两种镍化合物在体外对免疫细胞功能作用的研究
作者：苏英 庞新民 王宗惠
单位：北京市劳动卫生职业病防治研究所 (100020)
关键词：
卫生毒理学杂志990220 多年来，关于镍作业人员癌症流行病学调查及实验致癌研究结果证实，镍及某些化合物可诱发多种癌症[1～3]。这一结果早已被人们所重视，并且通过进一步对镍的诱癌机理的研究，多数认为镍可使细胞核DNA损伤，从而引起细胞突变。关于镍对机体免疫功能的影响，Smialowicz[4]通过实验研究表明，镍可使小鼠的天然杀伤(NK)细胞功能降低。我们从机体免疫系统特有的抗肿瘤功能角度，观察了两种镍化合物对体外培养的免疫细胞功能的影响，以探讨镍化合物的免疫毒性，并为镍致癌机理的研究提供必要的依据。
材料与方法
, http://www.100md.com 一、材料
黑色氧化镍(Ni2O3)和醋酸镍(NiAc)，化学纯，北京化工总厂产品。刀豆蛋白A(ConA)Sigma公司产品。L929细胞(小鼠纤维母细胞)，购于医科院肿瘤研究所。
二、方法：
1.用MTT法[5]测定Ni2O3和NiAc对体外淋巴细胞增殖功能的作用：常规无菌操作制备小鼠脾细胞悬液，用0.89%NH4Cl去除红细胞，将细胞悬液浓度调整为107/ml备用。取96孔培养板，每孔加100μl细胞悬液，50μl ConA(20μg/ml)或培液，50μl不同浓度的Ni2O3或NiAc,37℃ 5%CO2孵箱72小时，结束培养前4小时，每孔加30μl(1mg/ml)的MTT，4小时后，去掉上清，用二甲基亚砜溶解细胞后，酶标仪测定550/620nm A值。
, 百拇医药
2.Ni2O3对体外诱导TNF(肿瘤坏死因子)的作用：(1)TNF的体外诱导方法[6]：取小鼠腹腔巨噬细胞，调成106/ml，取24孔培养板，每孔加入0.5ml，再加入0.5ml不同浓度的Ni2O3，每孔含LPS(100ng/ml)，培养板置37℃ 5% CO2孵箱培养，24小时后收集上清，测定TNF活性。(2)TNF活性测定[7]：取L929细胞为靶细胞，接种96孔培养板5×104细胞/孔，再分别加入不同浓度Ni2O3诱导的TNF上清，在丝裂霉素存在条件下37℃，5% CO2培养18小时，经过结晶紫染色后于550/620nm下测定A值。TNF活性高对L929细胞杀伤能力强，结晶紫淡染，A值则降低，相反，TNF活性低A值则高。也可通过计算细胞毒性百分率表示活性强弱。
, http://www.100md.com
细胞毒性百分率=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%
3. 数据统计：采用t检验。
结果与讨论
一、Ni2O3和NiAc对体外淋巴细胞增殖功能的作用
淋巴细胞增殖能力是机体免疫细胞介导的免疫应答过程中不可缺少的重要阶段。T淋巴细胞是特异性免疫细胞，并具有多种免疫调节功能，其免疫效应和调节功能又是多细胞间协同作用的结果。因此T细胞增殖能力的测定，不仅对分析机体淋巴细胞调节功能的变化，而且对了解机体抗肿瘤抗感染能力均有重要意义。从表1看出，在体外培养体系中加入Ni2O3,淋巴细胞对刺激的增殖作用随Ni2O3浓度增加，呈现抑制作用，尤其是在高浓度时，对淋巴细胞增殖的抑制作用更为明显(t检验P<0.01)。此外，结果显示Ni2O3对淋巴细胞有明显的毒性作用，而且可见明显的剂量与毒性关系。
, 百拇医药
表1 Ni2O3对体外淋巴细胞增殖的作用(
±s) Ni2O3浓度
(mmol)
无ConA刺激A值
ConA刺激A值
0
0.141±0.0101
0.263±0.019
0.125
0.117±0.011
, http://www.100md.com
0.243±0.015
0.25
0.075±0.004**
0.239±0.005
0.5
0.042±0.006**
0.164±0.034*
1.0
0.043±0.009**
0.023±0.009**
, http://www.100md.com
与无Ni2O3比较 *P<0.05 **P<0.01。
NiAc对淋巴细胞增殖的抑制作用，随剂量的增加，抑制作用增强。NiAc对淋巴细胞的毒性不明显，只是在高剂量时显示出毒性(见表2)。
表2 NiAc对淋巴细胞增殖的影响(±s) NiAc浓度
(mmol)
无ConA刺激A值
ConA刺激A值
0
0.062±0.029
, http://www.100md.com
0.285±0.026
0.063
0.082±0.012
0.213±0.025*
0.125
0.065±0.013
0.174±0.022**
0.25
0.050±0.003
0.079±0.038**
0.5
, http://www.100md.com
0.030±0.009*
0.040±0.001**
1.0
0.017±0.010**
0.033±0.004**
2.0
0.035±0.005**
0.022±0.010**
与无Ni2O3比较 *P<0.05 **P<0.01
, 百拇医药
通过对NiAc与Ni2O3在相同剂量时，淋巴细胞增殖作用的结果比较，NiAc对淋巴细胞增殖的抑制作用强于Ni2O3。
二、NiAc对淋巴细胞作用不同时间，对增殖能力的影响
从图1可见NiAc作用淋巴细胞2小时，淋巴细胞在高剂量时增殖能力降低，随NiAC作用时间延长，淋巴细胞在低剂量时增殖能力也降低，高剂量时增殖能力下降更为明显。通过比较看出，在同剂量NiAc存在条件下，随着作用时间的延长，NiAc对淋巴细胞增殖的抑制作用增强。
图1 NiAc不同作用时间对淋巴细胞增殖的影响
三、Ni2O3对体外诱导TNF产生的作用
, http://www.100md.com
TNF主要由单核巨噬细胞产生的一种具有抗肿瘤活性作用的细胞因子，TNF杀伤肿瘤细胞作用的机理是很复杂的，但主要是通过直接对肿瘤细胞的细胞毒作用，并通过诱导NK和巨噬细胞毒作用，以及诱导干扰素产生等一系列抗瘤效应，杀伤肿瘤细胞。实验结果表明，高剂量Ni2O3存在培养体系中，明显抑制TNF的产生，而低剂量Ni2O3，TNF产生则略增高(见表3)，但无统计学意义。
表3 Ni2O3对肿瘤坏死因子(TNFa)生成的作用(±s) Ni2O3剂量(mmol)
杀伤%
A值
, http://www.100md.com
0
37.9
0.432±0.052
0.125
44.4
0.386±0.013
0.25
48.2
0.360±0.030
0.5
27.9
0.489±0.033
, 百拇医药
1.0
27.5
0.504±0.023
2.0
23.9
0.529±0.035*
与无Ni2O3比较 *P<0.05
综上实验结果说明，镍在体外培养体系中达到一定剂量水平时，对免疫细胞从细胞初期增殖作用到分泌细胞因子，均呈抑制作用。免疫系统是机体抵抗疾病及有害物质入侵的重要防御系统，尤其在机体抗癌免疫中发挥着举足轻重的作用。因此，镍及其化合物诱发癌症过程中，免疫系统受抑制，尤其是免疫系统中抗瘤效应的低下，对癌症的发生显得更为重要。为此，提高或阻止镍及其化合物所引起的免疫细胞功能降低，对预防镍所造成的人群癌发率增高具有重要意义。
, 百拇医药
参考文献
1.刚葆琪，那常筠，陈 力.镍工肺癌病因研究.中华劳动卫生职业病杂志，1994，12(1)：8.
2.那常筠，陈 力，王秀玲，等.镍冶炼工人肺癌流行病学研究.中华劳动生职业病杂志，1993，(5)：261.
3.胡世洪，许嘉萍.镍及其化合物的致突变致癌和致畸胎作用研究进展.国外医学卫生学分册，1989，(2)：80.
4.Smialwicz RJ, Rogers RR, Riddle MM. Immunolgoe Effects of Nickel. Environmental Reseach, 1985,(36);56.
5.周道洪，沈元珊，赵曼瑞.测定淋巴细胞转化和鼠白细胞介素2活性的新方法-MTT比色法.中国免疫学杂志，1986，(1)：39.
6.Gong JH, Hans Sprenger, Armin Bender. J.Immunol,1991,(147):3507.
7.董钟云，卢 珊，张友会.巨噬细胞细胞因子性质的研究.中国医学科学院学报，1990，(5)：376.
(修回日期 1999年2月), 百拇医药
单位：北京市劳动卫生职业病防治研究所 (100020)
关键词：
卫生毒理学杂志990220 多年来，关于镍作业人员癌症流行病学调查及实验致癌研究结果证实，镍及某些化合物可诱发多种癌症[1～3]。这一结果早已被人们所重视，并且通过进一步对镍的诱癌机理的研究，多数认为镍可使细胞核DNA损伤，从而引起细胞突变。关于镍对机体免疫功能的影响，Smialowicz[4]通过实验研究表明，镍可使小鼠的天然杀伤(NK)细胞功能降低。我们从机体免疫系统特有的抗肿瘤功能角度，观察了两种镍化合物对体外培养的免疫细胞功能的影响，以探讨镍化合物的免疫毒性，并为镍致癌机理的研究提供必要的依据。
材料与方法
, http://www.100md.com 一、材料
黑色氧化镍(Ni2O3)和醋酸镍(NiAc)，化学纯，北京化工总厂产品。刀豆蛋白A(ConA)Sigma公司产品。L929细胞(小鼠纤维母细胞)，购于医科院肿瘤研究所。
二、方法：
1.用MTT法[5]测定Ni2O3和NiAc对体外淋巴细胞增殖功能的作用：常规无菌操作制备小鼠脾细胞悬液，用0.89%NH4Cl去除红细胞，将细胞悬液浓度调整为107/ml备用。取96孔培养板，每孔加100μl细胞悬液，50μl ConA(20μg/ml)或培液，50μl不同浓度的Ni2O3或NiAc,37℃ 5%CO2孵箱72小时，结束培养前4小时，每孔加30μl(1mg/ml)的MTT，4小时后，去掉上清，用二甲基亚砜溶解细胞后，酶标仪测定550/620nm A值。
, 百拇医药
2.Ni2O3对体外诱导TNF(肿瘤坏死因子)的作用：(1)TNF的体外诱导方法[6]：取小鼠腹腔巨噬细胞，调成106/ml，取24孔培养板，每孔加入0.5ml，再加入0.5ml不同浓度的Ni2O3，每孔含LPS(100ng/ml)，培养板置37℃ 5% CO2孵箱培养，24小时后收集上清，测定TNF活性。(2)TNF活性测定[7]：取L929细胞为靶细胞，接种96孔培养板5×104细胞/孔，再分别加入不同浓度Ni2O3诱导的TNF上清，在丝裂霉素存在条件下37℃，5% CO2培养18小时，经过结晶紫染色后于550/620nm下测定A值。TNF活性高对L929细胞杀伤能力强，结晶紫淡染，A值则降低，相反，TNF活性低A值则高。也可通过计算细胞毒性百分率表示活性强弱。
, http://www.100md.com
细胞毒性百分率=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%
3. 数据统计：采用t检验。
结果与讨论
一、Ni2O3和NiAc对体外淋巴细胞增殖功能的作用
淋巴细胞增殖能力是机体免疫细胞介导的免疫应答过程中不可缺少的重要阶段。T淋巴细胞是特异性免疫细胞，并具有多种免疫调节功能，其免疫效应和调节功能又是多细胞间协同作用的结果。因此T细胞增殖能力的测定，不仅对分析机体淋巴细胞调节功能的变化，而且对了解机体抗肿瘤抗感染能力均有重要意义。从表1看出，在体外培养体系中加入Ni2O3,淋巴细胞对刺激的增殖作用随Ni2O3浓度增加，呈现抑制作用，尤其是在高浓度时，对淋巴细胞增殖的抑制作用更为明显(t检验P<0.01)。此外，结果显示Ni2O3对淋巴细胞有明显的毒性作用，而且可见明显的剂量与毒性关系。
, 百拇医药
表1 Ni2O3对体外淋巴细胞增殖的作用(
±s) Ni2O3浓度(mmol)
无ConA刺激A值
ConA刺激A值
0
0.141±0.0101
0.263±0.019
0.125
0.117±0.011
, http://www.100md.com
0.243±0.015
0.25
0.075±0.004**
0.239±0.005
0.5
0.042±0.006**
0.164±0.034*
1.0
0.043±0.009**
0.023±0.009**
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与无Ni2O3比较 *P<0.05 **P<0.01。
NiAc对淋巴细胞增殖的抑制作用，随剂量的增加，抑制作用增强。NiAc对淋巴细胞的毒性不明显，只是在高剂量时显示出毒性(见表2)。
表2 NiAc对淋巴细胞增殖的影响(
±s) NiAc浓度(mmol)
无ConA刺激A值
ConA刺激A值
0
0.062±0.029
, http://www.100md.com
0.285±0.026
0.063
0.082±0.012
0.213±0.025*
0.125
0.065±0.013
0.174±0.022**
0.25
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0.079±0.038**
0.5
, http://www.100md.com
0.030±0.009*
0.040±0.001**
1.0
0.017±0.010**
0.033±0.004**
2.0
0.035±0.005**
0.022±0.010**
与无Ni2O3比较 *P<0.05 **P<0.01
, 百拇医药
通过对NiAc与Ni2O3在相同剂量时，淋巴细胞增殖作用的结果比较，NiAc对淋巴细胞增殖的抑制作用强于Ni2O3。
二、NiAc对淋巴细胞作用不同时间，对增殖能力的影响
从图1可见NiAc作用淋巴细胞2小时，淋巴细胞在高剂量时增殖能力降低，随NiAC作用时间延长，淋巴细胞在低剂量时增殖能力也降低，高剂量时增殖能力下降更为明显。通过比较看出，在同剂量NiAc存在条件下，随着作用时间的延长，NiAc对淋巴细胞增殖的抑制作用增强。
图1 NiAc不同作用时间对淋巴细胞增殖的影响
三、Ni2O3对体外诱导TNF产生的作用
, http://www.100md.com
TNF主要由单核巨噬细胞产生的一种具有抗肿瘤活性作用的细胞因子，TNF杀伤肿瘤细胞作用的机理是很复杂的，但主要是通过直接对肿瘤细胞的细胞毒作用，并通过诱导NK和巨噬细胞毒作用，以及诱导干扰素产生等一系列抗瘤效应，杀伤肿瘤细胞。实验结果表明，高剂量Ni2O3存在培养体系中，明显抑制TNF的产生，而低剂量Ni2O3，TNF产生则略增高(见表3)，但无统计学意义。
表3 Ni2O3对肿瘤坏死因子(TNFa)生成的作用(
±s) Ni2O3剂量(mmol)杀伤%
A值
, http://www.100md.com
0
37.9
0.432±0.052
0.125
44.4
0.386±0.013
0.25
48.2
0.360±0.030
0.5
27.9
0.489±0.033
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1.0
27.5
0.504±0.023
2.0
23.9
0.529±0.035*
与无Ni2O3比较 *P<0.05
综上实验结果说明，镍在体外培养体系中达到一定剂量水平时，对免疫细胞从细胞初期增殖作用到分泌细胞因子，均呈抑制作用。免疫系统是机体抵抗疾病及有害物质入侵的重要防御系统，尤其在机体抗癌免疫中发挥着举足轻重的作用。因此，镍及其化合物诱发癌症过程中，免疫系统受抑制，尤其是免疫系统中抗瘤效应的低下，对癌症的发生显得更为重要。为此，提高或阻止镍及其化合物所引起的免疫细胞功能降低，对预防镍所造成的人群癌发率增高具有重要意义。
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参考文献
1.刚葆琪，那常筠，陈 力.镍工肺癌病因研究.中华劳动卫生职业病杂志，1994，12(1)：8.
2.那常筠，陈 力，王秀玲，等.镍冶炼工人肺癌流行病学研究.中华劳动生职业病杂志，1993，(5)：261.
3.胡世洪，许嘉萍.镍及其化合物的致突变致癌和致畸胎作用研究进展.国外医学卫生学分册，1989，(2)：80.
4.Smialwicz RJ, Rogers RR, Riddle MM. Immunolgoe Effects of Nickel. Environmental Reseach, 1985,(36);56.
5.周道洪，沈元珊，赵曼瑞.测定淋巴细胞转化和鼠白细胞介素2活性的新方法-MTT比色法.中国免疫学杂志，1986，(1)：39.
6.Gong JH, Hans Sprenger, Armin Bender. J.Immunol,1991,(147):3507.
7.董钟云，卢 珊，张友会.巨噬细胞细胞因子性质的研究.中国医学科学院学报，1990，(5)：376.
(修回日期 1999年2月), 百拇医药