大鼠中枢神经毁损方法的研究与比较
作者：熊革 罗永湘
单位：同济医科大学附属同济医院外科，武汉 430030
关键词：大鼠；中枢神经；损伤；实验研究
同济医科大学学报990222 摘要 用6种方法毁损大鼠中枢神经，并观察其表现和后果。运动皮质毁损后大鼠表现为软瘫，短期内步态恢复；用无水乙醇毁损运动皮质的大鼠均于术后1 d内死亡；用青霉素毁损运动皮质的大鼠均在术后4 h内持续抽搐、死亡；大脑中动脉栓塞后的大鼠术后有步态异常，但术后死亡率较高；电毁损锥体束的大鼠术后一周内有明显步态异常，且死亡率较低。提示电毁损锥体束可作为制作大鼠痉挛性瘫痪模型的一种优选方案。
中图法分类号 Q959.837， R322.81
Comparason and Study of Rat CNS Destroying Methods
, 百拇医药
Xiong Ge, Luo Yongxiang
Department of Orthopedics, Tongji Hospital， Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract To select a simple and reliable method for the establishment of the rat spastic palsy model, 36 Wistar rats were divided into 6 groups which were subjected to 6 different central nervous system (CNS) destroying methods respectively. Signs were observed during and after operation. The results demonstrated the rats with motor center destruction showed flaccid paralysis which recovered within a short time. Those with motor center destructon with alcohol died 1 day after operation. The rats with motor center destruction with penicillin became convulsive and finally died wihtin 4 h after operation. The rats with blockage of middle cerebral artery were also paralyzed, but the mortality was rather high. Only the rats with electrolytic damage of pyramidal tract were paralyzed with low mortality. It was concluded that the electrolytic damage of pyramidal tract is a preferred method for establishment of the rat central spastic palsy model.
, 百拇医药
Key words rat; CNS; destroying method; experimental research
随着对痉挛性脑瘫研究的进展，建立一个可靠的动物模型已成为目前急需解决的问题[1]。然而，中枢神经系统结构复杂，其毁损方法也各不相同。本文通过采用机械损伤，药物损伤，电离损伤及动脉栓塞等方法，对运动皮质及锥体束进行定位毁损，旨在筛选一种操作简单而技术可靠的方法制作大鼠痉挛性瘫痪的模型。
1 材料和方法
1.1 动物分组、手术材料与方法
选用清洁级Wistar大白鼠36只，体重200～250 g，雌雄不拘。随机分为6组，每组6只。以30 mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉，无菌手术操作，术后雌雄分笼喂养，定期观察。大鼠颅脑定位采用江湾Ⅰ型C立体定位器。电离毁损采用WQ9E的痛阈测量仪。
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第1组：切除左侧运动皮质。参考曹氏方法[2]，纵行切开颅顶皮肤，于矢状缝左侧2 mm，冠状缝前1 mm至后2 mm处，咬开颅骨板4 mm×4 mm，分辨其运动皮质，手术切除此区皮质3 mm×3 mm×2 mm，关闭切口。
第2组：电离毁损运动皮质[3]。采用de Groot坐标系统将实验大鼠的头部固定于立体定位器上，如上法显露运动皮质，将阳极针电极(直径0.5 mm)插入皮质下3 mm，阴极接鼠尾，以2 mA直流电通电作用8 s，拔出电极，关闭切口。
第3组：电离毁损锥体束。如上法固定大鼠头部，切开颅顶皮肤，于前囟后6.6 mm， 向左旁开矢状缝1.0 mm，颅骨钻孔，将阳极针电极插入9.7 mm，阴极接鼠尾，以2 mA直流电通电作用8 s，拔出电极，关闭切口。
第4组：用无水乙醇毁损运动皮质[4]。如第一组显露运动皮质，用微量注射器插入皮质下2 mm，注入无水乙醇10 μl，拔出注射器，关闭切口。
, 百拇医药
第5组：用青霉素毁损运动皮质[5]。如第一组显露运动皮质，用微量注射器插入皮质下2 mm，注入青霉素溶液10 μl (400 U)，拔出注射器，关闭切口。
第6组：大脑中动脉阻断。参考严氏方法[6]，于大鼠眼眶后切开皮肤，切除部分颞肌以暴露颞骨，并作一个约3 mm×4 mm的骨窗，轻抬脑，可见横过嗅束的大脑中动脉向侧上方走行，用电凝器将大脑中动脉凝闭，如引起动脉破裂出血，以止血海绵局部轻压止血。
1.2 观察指标
术中观察实验大鼠的反应。术后持续观察实验大鼠的运动功能及后果。
2 结 果
各组实验大鼠麻醉满意，手术顺利，无意外死亡，术后伤口Ⅰ期愈合，未见感染。各组大鼠的术中反应、术后运动功能及后果详见附表。
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附表 实验大鼠术中反应、术后的运动功能及后果 组别
术中反应
苏醒时间
术后运动功能
后 果
1
——
8～12 h
24 h双后肢拖行；48 h右后肢轻度跛行
全部长期存活
72 h无明显步态异常
2
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当电流>0.5 mA时
5～8 h
24 h腰背部隆起，无跛行；48 h活动正常
全部长期存活
大鼠抽搐，扭动
3
当电流>0.5 mA时
2～5 h
24 h右侧偏瘫，不饮不食；48 h 2只大鼠
全部长期存活
大鼠抽搐，扭动
, http://www.100md.com 只能向右侧转圈；1周内偏瘫无改善
4
——
未苏醒
——
术后16～20 h全部死亡
5
——
未苏醒
术后10～15 min开始全身性持续抽搐，术后1.5～2.5h
开始时剧烈，此后逐渐减弱
全部死亡
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6
术中出血较多
8～12 h
24 h活动少，偏瘫，站立不稳；48 h偏瘫，步态
术后1 d死亡2只，蹒跚，共济失调明显；1周内偏瘫无明显改善
术后2 d死亡1只
由附表中不难看出，第4、5、6组实验大鼠的死亡率较高，不便于长期观察其运动功能的改变，而第1、2组的实验大鼠虽能长期存活，但由于肢体瘫痪不是较轻，就是表现为软瘫，且步态很快(多在3 d内)恢复正常，故也不便于进一步研究。第3组大鼠不仅能长期存活，而且偏瘫表现可持续至少1周，系一种制作模型的较好的方法。3 讨 论
中枢神经系统的毁损方法很多，常用的损伤技术有机械损伤，注射非选性毒素，大脑血管系的改变，放射性损伤，超声波损伤，温度损伤，电离损伤等[4，7]。但对特定结构的毁损，则方法的选择对实验结果有很大影响。
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本组实验中采用了无水乙醇进行毁损，因其具有脂溶性，故对脑组织损伤范围远远超过注射点局部，本应是模拟广泛性脑损伤的一种较好的方法，但也正是由于其损伤范围不容易控制[4]，且术后抗水肿，脱水手段难以实施，才导致动物死亡率很高。
青霉素对神经组织的损伤作用早有报道，而且将其用于制作癫痫模型的研究已较公认[5]，本组实验将其用于毁损运动皮质，结果导致了实验大鼠全身癫痫样抽搐，最终致死。这也提示青霉素对中枢神经系统损伤的表现较特异，难以用于制作慢性动物模型。
用大脑中动脉阻断的方法制作脑梗塞的模型已较成熟[6]，但由于此动脉营养范围广泛，栓塞后不仅累及运动系统，而且累及感觉和共济平衡等功能[8，9]。另外，此法术中出血较多，术后死亡率较高，使其应用受到限制。
大鼠的神经系统与人类有所不同，作为低等动物，其中枢的代偿恢复能力很强，且运动皮质表现为双侧支配，故单侧损伤其运动皮质，仅能导致较短时期内的软瘫。这与其他文献报道的结果类似[2，10]。但如双侧损伤其运动皮质，则可能导致其肢体运动障碍而不能取食、饮水，给继续研究带来困难。
, 百拇医药
电离损伤即用金属电极通过直流电在中枢神经系统内造成损伤，这是多年来最常用的实验手段之一。其机制是离子流能诱发细胞发生不可逆性代谢改变，最终导致细胞死亡。由阳极电流造成的损伤，无论在损伤的大小及形状上均易于重复[4]。而且损
伤的程度可以通过电流强度及通电时间进行调节。本实验采用2 mA直流电作用8 s，不仅在行为上有偏瘫表现，而且通过组织学研究发现其锥体束连续中断，呈不可逆损伤表现[11]。
立体定向仪早在1908年就已问世，它已成为近代神经科学实验的重要设备之一，应用此设备并结合立体定向图谱可以较精确地进行深部脑组织的损伤定位[4，12]。故结合立体定向和电离损伤技术对单侧锥体束进行定位毁损，不仅方法可靠，操作简单，重复性好，死亡率低，而且取得了良好的效果。
通过对多种神经毁损方法的研究与比较，筛选出一种制作大鼠中枢性瘫痪模型的优选方案，即应用大鼠脑立体定向技术对单侧锥体束实施电离损伤。此法操作简单，重复性好，实验大鼠死亡率低。
, 百拇医药
作者简介：熊 革，男，1970年生，主治医师。现址：北京积水潭医院手外科，邮政编码 100035
参考文献
1 Wright J, Rang M. The spastic mouse. And the research for an animal model of spasticity in human beings. Clin Orthop, 1990, 253: 12
2 曹家义. 大鼠胎脑组织移植治疗脑皮质损伤性瘫痪. 中华器官移植杂志，1991，8(2)： 49
3 黄正一，蒋正揆. 动物学实验方法. 上海：上海科学技术出版社，1983. 179～191
4 杜卓民编译. 神经解剖学传导通路追踪法. 北京： 科学出版社， 1987. 24～28
, http://www.100md.com
5 解学孔主编. 癫痫病学. 北京：人民卫生出版社， 1995. 227～232
6 严徽瑾，赵惠敏，罗 兰等. 大鼠局灶性脑缺血模型的研究. 中华神经精神科杂志，1988，2(1)： 3～5
7 韩济生主编. 神经科学纲要. 北京： 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993. 8～11
8 张培林主编. 神经解剖学. 北京：人民卫生出版社，1987. 512～521
9 李东亮，王建芬，沈 红等. 局部脑缺血-再灌注大鼠行为和运动功能的动态观察. 中国应用生理学杂志，1995，11(3)： 276
10 韩祖斌，李承球，孙贤敏. 大脑瘫的矫形外科治疗. 中华外科杂志，1990，28(4)： 246
11 熊 革，罗永湘. 大鼠痉挛性瘫痪模型的研究. 中华实验外科杂志， 1998， 15(6)： 284
12 Fifkova E, Marsala J. Stereotaxic atlas for the rat. In: Bures J, Petran N, Zachar J eds. Electrophysio-logical methods in biological research. New York: Academic Press, 1960. 444～447
收稿日期：1998-04-22, 百拇医药
单位：同济医科大学附属同济医院外科，武汉 430030
关键词：大鼠；中枢神经；损伤；实验研究
同济医科大学学报990222 摘要 用6种方法毁损大鼠中枢神经，并观察其表现和后果。运动皮质毁损后大鼠表现为软瘫，短期内步态恢复；用无水乙醇毁损运动皮质的大鼠均于术后1 d内死亡；用青霉素毁损运动皮质的大鼠均在术后4 h内持续抽搐、死亡；大脑中动脉栓塞后的大鼠术后有步态异常，但术后死亡率较高；电毁损锥体束的大鼠术后一周内有明显步态异常，且死亡率较低。提示电毁损锥体束可作为制作大鼠痉挛性瘫痪模型的一种优选方案。
中图法分类号 Q959.837， R322.81
Comparason and Study of Rat CNS Destroying Methods
, 百拇医药
Xiong Ge, Luo Yongxiang
Department of Orthopedics, Tongji Hospital， Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract To select a simple and reliable method for the establishment of the rat spastic palsy model, 36 Wistar rats were divided into 6 groups which were subjected to 6 different central nervous system (CNS) destroying methods respectively. Signs were observed during and after operation. The results demonstrated the rats with motor center destruction showed flaccid paralysis which recovered within a short time. Those with motor center destructon with alcohol died 1 day after operation. The rats with motor center destruction with penicillin became convulsive and finally died wihtin 4 h after operation. The rats with blockage of middle cerebral artery were also paralyzed, but the mortality was rather high. Only the rats with electrolytic damage of pyramidal tract were paralyzed with low mortality. It was concluded that the electrolytic damage of pyramidal tract is a preferred method for establishment of the rat central spastic palsy model.
, 百拇医药
Key words rat; CNS; destroying method; experimental research
随着对痉挛性脑瘫研究的进展，建立一个可靠的动物模型已成为目前急需解决的问题[1]。然而，中枢神经系统结构复杂，其毁损方法也各不相同。本文通过采用机械损伤，药物损伤，电离损伤及动脉栓塞等方法，对运动皮质及锥体束进行定位毁损，旨在筛选一种操作简单而技术可靠的方法制作大鼠痉挛性瘫痪的模型。
1 材料和方法
1.1 动物分组、手术材料与方法
选用清洁级Wistar大白鼠36只，体重200～250 g，雌雄不拘。随机分为6组，每组6只。以30 mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉，无菌手术操作，术后雌雄分笼喂养，定期观察。大鼠颅脑定位采用江湾Ⅰ型C立体定位器。电离毁损采用WQ9E的痛阈测量仪。
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第1组：切除左侧运动皮质。参考曹氏方法[2]，纵行切开颅顶皮肤，于矢状缝左侧2 mm，冠状缝前1 mm至后2 mm处，咬开颅骨板4 mm×4 mm，分辨其运动皮质，手术切除此区皮质3 mm×3 mm×2 mm，关闭切口。
第2组：电离毁损运动皮质[3]。采用de Groot坐标系统将实验大鼠的头部固定于立体定位器上，如上法显露运动皮质，将阳极针电极(直径0.5 mm)插入皮质下3 mm，阴极接鼠尾，以2 mA直流电通电作用8 s，拔出电极，关闭切口。
第3组：电离毁损锥体束。如上法固定大鼠头部，切开颅顶皮肤，于前囟后6.6 mm， 向左旁开矢状缝1.0 mm，颅骨钻孔，将阳极针电极插入9.7 mm，阴极接鼠尾，以2 mA直流电通电作用8 s，拔出电极，关闭切口。
第4组：用无水乙醇毁损运动皮质[4]。如第一组显露运动皮质，用微量注射器插入皮质下2 mm，注入无水乙醇10 μl，拔出注射器，关闭切口。
, 百拇医药
第5组：用青霉素毁损运动皮质[5]。如第一组显露运动皮质，用微量注射器插入皮质下2 mm，注入青霉素溶液10 μl (400 U)，拔出注射器，关闭切口。
第6组：大脑中动脉阻断。参考严氏方法[6]，于大鼠眼眶后切开皮肤，切除部分颞肌以暴露颞骨，并作一个约3 mm×4 mm的骨窗，轻抬脑，可见横过嗅束的大脑中动脉向侧上方走行，用电凝器将大脑中动脉凝闭，如引起动脉破裂出血，以止血海绵局部轻压止血。
1.2 观察指标
术中观察实验大鼠的反应。术后持续观察实验大鼠的运动功能及后果。
2 结 果
各组实验大鼠麻醉满意，手术顺利，无意外死亡，术后伤口Ⅰ期愈合，未见感染。各组大鼠的术中反应、术后运动功能及后果详见附表。
, http://www.100md.com
附表 实验大鼠术中反应、术后的运动功能及后果 组别
术中反应
苏醒时间
术后运动功能
后 果
1
——
8～12 h
24 h双后肢拖行；48 h右后肢轻度跛行
全部长期存活
72 h无明显步态异常
2
, http://www.100md.com
当电流>0.5 mA时
5～8 h
24 h腰背部隆起，无跛行；48 h活动正常
全部长期存活
大鼠抽搐，扭动
3
当电流>0.5 mA时
2～5 h
24 h右侧偏瘫，不饮不食；48 h 2只大鼠
全部长期存活
大鼠抽搐，扭动
, http://www.100md.com 只能向右侧转圈；1周内偏瘫无改善
4
——
未苏醒
——
术后16～20 h全部死亡
5
——
未苏醒
术后10～15 min开始全身性持续抽搐，术后1.5～2.5h
开始时剧烈，此后逐渐减弱
全部死亡
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6
术中出血较多
8～12 h
24 h活动少，偏瘫，站立不稳；48 h偏瘫，步态
术后1 d死亡2只，蹒跚，共济失调明显；1周内偏瘫无明显改善
术后2 d死亡1只
由附表中不难看出，第4、5、6组实验大鼠的死亡率较高，不便于长期观察其运动功能的改变，而第1、2组的实验大鼠虽能长期存活，但由于肢体瘫痪不是较轻，就是表现为软瘫，且步态很快(多在3 d内)恢复正常，故也不便于进一步研究。第3组大鼠不仅能长期存活，而且偏瘫表现可持续至少1周，系一种制作模型的较好的方法。3 讨 论
中枢神经系统的毁损方法很多，常用的损伤技术有机械损伤，注射非选性毒素，大脑血管系的改变，放射性损伤，超声波损伤，温度损伤，电离损伤等[4，7]。但对特定结构的毁损，则方法的选择对实验结果有很大影响。
, http://www.100md.com
本组实验中采用了无水乙醇进行毁损，因其具有脂溶性，故对脑组织损伤范围远远超过注射点局部，本应是模拟广泛性脑损伤的一种较好的方法，但也正是由于其损伤范围不容易控制[4]，且术后抗水肿，脱水手段难以实施，才导致动物死亡率很高。
青霉素对神经组织的损伤作用早有报道，而且将其用于制作癫痫模型的研究已较公认[5]，本组实验将其用于毁损运动皮质，结果导致了实验大鼠全身癫痫样抽搐，最终致死。这也提示青霉素对中枢神经系统损伤的表现较特异，难以用于制作慢性动物模型。
用大脑中动脉阻断的方法制作脑梗塞的模型已较成熟[6]，但由于此动脉营养范围广泛，栓塞后不仅累及运动系统，而且累及感觉和共济平衡等功能[8，9]。另外，此法术中出血较多，术后死亡率较高，使其应用受到限制。
大鼠的神经系统与人类有所不同，作为低等动物，其中枢的代偿恢复能力很强，且运动皮质表现为双侧支配，故单侧损伤其运动皮质，仅能导致较短时期内的软瘫。这与其他文献报道的结果类似[2，10]。但如双侧损伤其运动皮质，则可能导致其肢体运动障碍而不能取食、饮水，给继续研究带来困难。
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电离损伤即用金属电极通过直流电在中枢神经系统内造成损伤，这是多年来最常用的实验手段之一。其机制是离子流能诱发细胞发生不可逆性代谢改变，最终导致细胞死亡。由阳极电流造成的损伤，无论在损伤的大小及形状上均易于重复[4]。而且损
伤的程度可以通过电流强度及通电时间进行调节。本实验采用2 mA直流电作用8 s，不仅在行为上有偏瘫表现，而且通过组织学研究发现其锥体束连续中断，呈不可逆损伤表现[11]。
立体定向仪早在1908年就已问世，它已成为近代神经科学实验的重要设备之一，应用此设备并结合立体定向图谱可以较精确地进行深部脑组织的损伤定位[4，12]。故结合立体定向和电离损伤技术对单侧锥体束进行定位毁损，不仅方法可靠，操作简单，重复性好，死亡率低，而且取得了良好的效果。
通过对多种神经毁损方法的研究与比较，筛选出一种制作大鼠中枢性瘫痪模型的优选方案，即应用大鼠脑立体定向技术对单侧锥体束实施电离损伤。此法操作简单，重复性好，实验大鼠死亡率低。
, 百拇医药
作者简介：熊 革，男，1970年生，主治医师。现址：北京积水潭医院手外科，邮政编码 100035
参考文献
1 Wright J, Rang M. The spastic mouse. And the research for an animal model of spasticity in human beings. Clin Orthop, 1990, 253: 12
2 曹家义. 大鼠胎脑组织移植治疗脑皮质损伤性瘫痪. 中华器官移植杂志，1991，8(2)： 49
3 黄正一，蒋正揆. 动物学实验方法. 上海：上海科学技术出版社，1983. 179～191
4 杜卓民编译. 神经解剖学传导通路追踪法. 北京： 科学出版社， 1987. 24～28
, http://www.100md.com
5 解学孔主编. 癫痫病学. 北京：人民卫生出版社， 1995. 227～232
6 严徽瑾，赵惠敏，罗 兰等. 大鼠局灶性脑缺血模型的研究. 中华神经精神科杂志，1988，2(1)： 3～5
7 韩济生主编. 神经科学纲要. 北京： 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993. 8～11
8 张培林主编. 神经解剖学. 北京：人民卫生出版社，1987. 512～521
9 李东亮，王建芬，沈 红等. 局部脑缺血-再灌注大鼠行为和运动功能的动态观察. 中国应用生理学杂志，1995，11(3)： 276
10 韩祖斌，李承球，孙贤敏. 大脑瘫的矫形外科治疗. 中华外科杂志，1990，28(4)： 246
11 熊 革，罗永湘. 大鼠痉挛性瘫痪模型的研究. 中华实验外科杂志， 1998， 15(6)： 284
12 Fifkova E, Marsala J. Stereotaxic atlas for the rat. In: Bures J, Petran N, Zachar J eds. Electrophysio-logical methods in biological research. New York: Academic Press, 1960. 444～447
收稿日期：1998-04-22, 百拇医药