嗜多染红细胞微核试验同样敏感。
二.外周血网织红细胞微核吖啶橙染色法的建立
吖啶橙是一种荧光色素，它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光即着色特异性强。本次研究在建立Hayashi方法的试验中发现将血液滴在含有吖啶橙染液的染料膜上，血液的粘稠度不同，限制了其在吖啶橙染液涂片上的扩散，荧光的强度也由细胞分布薄厚不一而不一致。因此我们改进了染色方法将血液和染液直接混合在一起进行染色，简化了实验步骤，提高了染色效果，增加了观察的有效面积，使微核的计数更加随机化和标准化。
, http://www.100md.com
三.小鼠外周血网织红细胞微核吖啶橙染色法的测定
用6种染色体诱变剂染毒小鼠后，外周血网织红细胞微核率呈现出很好的时间-反应关系，微核出现高峰是在染毒后48小时，比骨髓晚24小时，这延迟的24小时被认为[7]是由骨髓释放入血的时间。本次实验检测的外周血网织红细胞微核率比日本Hara等[8～13]对这6种诱变剂诱导微核率偏高，故认为可能与本实验所用动物年龄有关。
6种染色体诱变剂对4～6周龄雄性小鼠微核效应诱导作用较强，于染毒后48小时微核率均高于10～17周雄性小鼠。(CYP、BEN、KBrO3)有明显的统计学意义。这一结果是否与年轻小鼠造血机能旺盛，外周血网织红细胞多增加了出现微核的机率有关。Schlegel[2]也发现，刚离乳的小鼠比年龄大的更适合作微核研究，因外周血中有较多的嗜多染红细胞。提高了染色体诱变剂的阳性检出率。
, 百拇医药
6种诱变剂的检测结果还表明，4～6周龄雄性小鼠对诱变剂的敏感性高于同年龄组雌鼠。
本次研究在建立了Hayashi方法的基础上对染色步骤进行了改进，为微核图像自动化分析奠定了良好的基础。
方金福为指导老师。
本课题由天津市卫生局科技基金资助
参考文献
1.Hayashi M.Mut.Res,1990,245:245.
2.MacGregor JT,et al. Environ Mutagen,1980,2:509.
3.Styles J A,et al. Mut.Res,1983,113:481.
, 百拇医药
4.Stelnhelder G,et al. Cell.Biol.Toxicol,1985,1:197.
5.许发茂，等.遗传与疾病，1986,3:107.
6.The summary report of the collaborative study by CSGMT/JEMS,MMS,Mut.Res,1992,278:83.
7.MacGregor JT.Fund.Appl.Toxicol,1991,14:513.
8.Hara M,et al.Mut.Res,1992,278:175.
9.Hatanaka Y,et al.Mut.Res,1992,278:99.
10.Awogl T,et al.Mut.Res,1992,278:181.
11.Konclo Y,et al.Mut,Res,1992,278:187.
12.Hata Keyama Y,et al.Mut.Res,1992,278:193.
13.Romagma F,et al.Mut,Res,1992,278:197.
(修回日期 1998年11月), 百拇医药