兔角膜碱烧伤后角膜组织中NO、MDA含量及SOD活性的变化
作者：谢德雍 苏建中 罗德生 郑红花 李映红 王汉洲 王梅娟 董加喜
单位：谢德雍 苏建中 咸宁医学院附属第二医院眼科，咸宁 437100；罗德生 郑红花 李映红 王汉洲 王梅娟 董加喜 咸宁医学院生物化学教研室，咸宁 437100
关键词：角膜碱烧伤；一氧化氮；丙二醛；超氧化物歧化酶
咸宁医学院学报990203 摘 要 目的：探讨一氧化氮与脂质过氧化反应在角膜碱烧伤中的作用。方法：在兔右眼角膜用2mol/L NaOH溶液烧伤60秒钟后，分别于第1、4、8、16、32及64天测量其NO和丙二醛(MDA)的含量及SOD活性，左眼为正常对照。结果：烧伤后的第1、4、8、16及32天，其NO和MDA含量显著高于对照组，至第64天接近对照组水平。烧伤后第1～16天，SOD活性较对照组显著降低，第32天已基本恢复至对照组水平。结论：角膜碱烧伤后角膜组织中NO水平升高和脂质过氧化反应增强可能是其损伤机制之一。
, 百拇医药
中图分类号 R77913
The Changes of Nitric Oxide and MDA Levels and SOD Activity
in Corneal Tissue After Corneal Burn by Alkali in Rabbits
Xie Deyong1,Shu Jianzhong1,Luo Desheng2 et al
1 Department of Ophthalmology,the Second Affiliated Hospital of Xianning Medical College,Xianning 437100
2 Department of Biochemistry,Xianning Medical College,Xianning 437100
, 百拇医药
ABSTRACT Objective To explore the effects of nitric oxide and lipid peroxidation in the cases of corneal alkali burn.Method Burn the right eye cornea of rabbits with 2 mol/L NaOH solution for 60 seconds while the left eyes as control group,and then measure the NO level,MDA level and SOD activity in cornea tissue.Results On the lst,4th,8th,16th and 32 nd days after the burning,the NO and MDA level of experimental group were markedly higher than those of control group.After 64 days,these two indexes of experimental group came near those of the control.From the lst to 16th days,SOD activity of experimental group was remarkably decreased；on the 32nd day,no noticeable difference was found in both groups and on the 64th day,it reverted to the control level.Couclusion After corneal alkali burn,it was possibly one of the machanism of injury that NO level increases and lipid peroxidation strengthens in damaged corneal tissue.
, 百拇医药
KEY WORDS Corneal alkali burn；Nitric oxide；MDA；SOD
角膜碱性化学伤是临床上常见且较严重的眼外伤之一，若不采取及时有效治疗，可反复发生无菌性角膜溃疡，甚至出现穿孔，最后形成瘢痕，致使永久性视力障碍[1]。已有报导角膜碱烧伤与自由基有关[2]。近年来研究发现，NO在眼部含量十分丰富，并与眼部炎症反应、血液循环及眼压的调节和视网膜神经元的生理、病理过程有关[3]。但NO在碱性化学伤中的作用尚未见报道，为此本文对此作了初步探讨，现报告如下。
1 材料和方法
1.1动物模型
选择健康白色家兔30只，体质量1.8～2.5kg，雌雄兼有，用放大镜检查角膜正常者用于实验。30只兔的左眼为正常对照组，右眼为实验组。用3%的戊巴比妥按1ml/kg体重经耳缘静脉给药，全麻后用1%的地卡因滴眼，开睑器充分开睑，灭菌小棉签吸去结膜囊内液体。用直径10mm圆形滤纸片浸入2 mol/L NaOH溶液中饱和后取出，轻触干滤纸以吸去多余的碱性溶液，然后快速将饱和滤纸片准确贴敷于右眼角膜上1分钟后取下，立即用灭菌生理盐水冲洗2分钟。左眼除用生理盐水取代NaOH溶液浸泡滤纸片外，其余操作同右眼。
, http://www.100md.com
1.2 NO、MDA含量及SOD活性测定
于烧伤后的第1、4、8、16、32及64天，分别随机取5只兔的对照眼和实验眼角膜组织。按文献[4]方法，用津岛AEL—200型电子分析天平称重后，冰浴下用DY—1型电动玻璃匀浆器制成10%匀浆，再用JY92—Ⅱ型超声粉碎机破碎细胞。在UV—754型分光光度计下用LOWRY氏法测定蛋白质含量。MDA含量测定用硫代巴比妥酸显色法。NO含量测定用DIAZOTIZATION反应，按军事医学科学院放射医学研究所提供的试剂盒(批号980918)说明书操作。SOD活性测定按南京聚力生物医学工程研究所提供的试剂盒 (批号981114)说明书操作。
1.3 统计学处理
实验组与对照组间NO、MDA含量及SOD活性变化采用两样本均数的t检验。对实验组ON与MDA含量及SOD活性、MDA含量与SOD活性的相关性，采用直线相关分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1NO含量的变化
烧伤后的第1～32天，实验组角膜组织中NO的含量与对照组同期相比，均有显著性差异，尤其是第4天和第8天，差异非常显著(P<0.01)，第64天时，其含量基本回复至对照组水平(表1)。
表1 角膜碱烧伤后NO含量的变化(
±s)
(单位：nmol/mg.pro) 天数
只数
实验组
对照组
, http://www.100md.com 1
5
13.5±0.51*
12.41±0.39
4
5
13.56±0.64△
12.31±0.48
8
5
13.26±0.55△
12.22±0.41
, http://www.100md.com
16
5
13.00±0.55*
12.16±0.43
32
5
12.86±0.57*
12.10±0.32
64
5
12.50±0.50
12.31±0.33
, http://www.100md.com
与对照组相比*P<0.05，△P<0.01
2.2 MDA含量的变化
烧伤组角膜组织中的MDA含量变化情况与NO的变化近似。在烧伤后的第1～32天，与对照组同期值相比，有显著或非常显著性差异，尤其是第8天(P<0.001)，至64天时的含量，两组间的差异无统计学意义(表2)。
表2 角膜碱烧伤后MDA含量的变化(±s)
(单位：nmol/mg.pro) 天数
只数
实验组
对照组
, 百拇医药
1
5
1.516±0.152*
1.284±0.106
4
5
1.560±0.162△
1.242±0.145
8
5
1.588±0.191△
1.208±0.109
, http://www.100md.com
16
5
1.443±0.145△
1.193±0.097
32
5
1.377±0.123*
1.218±0.089
64
5
1.281±0.080
1.193±0.083
, http://www.100md.com
与对照组相比*P<0.05，△P<0.01
2.3 SOD活性的变化
在烧伤后的1～16天，实验组SOD活性较对照组同期值明显降低，其差异有显著或非常显著性。第32天时，实验组SOD活性已基本接近正常对照组水平(表3)。
表3 角膜碱烧伤后SOD活性的变化(±s)
(单位：U/mg.pro) 天数
只数
实验组
对照组
, http://www.100md.com 1
5
165.5±10.4△
189.0±12.7
4
5
163.5±14.6*
190.4±16.3
8
5
147.4±13.1△
186.9±14.7
, 百拇医药
16
5
163.4±11.9*
185.0±12.9
32
5
169.4±13.8
187.0±15.8
64
5
179.3±11.2
184.6±11.7
, http://www.100md.com
与对照组相比*P<0.05，△P<0.01
从实验组角膜组织中不同时间的NO、MDA及SOD水平分析发现，NO含量与MDA含量呈高度的正相关(R=0.936，P<0.005)，与SOD活性呈负相关(R=-0.697，P<0.05)。MDA含量与SOD活性呈负相关(R=-0.873，P<0.025)。
3 讨 论
研究表明，氧自由基参与了角膜碱烧伤后的组织损伤过程[2]。碱烧伤后角膜组织出现大量的多形核白细胞(PMNs)浸润，PMNs在吞噬过程中和被可溶性物质激活时产生呼吸爆破，氧耗量剧增，其中，90%的氧用于产生超氧阴离子自由基(.O2)[5]。NO是近年来研究十分活跃的一种新的信息分子和效应分子，是传递神经信息/调节血压以及机体防御等一系列生命活动中必不可少的生物信使，低浓度下对组织有保护作用，同时它也是一种自由基，高浓度下，它能与*O2反应生成超氧亚硝酸根离子(ONOO-)，后者及其分解产物羟自由基可引起细胞毒性损伤。由氧自由基引发的生物膜不饱和脂肪酸脂质过氧化反应的稳定产物是MDA。测定组织中的MDA含量可推测脂质过氧化反应强度和组织损伤的程度。本研究发现，碱烧伤角膜组织的SOD活性迅速降低，第8天时降低最为显著，与此同时，MDA含量逐渐升高，高峰值也是第8天，此期角膜溃疡也十分明显。SOD活性与MDA含量呈高度负相关，提示碱烧伤后PMNs产生的大量氧自由基及其引发的脂质过氧化反应产物对SOD活性有明显的抑制作用。SOD活性降低，.O2不能及时清除而与NO反应，生成ONOO及其.OH自由基等，加重对角膜组织的损伤。第32天时SOD活性基作接近正常对照组水平，但MDA含量仍显著高于对照组，并与NO含量呈高度的正相关。结果提示，SOD活性降低和NO含量增高引发脂质过氧化反应增强可能是角膜碱烧伤的机制之一。
, http://www.100md.com
参考文献
1 蔡用舒，主编.创伤眼科.北京：人民军医出版社，1998：274
2 孙旭光.自由基与角膜碱烧伤.国外医学眼科学分册，1989；13：135
3 薛蔚.一氧化氮在眼科的病理、生理效应.国外医学眼科学分册，1997；21：331
4 钱颖，吴静安.氧自由基在实验性角膜炎中的作用.中华眼科杂志，1998；34：149
5 Remond TM,Duke EJ,Colest WH,et al.Localization of comea superoxide dismutase by biochemical and histocytochemical techniques.Exp Eye Res,1984；34：369
收稿日期：1999-03-06, 百拇医药
单位：谢德雍 苏建中 咸宁医学院附属第二医院眼科，咸宁 437100；罗德生 郑红花 李映红 王汉洲 王梅娟 董加喜 咸宁医学院生物化学教研室，咸宁 437100
关键词：角膜碱烧伤；一氧化氮；丙二醛；超氧化物歧化酶
咸宁医学院学报990203 摘 要 目的：探讨一氧化氮与脂质过氧化反应在角膜碱烧伤中的作用。方法：在兔右眼角膜用2mol/L NaOH溶液烧伤60秒钟后，分别于第1、4、8、16、32及64天测量其NO和丙二醛(MDA)的含量及SOD活性，左眼为正常对照。结果：烧伤后的第1、4、8、16及32天，其NO和MDA含量显著高于对照组，至第64天接近对照组水平。烧伤后第1～16天，SOD活性较对照组显著降低，第32天已基本恢复至对照组水平。结论：角膜碱烧伤后角膜组织中NO水平升高和脂质过氧化反应增强可能是其损伤机制之一。
, 百拇医药
中图分类号 R77913
The Changes of Nitric Oxide and MDA Levels and SOD Activity
in Corneal Tissue After Corneal Burn by Alkali in Rabbits
Xie Deyong1,Shu Jianzhong1,Luo Desheng2 et al
1 Department of Ophthalmology,the Second Affiliated Hospital of Xianning Medical College,Xianning 437100
2 Department of Biochemistry,Xianning Medical College,Xianning 437100
, 百拇医药
ABSTRACT Objective To explore the effects of nitric oxide and lipid peroxidation in the cases of corneal alkali burn.Method Burn the right eye cornea of rabbits with 2 mol/L NaOH solution for 60 seconds while the left eyes as control group,and then measure the NO level,MDA level and SOD activity in cornea tissue.Results On the lst,4th,8th,16th and 32 nd days after the burning,the NO and MDA level of experimental group were markedly higher than those of control group.After 64 days,these two indexes of experimental group came near those of the control.From the lst to 16th days,SOD activity of experimental group was remarkably decreased；on the 32nd day,no noticeable difference was found in both groups and on the 64th day,it reverted to the control level.Couclusion After corneal alkali burn,it was possibly one of the machanism of injury that NO level increases and lipid peroxidation strengthens in damaged corneal tissue.
, 百拇医药
KEY WORDS Corneal alkali burn；Nitric oxide；MDA；SOD
角膜碱性化学伤是临床上常见且较严重的眼外伤之一，若不采取及时有效治疗，可反复发生无菌性角膜溃疡，甚至出现穿孔，最后形成瘢痕，致使永久性视力障碍[1]。已有报导角膜碱烧伤与自由基有关[2]。近年来研究发现，NO在眼部含量十分丰富，并与眼部炎症反应、血液循环及眼压的调节和视网膜神经元的生理、病理过程有关[3]。但NO在碱性化学伤中的作用尚未见报道，为此本文对此作了初步探讨，现报告如下。
1 材料和方法
1.1动物模型
选择健康白色家兔30只，体质量1.8～2.5kg，雌雄兼有，用放大镜检查角膜正常者用于实验。30只兔的左眼为正常对照组，右眼为实验组。用3%的戊巴比妥按1ml/kg体重经耳缘静脉给药，全麻后用1%的地卡因滴眼，开睑器充分开睑，灭菌小棉签吸去结膜囊内液体。用直径10mm圆形滤纸片浸入2 mol/L NaOH溶液中饱和后取出，轻触干滤纸以吸去多余的碱性溶液，然后快速将饱和滤纸片准确贴敷于右眼角膜上1分钟后取下，立即用灭菌生理盐水冲洗2分钟。左眼除用生理盐水取代NaOH溶液浸泡滤纸片外，其余操作同右眼。
, http://www.100md.com
1.2 NO、MDA含量及SOD活性测定
于烧伤后的第1、4、8、16、32及64天，分别随机取5只兔的对照眼和实验眼角膜组织。按文献[4]方法，用津岛AEL—200型电子分析天平称重后，冰浴下用DY—1型电动玻璃匀浆器制成10%匀浆，再用JY92—Ⅱ型超声粉碎机破碎细胞。在UV—754型分光光度计下用LOWRY氏法测定蛋白质含量。MDA含量测定用硫代巴比妥酸显色法。NO含量测定用DIAZOTIZATION反应，按军事医学科学院放射医学研究所提供的试剂盒(批号980918)说明书操作。SOD活性测定按南京聚力生物医学工程研究所提供的试剂盒 (批号981114)说明书操作。
1.3 统计学处理
实验组与对照组间NO、MDA含量及SOD活性变化采用两样本均数的t检验。对实验组ON与MDA含量及SOD活性、MDA含量与SOD活性的相关性，采用直线相关分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1NO含量的变化
烧伤后的第1～32天，实验组角膜组织中NO的含量与对照组同期相比，均有显著性差异，尤其是第4天和第8天，差异非常显著(P<0.01)，第64天时，其含量基本回复至对照组水平(表1)。
表1 角膜碱烧伤后NO含量的变化(
±s)(单位：nmol/mg.pro) 天数
只数
实验组
对照组
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5
13.5±0.51*
12.41±0.39
4
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13.56±0.64△
12.31±0.48
8
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12.22±0.41
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13.00±0.55*
12.16±0.43
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12.31±0.33
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与对照组相比*P<0.05，△P<0.01
2.2 MDA含量的变化
烧伤组角膜组织中的MDA含量变化情况与NO的变化近似。在烧伤后的第1～32天，与对照组同期值相比，有显著或非常显著性差异，尤其是第8天(P<0.001)，至64天时的含量，两组间的差异无统计学意义(表2)。
表2 角膜碱烧伤后MDA含量的变化(
±s)(单位：nmol/mg.pro) 天数
只数
实验组
对照组
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1
5
1.516±0.152*
1.284±0.106
4
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1.560±0.162△
1.242±0.145
8
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1.588±0.191△
1.208±0.109
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1.443±0.145△
1.193±0.097
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1.377±0.123*
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1.281±0.080
1.193±0.083
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与对照组相比*P<0.05，△P<0.01
2.3 SOD活性的变化
在烧伤后的1～16天，实验组SOD活性较对照组同期值明显降低，其差异有显著或非常显著性。第32天时，实验组SOD活性已基本接近正常对照组水平(表3)。
表3 角膜碱烧伤后SOD活性的变化(
±s)(单位：U/mg.pro) 天数
只数
实验组
对照组
, http://www.100md.com 1
5
165.5±10.4△
189.0±12.7
4
5
163.5±14.6*
190.4±16.3
8
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147.4±13.1△
186.9±14.7
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163.4±11.9*
185.0±12.9
32
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169.4±13.8
187.0±15.8
64
5
179.3±11.2
184.6±11.7
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与对照组相比*P<0.05，△P<0.01
从实验组角膜组织中不同时间的NO、MDA及SOD水平分析发现，NO含量与MDA含量呈高度的正相关(R=0.936，P<0.005)，与SOD活性呈负相关(R=-0.697，P<0.05)。MDA含量与SOD活性呈负相关(R=-0.873，P<0.025)。
3 讨 论
研究表明，氧自由基参与了角膜碱烧伤后的组织损伤过程[2]。碱烧伤后角膜组织出现大量的多形核白细胞(PMNs)浸润，PMNs在吞噬过程中和被可溶性物质激活时产生呼吸爆破，氧耗量剧增，其中，90%的氧用于产生超氧阴离子自由基(.O2)[5]。NO是近年来研究十分活跃的一种新的信息分子和效应分子，是传递神经信息/调节血压以及机体防御等一系列生命活动中必不可少的生物信使，低浓度下对组织有保护作用，同时它也是一种自由基，高浓度下，它能与*O2反应生成超氧亚硝酸根离子(ONOO-)，后者及其分解产物羟自由基可引起细胞毒性损伤。由氧自由基引发的生物膜不饱和脂肪酸脂质过氧化反应的稳定产物是MDA。测定组织中的MDA含量可推测脂质过氧化反应强度和组织损伤的程度。本研究发现，碱烧伤角膜组织的SOD活性迅速降低，第8天时降低最为显著，与此同时，MDA含量逐渐升高，高峰值也是第8天，此期角膜溃疡也十分明显。SOD活性与MDA含量呈高度负相关，提示碱烧伤后PMNs产生的大量氧自由基及其引发的脂质过氧化反应产物对SOD活性有明显的抑制作用。SOD活性降低，.O2不能及时清除而与NO反应，生成ONOO及其.OH自由基等，加重对角膜组织的损伤。第32天时SOD活性基作接近正常对照组水平，但MDA含量仍显著高于对照组，并与NO含量呈高度的正相关。结果提示，SOD活性降低和NO含量增高引发脂质过氧化反应增强可能是角膜碱烧伤的机制之一。
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参考文献
1 蔡用舒，主编.创伤眼科.北京：人民军医出版社，1998：274
2 孙旭光.自由基与角膜碱烧伤.国外医学眼科学分册，1989；13：135
3 薛蔚.一氧化氮在眼科的病理、生理效应.国外医学眼科学分册，1997；21：331
4 钱颖，吴静安.氧自由基在实验性角膜炎中的作用.中华眼科杂志，1998；34：149
5 Remond TM,Duke EJ,Colest WH,et al.Localization of comea superoxide dismutase by biochemical and histocytochemical techniques.Exp Eye Res,1984；34：369
收稿日期：1999-03-06, 百拇医药