氧苯胂和二甲基胂酸对细胞间通讯的影响
作者：姚碧云 郭新彪 刘君卓
单位：姚碧云 (包头医学院卫生系 014010)； 郭新彪 刘君卓 (北京医科大学环境卫生学教研室)
关键词：氧苯胂；二甲基胂酸；细胞缝隙连接间通讯
卫生毒理学杂志990205 内容摘要 近年来的研究认为抑制细胞缝隙连接间通讯(GJIC)是促癌物的一种重要特性。代谢协同试验是测定GJIC的方法之一。本研究用此法探讨了氧苯胂和二甲基胂酸对V79细胞的GJIC的影响。该2种有机砷化物均为无机砷化物在哺乳动物体内的代谢产物。结果发现，氧苯胂能显著抑制V79细胞的代谢协同作用。在0.001μmol/L浓度下，其抑制作用最强。二甲基胂酸在0.01～1mmol/L浓度下对V79细胞也有一定的抑制作用。本研究首次提出氧苯胂可能有促癌活性，并进一步提示二甲基胂酸有促癌作用。
Effects of phenylarsine oxide and dimethylarsinic acid on intercellular communication
, 百拇医药
Yao Bi-yun，Guo Xin-biao，Liu Jun-zhuo
(Department of Environmental Health,Beijing Medical University,Beijing 100083)
Gap junctional intercellular communication (GJIC) is important in the regulation of cellular proliferation and tissue homeostasis.Inhibition of GJIC is recognized to be one of the important characteristics of tumor promoters.To further clarify the role of metabolite of inorganic arsenic in arsenic carcinogenesis,we investigated that effects of phenylarsine oxide (PhAsO) and dimethylarsinic acid(DMAA),were two important metabolites of inorganic arsenic,on GJIC by detecting of metabolic cooperation (MC) between Chinese hamster V79 cells.The results showed that PhAsO at 0.001～0.01μmol/L,and DMAA at 0.01～1mmol/L significantly inhibited MC between V79 cells.This study suggest that organic metabolites of arsenic may be involved in arsenic carcinogenesis.
, 百拇医药
Key words:Phenylarsine oxide;Dimethylarsinic acid;Gap junctional intercellular communication
大量的流行病学资料报道砷化物可以引起人类的皮肤癌、肺癌及多种内脏癌。国际癌症研究机构(IARC)于1979年确认无机砷化物为人类的致癌物，但是砷致癌的动物实验资料与流行病学资料并不完全一致[1]。至今，砷致癌的机制仍不很清楚。氧苯胂、二甲基胂酸均是无机砷化物在哺乳动物体内的代谢产物[2,3]。最近的一些研究表明，二甲基胂酸在癌变过程的促癌阶段发生作用，这可能与砷致人类的肿瘤有关[4,5]。许多资料表明细胞缝隙连接间通讯(GJIC)与细胞生长调控有关，抑制GJIC被认为是促癌物的一个重要特性。代谢协同试验是测定GJIC的方法之一。本研究采用此法，探讨了这2种有机砷化物是否会影响GJIC，从而对砷的致癌机制作进一步探讨。
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代谢协同试验的原理为：野生型V79细胞(V79+)能代谢6-巯基鸟嘌呤(6-TG)而产生有毒代谢产物，导致V79+细胞自身死亡。突变型V79细胞(V79-)无此功能。当该两种细胞同时在含有6-TGF的培养基中培养时，由于代谢协同的作用，V79+细胞内产生的有毒代谢物能通过细胞缝隙连接进入V79-细胞内，引起后者的死亡。如果培养基内加入的受试物具有抑制GJIC的作用，则代谢协同受阻，有毒代谢产物进入V79-细胞内的量明显减少，因而一部分V79-细胞能够存活并形成克隆。通过计数V79-细胞克隆数，可以了解V79细胞间代谢协同的水平。
材料与方法
一、实验用细胞株
1.野生型中国仓鼠肺成纤维V79细胞(V79+)：由北京医科大学毒理学教研室林慰慈教授惠赠。
, 百拇医药
2.突变型中国仓鼠肺成纤维V79细胞(V79-)：由日本国立医药品食品卫生研究所提供。
二、主要试剂
氧苯胂(Phenylarsine Oxide;PhAsO),二甲基胂酸(Dimethylarsinic Acid;DMAA)DMEM培养基：GIBICO，美国；胎牛血清：中国医学科学院天津血液研究所；胰蛋白酶：GIBICO，美国；6-巯基鸟嘌呤(6-TG)：Wako公司，日本.12-O-四葵酰基-佛波-13-乙酸酯(TPA)：Sigma公司，美国。
三、细胞培养
用含0.04%胰蛋白酶和0.002% EDTA的无钙镁离子的磷酸盐缓冲液(PBS)消化将细胞分离后，用含10%胎牛血清、1μg/ml庆大霉素的DMEM培养基于37℃，5%CO2培养条件下进行培养，2～3天传一代。实验前将V79+细胞用含1%次黄嘌呤，氨基喋呤，胸腺嘧啶核苷的选择培养基筛选，除去自发突变。
, 百拇医药
四、细胞缝隙连接通讯功能的测定
采用V79细胞代谢协同法。
1.受试物细胞毒性评价：在代谢协同测定前，首先测定受试物的细胞毒性，根据细胞毒性的实验结果，选择无细胞毒性的受试物浓度范围进行代谢协同测定。
将V79-细胞以150个/瓶密度，接种于25cm2的塑料培养瓶内，在37℃，5%CO2下培养，待细胞贴壁后，加入不同浓度的受试物，每一剂量组做3个平行样。3天后再换以新鲜的培养液，培养3～5天至明显的细胞克隆形成。用甲醇固定细胞，结晶紫染色后，计数细胞克隆数(一般只计数每个大于50个细胞的克隆)。我们在预实验中发现，V79-细胞的接种有效率为60%左右。因此，为校正接种有效率的变化，每次实验同时要做空白组3～5瓶，在相同的培养条件下培养。最后各受试物处理组均与空白组进行比较，计算各处理组的细胞生存率：
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细胞生存率=(处理组细胞克隆数/空白组细胞克隆数)×100%
V79-细胞生存率大于70%时可以认为受试物的浓度在进行代谢协同时无明显的细胞毒性。
2.代谢协同的测定：参考Trosko[6]介绍的方法并稍加改进。取对数生长期的V79+和V79-细胞，将V79+细胞用DMEM稀释为1×105个/ml的细胞悬液，V79-细胞稀释为75个/ml的细胞悬液，将V79+和V79-细胞等体积混合，然后取4ml混合细胞悬液接种于25cm2培养瓶内，在37℃，5%CO2条件下培养，待细胞贴壁后加入受试物，15分钟后加入6-TG,培养3天。3天后将含有受试物的培养液去除，用PBS液清洗一次，然后换以新鲜的含有6-TG的DMEM的培养液，培养2～3天后再换以新鲜的但不含6-TG的DMEM培养液，继续培养3天。细胞培养7～8天后镜下观察其状态，然后用甲醇固定，0.1%结晶紫染色，计数细胞克隆数。为校正接种有效率的变化，每次实验同时要做V79-细胞单独培养组3～5瓶，在相同的培养条件下培养。最后与此组的克隆数比较，计算受试物处理组细胞的存活率：
, 百拇医药
细胞存活率=(混合培养组克隆数/V79-细胞单独培养组克隆数)×100%
每次实验每一剂量组均做3个平行样。而且，每次实验均同时做5个平行样的阳性对照组(TPA组)。
五、统计方法 采用t检验法。
结 果
一、2种砷化物的细胞毒性
1.氧苯砷的细胞毒性：见表1。
表1 氧苯胂的细胞毒性(
±s) 浓度(μmol/L)
V79-细胞生存率(%)
, 百拇医药
0.0
100.0±0.0
0.001
100.0±11.0
0.01
55.1±7.3
0.05
8.6±2.3
0.1
0.0±0.0
以上是3次重复实验的结果，由表1可看出，当PhAsO浓度为0.01μmol/L时，细胞生存率为55.1%，根据这一结果，在进行代谢协同实验时，氧苯胂的浓度应选择在小于或等于0.01μmol/L的范围内。
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2.二甲基胂酸的细胞毒性：见表2。
表2 二甲基胂酸的细胞毒性(±s) 浓度(μmol/L)
V79-细胞生存率(%)
0.0
100.0±0.0
0.001
98.7±3.0
0.01
97.4±5.9
0.1
, 百拇医药
87.6±3.4
1.0
77.4±2.6
本实验亦重复进行了3次，由表2可以看出，二甲基胂酸在1.0mmol/L及以下浓度
时细胞存活率均大于70%,说明在此浓度范围内进行代谢协同实验无细胞毒性。
二、二种砷化物对V79细胞间代谢协同的影响
1.氧苯胂对代谢协同的影响：见表3。
表3 氧苯胂对代谢协同的影响 处理
浓度(μmol/L)
V79-细胞存活率(%)
, http://www.100md.com
对照
22.0±6.5
DMSO
0.5a
22.6±5.8
PhAsO
0.0001
40.2±10.6**
0.001
43.1±16.9**
0.01
40.2±9.0**
, 百拇医药
TPA
0.01b
53.5±10.8**
a:%;b:μg/ml;**P<0.01
结果显示，氧苯胂能显著抑制V79细胞间的代谢协同作用，各浓度组的细胞存活率均高于对照组(P<0.01)。氧苯胂很难溶于水，我们选用二甲基亚砜作为溶剂。二甲基亚砜在0.5%的浓度下对代谢协同不产生影响。
2.二甲基胂酸对代谢协同的影响：见表4.
表4 二甲基胂酸对代谢协同的影响(±s) 处理
, http://www.100md.com 浓度(μmol/L)
V79-细胞存活率(%)
对照
19.8±2.6
DMAA
0.001
24.8±6.7
0.01
29.4±8.7*
0.1
26.8±4.4*
1
, 百拇医药
27.2±4.0*
TPA
0.01a
66.8±9.9**
a:μg/ml *P<0.05;**P<0.01
3次重复实验的结果显示，在二甲基胂酸无细胞毒性浓度范围内，最低浓度组细胞存活率与对照组无明显差异(P>0.05)。其它浓度组细胞存活率与对照组比较均有显著差异(P<0.05)，这表明在(0.01～1.0)mmol/L浓度范围内二甲基胂酸对V79细胞间的代谢协同也有一定的抑制作用，但剂量-反应关系不明显，在0.01mmol/L浓度下，细胞存活率最大，其抑制作用最强。
讨 论
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一、氧苯胂对代谢协同的影响
氧苯胂是一种3价有机砷化物，人体摄入的砷化物，尤为带有苯环的有机砷化物被吸收后，在体内可以被转化为氧苯胂，以此形式与细胞内的巯基结合。氧苯胂含有亲脂性的烷基，其对巯基酶活性的抑制比无机砷更强[2]。在体外实验中，氧苯胂能抑制细胞对葡萄糖的摄入，从而引起细胞能量代谢功能的损害，产生细胞毒性作用[7]。本研究探讨了氧苯胂对代谢协同的影响，并首次发现氧苯胂对V79细胞间的代谢协同能产生抑制作用，在0.001μmol/L浓度下V79-细胞存活率为43.1%,其抑制作用最强。至今，关于有机砷化物致癌性研究的报道较少，有机砷化物是否具有致癌作用目前尚不清楚，氧苯胂有无致癌性则更不清楚。本次研究发现，氧苯胂能抑制GJIC，这提示三价有机砷化物在砷的致癌作用中可能起着重要作用。有机砷化物的致癌性值得进一步探讨。缝隙连接是一种膜结构，相邻细胞有(15～20)nm的空隙，其间靠细胞质膜上的一个嵌入蛋白连接，使细胞之间产生代谢协同，传递细胞生长发育的信号[6]。这个嵌入蛋白中含有许多巯基，对于缝隙连接的形成起着重要的作用。我们推测，氧苯胂与缝隙连接蛋白中的巯基结合，改变其结构及生理特性，从而抑制了GJIC。
, 百拇医药
二、二甲基胂酸对代谢协同的影响
二甲基胂酸是无机砷化物在哺乳动物体内的主要代谢产物，无机砷化物甲基化被认为是无机砷的解毒机制[3]。但最近的一些研究表明，砷化物甲基化后并未达到完全安全的程度。日本学者根据体内、体外实验证明二甲基胂酸能对细胞产生氧化损伤，可以引起DNA蛋白链的交联及DNA链的断裂，但这并非是由二甲基胂酸直接引起，而是由二甲基胂酸在进一步代谢过程中产生的过氧离子所引起[8,9]。另外，最近的动物实验资料报道，二甲基胂酸可能是一种促癌物。Yamamoto等[4]用5种不同的癌启动剂处理F344/DuCrj大鼠后再给予二甲基胂酸，发现实验组大鼠肺癌发生率高于对照组。Yamanaka等[5]给予小鼠致癌起始物4-硝基喹啉后，再给予含有二甲基胂酸的水25周，结果发现实验组小鼠肺癌发生率高于对照组。
本次实验结果表明，二甲基胂酸对V79细胞间代谢协同作用有一定的抑制作用，(0.01～1)mmol/L组V79-细胞存活率均大于对照组(P<0.05)。本次研究结果提示二甲基胂酸对GJIC的抑制可能与其促癌作用有关。有资料表明，自由基的产生是引起GJIC抑制的重要机制[10]。因此，我们推测二甲基胂酸在代谢过程中可能产生过氧离子导致GJIC抑制。
, http://www.100md.com
虽然有机砷化物致癌的流行病学资料至今尚未见报道，但本次研究结果表明，氧苯胂及二甲基胂酸均可抑制GJIC，提示这两种有机砷化物可能对正常细胞的生长调控产生影响。因此，砷的致癌机制中有机砷化物的作用不容忽视，有待进一步的研究。
国家自然科学基金资助课题No.39300108
参考文献
1.苏 嫦，孙恩杰.砷.见：王夔主编.生命科学中的微量元素，北京：中国计量出版社，1992，147～175.
2.李宏霞，杨在昌.见：蔡宏道，主编.现代环境卫生学，北京：人民卫生出版社，1995,508～511.
3.Ishinishi N,Hisanaga A,Tanaka A,et al.Toxicology and metabolic aspects of arsenic poisoning.J.UOEH,1988,10(suppl):97.
, 百拇医药
4.Yamamoto S,Konishi Y,Matsuda T,et al.Cancer induction by an organic arsenic compound,dimethylarsenic acid(cacodylic acid),in F344/DuCrj rats after pretreatment with five carcinogens.Cancer Res.,1995,55:1271.
5.Yamanaka K,Ohtsubo K,Hasegawa A,et al.Exposure to dimethylarsenic acid,a main metabolite of inorganic arsenics,strongly promotes tumorigenesis initiated by 4-nitroquinoline 1-oxide in the lungs of mice.Carcinogenesis,1996,17:767.
, 百拇医药
6.Trosko J.E,John C,Aylsworth C,et al.In vitro assay to detect inhibitors of intercellular communication.In:Milman H.A.,Weisburger E.K.,eds.Handbook of carcinogen testing.New Jersey:Noyes Publications,1985,422～437.
7.Liebl B,Muckter H,Doklea E,et al.Influence of organic and inorganic arsenicals on glucose uptake in Madin-Darby canine kindey(MDCK)cells,Analyst,1992,117:681.
8.Yamanaka K,Hasegawa A,Sawamura R,et al.Dimethylated arsenics induce DNA strand breaks in lung via the production of active oxygen in mice,Biochem.Biophys.Res Commun,1989,165:43.
, 百拇医药
9.Yamanaka K,Hoshino M,Okamoto M,et al.Induction of DNA damage by dimethylarsine,a metabolite of inorganic arsenics,is for the major part likely due to its peroxyl radical,Biochem.Biophys.Res.Commun,1990,168:58.
10.Guo X,Ohno Y,Takanaka A.Possible involvement of oxygen free radicals in the mechanism of 25-hydroxycholesterol-induced inhibition of gap junctional communication between rat hepatocytes.Eur.J.Pharmacol,1993,248:337.
(修回日期 1998年10月), http://www.100md.com
单位：姚碧云 (包头医学院卫生系 014010)； 郭新彪 刘君卓 (北京医科大学环境卫生学教研室)
关键词：氧苯胂；二甲基胂酸；细胞缝隙连接间通讯
卫生毒理学杂志990205 内容摘要 近年来的研究认为抑制细胞缝隙连接间通讯(GJIC)是促癌物的一种重要特性。代谢协同试验是测定GJIC的方法之一。本研究用此法探讨了氧苯胂和二甲基胂酸对V79细胞的GJIC的影响。该2种有机砷化物均为无机砷化物在哺乳动物体内的代谢产物。结果发现，氧苯胂能显著抑制V79细胞的代谢协同作用。在0.001μmol/L浓度下，其抑制作用最强。二甲基胂酸在0.01～1mmol/L浓度下对V79细胞也有一定的抑制作用。本研究首次提出氧苯胂可能有促癌活性，并进一步提示二甲基胂酸有促癌作用。
Effects of phenylarsine oxide and dimethylarsinic acid on intercellular communication
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Yao Bi-yun，Guo Xin-biao，Liu Jun-zhuo
(Department of Environmental Health,Beijing Medical University,Beijing 100083)
Gap junctional intercellular communication (GJIC) is important in the regulation of cellular proliferation and tissue homeostasis.Inhibition of GJIC is recognized to be one of the important characteristics of tumor promoters.To further clarify the role of metabolite of inorganic arsenic in arsenic carcinogenesis,we investigated that effects of phenylarsine oxide (PhAsO) and dimethylarsinic acid(DMAA),were two important metabolites of inorganic arsenic,on GJIC by detecting of metabolic cooperation (MC) between Chinese hamster V79 cells.The results showed that PhAsO at 0.001～0.01μmol/L,and DMAA at 0.01～1mmol/L significantly inhibited MC between V79 cells.This study suggest that organic metabolites of arsenic may be involved in arsenic carcinogenesis.
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Key words:Phenylarsine oxide;Dimethylarsinic acid;Gap junctional intercellular communication
大量的流行病学资料报道砷化物可以引起人类的皮肤癌、肺癌及多种内脏癌。国际癌症研究机构(IARC)于1979年确认无机砷化物为人类的致癌物，但是砷致癌的动物实验资料与流行病学资料并不完全一致[1]。至今，砷致癌的机制仍不很清楚。氧苯胂、二甲基胂酸均是无机砷化物在哺乳动物体内的代谢产物[2,3]。最近的一些研究表明，二甲基胂酸在癌变过程的促癌阶段发生作用，这可能与砷致人类的肿瘤有关[4,5]。许多资料表明细胞缝隙连接间通讯(GJIC)与细胞生长调控有关，抑制GJIC被认为是促癌物的一个重要特性。代谢协同试验是测定GJIC的方法之一。本研究采用此法，探讨了这2种有机砷化物是否会影响GJIC，从而对砷的致癌机制作进一步探讨。
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代谢协同试验的原理为：野生型V79细胞(V79+)能代谢6-巯基鸟嘌呤(6-TG)而产生有毒代谢产物，导致V79+细胞自身死亡。突变型V79细胞(V79-)无此功能。当该两种细胞同时在含有6-TGF的培养基中培养时，由于代谢协同的作用，V79+细胞内产生的有毒代谢物能通过细胞缝隙连接进入V79-细胞内，引起后者的死亡。如果培养基内加入的受试物具有抑制GJIC的作用，则代谢协同受阻，有毒代谢产物进入V79-细胞内的量明显减少，因而一部分V79-细胞能够存活并形成克隆。通过计数V79-细胞克隆数，可以了解V79细胞间代谢协同的水平。
材料与方法
一、实验用细胞株
1.野生型中国仓鼠肺成纤维V79细胞(V79+)：由北京医科大学毒理学教研室林慰慈教授惠赠。
, 百拇医药
2.突变型中国仓鼠肺成纤维V79细胞(V79-)：由日本国立医药品食品卫生研究所提供。
二、主要试剂
氧苯胂(Phenylarsine Oxide;PhAsO),二甲基胂酸(Dimethylarsinic Acid;DMAA)DMEM培养基：GIBICO，美国；胎牛血清：中国医学科学院天津血液研究所；胰蛋白酶：GIBICO，美国；6-巯基鸟嘌呤(6-TG)：Wako公司，日本.12-O-四葵酰基-佛波-13-乙酸酯(TPA)：Sigma公司，美国。
三、细胞培养
用含0.04%胰蛋白酶和0.002% EDTA的无钙镁离子的磷酸盐缓冲液(PBS)消化将细胞分离后，用含10%胎牛血清、1μg/ml庆大霉素的DMEM培养基于37℃，5%CO2培养条件下进行培养，2～3天传一代。实验前将V79+细胞用含1%次黄嘌呤，氨基喋呤，胸腺嘧啶核苷的选择培养基筛选，除去自发突变。
, 百拇医药
四、细胞缝隙连接通讯功能的测定
采用V79细胞代谢协同法。
1.受试物细胞毒性评价：在代谢协同测定前，首先测定受试物的细胞毒性，根据细胞毒性的实验结果，选择无细胞毒性的受试物浓度范围进行代谢协同测定。
将V79-细胞以150个/瓶密度，接种于25cm2的塑料培养瓶内，在37℃，5%CO2下培养，待细胞贴壁后，加入不同浓度的受试物，每一剂量组做3个平行样。3天后再换以新鲜的培养液，培养3～5天至明显的细胞克隆形成。用甲醇固定细胞，结晶紫染色后，计数细胞克隆数(一般只计数每个大于50个细胞的克隆)。我们在预实验中发现，V79-细胞的接种有效率为60%左右。因此，为校正接种有效率的变化，每次实验同时要做空白组3～5瓶，在相同的培养条件下培养。最后各受试物处理组均与空白组进行比较，计算各处理组的细胞生存率：
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细胞生存率=(处理组细胞克隆数/空白组细胞克隆数)×100%
V79-细胞生存率大于70%时可以认为受试物的浓度在进行代谢协同时无明显的细胞毒性。
2.代谢协同的测定：参考Trosko[6]介绍的方法并稍加改进。取对数生长期的V79+和V79-细胞，将V79+细胞用DMEM稀释为1×105个/ml的细胞悬液，V79-细胞稀释为75个/ml的细胞悬液，将V79+和V79-细胞等体积混合，然后取4ml混合细胞悬液接种于25cm2培养瓶内，在37℃，5%CO2条件下培养，待细胞贴壁后加入受试物，15分钟后加入6-TG,培养3天。3天后将含有受试物的培养液去除，用PBS液清洗一次，然后换以新鲜的含有6-TG的DMEM的培养液，培养2～3天后再换以新鲜的但不含6-TG的DMEM培养液，继续培养3天。细胞培养7～8天后镜下观察其状态，然后用甲醇固定，0.1%结晶紫染色，计数细胞克隆数。为校正接种有效率的变化，每次实验同时要做V79-细胞单独培养组3～5瓶，在相同的培养条件下培养。最后与此组的克隆数比较，计算受试物处理组细胞的存活率：
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细胞存活率=(混合培养组克隆数/V79-细胞单独培养组克隆数)×100%
每次实验每一剂量组均做3个平行样。而且，每次实验均同时做5个平行样的阳性对照组(TPA组)。
五、统计方法 采用t检验法。
结 果
一、2种砷化物的细胞毒性
1.氧苯砷的细胞毒性：见表1。
表1 氧苯胂的细胞毒性(
±s) 浓度(μmol/L)V79-细胞生存率(%)
, 百拇医药
0.0
100.0±0.0
0.001
100.0±11.0
0.01
55.1±7.3
0.05
8.6±2.3
0.1
0.0±0.0
以上是3次重复实验的结果，由表1可看出，当PhAsO浓度为0.01μmol/L时，细胞生存率为55.1%，根据这一结果，在进行代谢协同实验时，氧苯胂的浓度应选择在小于或等于0.01μmol/L的范围内。
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2.二甲基胂酸的细胞毒性：见表2。
表2 二甲基胂酸的细胞毒性(
±s) 浓度(μmol/L)V79-细胞生存率(%)
0.0
100.0±0.0
0.001
98.7±3.0
0.01
97.4±5.9
0.1
, 百拇医药
87.6±3.4
1.0
77.4±2.6
本实验亦重复进行了3次，由表2可以看出，二甲基胂酸在1.0mmol/L及以下浓度
时细胞存活率均大于70%,说明在此浓度范围内进行代谢协同实验无细胞毒性。
二、二种砷化物对V79细胞间代谢协同的影响
1.氧苯胂对代谢协同的影响：见表3。
表3 氧苯胂对代谢协同的影响 处理
浓度(μmol/L)
V79-细胞存活率(%)
, http://www.100md.com
对照
22.0±6.5
DMSO
0.5a
22.6±5.8
PhAsO
0.0001
40.2±10.6**
0.001
43.1±16.9**
0.01
40.2±9.0**
, 百拇医药
TPA
0.01b
53.5±10.8**
a:%;b:μg/ml;**P<0.01
结果显示，氧苯胂能显著抑制V79细胞间的代谢协同作用，各浓度组的细胞存活率均高于对照组(P<0.01)。氧苯胂很难溶于水，我们选用二甲基亚砜作为溶剂。二甲基亚砜在0.5%的浓度下对代谢协同不产生影响。
2.二甲基胂酸对代谢协同的影响：见表4.
表4 二甲基胂酸对代谢协同的影响(
±s) 处理, http://www.100md.com 浓度(μmol/L)
V79-细胞存活率(%)
对照
19.8±2.6
DMAA
0.001
24.8±6.7
0.01
29.4±8.7*
0.1
26.8±4.4*
1
, 百拇医药
27.2±4.0*
TPA
0.01a
66.8±9.9**
a:μg/ml *P<0.05;**P<0.01
3次重复实验的结果显示，在二甲基胂酸无细胞毒性浓度范围内，最低浓度组细胞存活率与对照组无明显差异(P>0.05)。其它浓度组细胞存活率与对照组比较均有显著差异(P<0.05)，这表明在(0.01～1.0)mmol/L浓度范围内二甲基胂酸对V79细胞间的代谢协同也有一定的抑制作用，但剂量-反应关系不明显，在0.01mmol/L浓度下，细胞存活率最大，其抑制作用最强。
讨 论
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一、氧苯胂对代谢协同的影响
氧苯胂是一种3价有机砷化物，人体摄入的砷化物，尤为带有苯环的有机砷化物被吸收后，在体内可以被转化为氧苯胂，以此形式与细胞内的巯基结合。氧苯胂含有亲脂性的烷基，其对巯基酶活性的抑制比无机砷更强[2]。在体外实验中，氧苯胂能抑制细胞对葡萄糖的摄入，从而引起细胞能量代谢功能的损害，产生细胞毒性作用[7]。本研究探讨了氧苯胂对代谢协同的影响，并首次发现氧苯胂对V79细胞间的代谢协同能产生抑制作用，在0.001μmol/L浓度下V79-细胞存活率为43.1%,其抑制作用最强。至今，关于有机砷化物致癌性研究的报道较少，有机砷化物是否具有致癌作用目前尚不清楚，氧苯胂有无致癌性则更不清楚。本次研究发现，氧苯胂能抑制GJIC，这提示三价有机砷化物在砷的致癌作用中可能起着重要作用。有机砷化物的致癌性值得进一步探讨。缝隙连接是一种膜结构，相邻细胞有(15～20)nm的空隙，其间靠细胞质膜上的一个嵌入蛋白连接，使细胞之间产生代谢协同，传递细胞生长发育的信号[6]。这个嵌入蛋白中含有许多巯基，对于缝隙连接的形成起着重要的作用。我们推测，氧苯胂与缝隙连接蛋白中的巯基结合，改变其结构及生理特性，从而抑制了GJIC。
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二、二甲基胂酸对代谢协同的影响
二甲基胂酸是无机砷化物在哺乳动物体内的主要代谢产物，无机砷化物甲基化被认为是无机砷的解毒机制[3]。但最近的一些研究表明，砷化物甲基化后并未达到完全安全的程度。日本学者根据体内、体外实验证明二甲基胂酸能对细胞产生氧化损伤，可以引起DNA蛋白链的交联及DNA链的断裂，但这并非是由二甲基胂酸直接引起，而是由二甲基胂酸在进一步代谢过程中产生的过氧离子所引起[8,9]。另外，最近的动物实验资料报道，二甲基胂酸可能是一种促癌物。Yamamoto等[4]用5种不同的癌启动剂处理F344/DuCrj大鼠后再给予二甲基胂酸，发现实验组大鼠肺癌发生率高于对照组。Yamanaka等[5]给予小鼠致癌起始物4-硝基喹啉后，再给予含有二甲基胂酸的水25周，结果发现实验组小鼠肺癌发生率高于对照组。
本次实验结果表明，二甲基胂酸对V79细胞间代谢协同作用有一定的抑制作用，(0.01～1)mmol/L组V79-细胞存活率均大于对照组(P<0.05)。本次研究结果提示二甲基胂酸对GJIC的抑制可能与其促癌作用有关。有资料表明，自由基的产生是引起GJIC抑制的重要机制[10]。因此，我们推测二甲基胂酸在代谢过程中可能产生过氧离子导致GJIC抑制。
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虽然有机砷化物致癌的流行病学资料至今尚未见报道，但本次研究结果表明，氧苯胂及二甲基胂酸均可抑制GJIC，提示这两种有机砷化物可能对正常细胞的生长调控产生影响。因此，砷的致癌机制中有机砷化物的作用不容忽视，有待进一步的研究。
国家自然科学基金资助课题No.39300108
参考文献
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3.Ishinishi N,Hisanaga A,Tanaka A,et al.Toxicology and metabolic aspects of arsenic poisoning.J.UOEH,1988,10(suppl):97.
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4.Yamamoto S,Konishi Y,Matsuda T,et al.Cancer induction by an organic arsenic compound,dimethylarsenic acid(cacodylic acid),in F344/DuCrj rats after pretreatment with five carcinogens.Cancer Res.,1995,55:1271.
5.Yamanaka K,Ohtsubo K,Hasegawa A,et al.Exposure to dimethylarsenic acid,a main metabolite of inorganic arsenics,strongly promotes tumorigenesis initiated by 4-nitroquinoline 1-oxide in the lungs of mice.Carcinogenesis,1996,17:767.
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6.Trosko J.E,John C,Aylsworth C,et al.In vitro assay to detect inhibitors of intercellular communication.In:Milman H.A.,Weisburger E.K.,eds.Handbook of carcinogen testing.New Jersey:Noyes Publications,1985,422～437.
7.Liebl B,Muckter H,Doklea E,et al.Influence of organic and inorganic arsenicals on glucose uptake in Madin-Darby canine kindey(MDCK)cells,Analyst,1992,117:681.
8.Yamanaka K,Hasegawa A,Sawamura R,et al.Dimethylated arsenics induce DNA strand breaks in lung via the production of active oxygen in mice,Biochem.Biophys.Res Commun,1989,165:43.
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9.Yamanaka K,Hoshino M,Okamoto M,et al.Induction of DNA damage by dimethylarsine,a metabolite of inorganic arsenics,is for the major part likely due to its peroxyl radical,Biochem.Biophys.Res.Commun,1990,168:58.
10.Guo X,Ohno Y,Takanaka A.Possible involvement of oxygen free radicals in the mechanism of 25-hydroxycholesterol-induced inhibition of gap junctional communication between rat hepatocytes.Eur.J.Pharmacol,1993,248:337.
(修回日期 1998年10月), http://www.100md.com