幽门螺杆菌感染胃粘膜的PCNA和HSP70表达
作者：任宏宇 易粹琼
单位：同济医科大学附属协和医院消化科， 武汉 430022
关键词：幽门螺杆菌；胃炎；胃腺癌；增殖细胞核抗原；热休克蛋白70
同济医科大学学报990217
摘要 为探讨幽门螺杆菌(Hp)在胃癌发生过程中的作用机制, 采用了免疫组织化学和Northern-blot方法, 对35例慢性胃炎和2 0 例胃腺癌患者进行了对比观察，其中24/35 例慢性胃炎检出Hp，另11/20 例胃腺癌为Hp阳性。Hp相关慢性胃炎者增殖细胞核抗原(PCNA) 标计指数(LI) 为20.6±4.7,高于Hp阴性慢性胃炎LI(11.3±5.2) (P<0.05); Hp阳性胃腺癌组织HSP70 表达水平低于Hp阴性胃腺癌者，并低于Hp阳性的慢性胃炎者。结果提示,Hp感染的存在，可能具有促使慢性胃炎者胃粘膜增生, 降低胃腺癌HSP70表达的作用。
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中图法分类号 R378.2, R573.3, R735
Expression of PCNA and HSP70 in Patients with Hp Infected Gastric Mucosa
Ren Hongyu, Yi Cuiqiong,
Departmentt of Gastroenterology, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Abstract By using immunohistochemical and Northern-blot methods, comparative observation was performed on 35 cases of chronic gastritis, and 20 cases of gastric adenocarcinoma to investigate the mechnism that helicobater pyloric (Hp) played the role in the process of gastric carcinogenesis. The results showed that positive Hp was detected in the 24/35 cases of chronic gastritis and 11/20 cases of gastric adenocarcinoma. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) positive cell labelling index(LI) in Hp associated chronic gastritis (LI=20.6±4.7) was higher than in Hp negative chronic gastrits (LI=11.3±5.2) (P<0.05). HSP70 expression in gastric adenocarcinoma tissue in Hp infected patients was lower than in Hp non-infected gastric cancer, as well as lower than HP infected chronic gastritis. The results suggested that Hp infection may enhance gastric cell proliferation, and decrease the expression of HSP70 in gastric adenocarcinoma.
, 百拇医药
Key words helicobacter pylori; chronic gastritis; gastric adenocarcinoma; proliferating cell nuclear antigen; heat shock protein 70
幽门螺杆菌(Hp)是专嗜人胃粘膜的致病菌，其感染在胃十二指肠疾病的演变过程中，所产生的潜在的致癌机制尚未明确。肿瘤的典型组织学特点为细胞的恶性增生, 细胞的增殖动力学研究表明, 细胞内的某些蛋白质和细胞因子对细胞生长及分化起着重要的调节作用, 其中增殖细胞核抗原(PCNA)作为一项评价细胞增殖状态的指标, 被广泛用于肿瘤的临床研究。热休克蛋白(HSP)能保护细胞，抵御损伤因子，具有抗肿瘤和抗感染免疫的重要作用，可与癌基因、抑癌基因相互作用，调节细胞增殖。[1]本研究试图通过观察Hp 相关慢性胃炎、胃腺癌的PCNA 及HSP70 mRNA 的表达，以认识Hp 的可能致癌作用方式。
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1 材料和方法
1.1 标本来源
20例胃腺癌标本为手术切取的胃腺癌和癌周组织(距癌组织2 cm)，对照组非肿瘤性胃组织经胃镜取自35例慢性胃炎和1例胃溃疡患者，均经病理诊断证实。
1.2 Hp感染的检测
采用尿素酶试纸法和Giemsa组织染色方法进行，两方法均阳性即判断该标本为Hp阳性。
1.3 免疫组织化学检测
鼠抗PCNA (PC10)、p53(Do-1)单克隆抗体及链霉亲生物素-过氧化酶(S-P)试剂盒均为Santa Cruz Biotech.Inc产品，购自北京中山生物技术公司。以已知阳性片和PBS作阳、阴性对照。
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1.4 HSP70表达检测
1.4.1 组织RNA提取:液氮冻存胃粘膜组织标本500 mg 研磨后，以异硫氰酸胍一步法提取组织总RNA ; 将从4 例Hp(+)胃腺癌、2例Hp(-)胃腺癌和Hp(+)胃炎、胃溃疡各1例组织获得的RNA样品经聚乙二醛和二甲亚砜(DMSO)变性，点至琼脂糖凝胶作RNA电泳, 再转印到硝酸纤维素膜上, 干燥备用。经重复试验获得相同结果。
1.4.2 探针的制备:质粒PUC709(HSP70)，由Dr. Hickey(University of Nevada, USA)惠赠。该质粒经扩增、纯化和酶切片段回收，获得片段大小约为2.6 kb的DNA，以32P-dCTP(中国原子能科研院同位素所)作随机引物法记。
1.4.3 Northern印迹:先以20 mmol/L Tris.HCl 清洗RNA膜，并浸湿于6×SSC 溶液，再将该膜与预杂交液(5×Denhardts液，5×SSC, 0.05 g/L SDS, 5 g/L去离子甲酰胺)混放于杂交袋内，68 ℃预杂交4 h ，再加入已知变性的HSP70/cDNA 探针, 过夜，用含0.01 g/L SDS 不同浓度SSC液洗膜数次，-20 ℃放射自显影7 d。
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1.4.4 杂交结果分析: 使用色谱扫描仪(CS-930, Shimada Co.)扫描杂交条带行相对定量。
1.5 结果分析
PCNA 阳性细胞计数以阳性细胞标记指数(Labeling Index, LI)评价[2],即LI=PCNA 阳性细胞/计数细胞×100 % ，是于中倍镜下任选连续视野计数1 000个上皮细胞核着色阳性细胞所占百分比。
统计学处理采用χ2 和Students t检验。
2 结 果
2.1 Hp 感染状况的检测
经尿素酶试纸法和Giemsa染色两方法检测，发现从慢性胃炎者胃窦粘膜检出Hp 的阳性率为68.6 % , 胃腺癌Hp检出率为55.0 % ，癌组织中未发现Hp 感染，均从癌旁组织或其他非癌部位的
, 百拇医药
正常粘膜中检出, 见表1。
表1 Hp感染状况的检测 病理
例数
(n)
Hp(+)
Hp(-)
n
%
n
%
慢性胃炎
35
24
, http://www.100md.com
68.8
11
31.4
胃腺癌
20
11
55.0*
9
45.0
与慢性胃炎比较 *P<0.05
2.2 PCNA 的表达
2.2.1 染色特点：PCNA 染色呈棕色颗粒，定位于细胞核。PCNA 在正常胃粘膜的表达主要是胃腺腔部细胞。
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2.2.2 胃粘膜PCNA阳性细胞标记指数分析：结果见表2。
表2 PCNA 阳性细胞标记指数分析
n
PCNA(+)
LI%(
±s)
慢性胃炎
Hp(+)
24
20
20.6±4.7
Hp(-)
, 百拇医药
11
7
11.3±5.2*
胃腺癌
Hp(+)
11
11
68.3±8.5**
Hp(-)
9
9
54.6±7.1
, http://www.100md.com 与慢性胃炎Hp(+)组比较 *P<0.05 **P<0.012.3 HSP70表达及与Hp 感染间的关系
Hp 阳性胃腺癌组织HSP70表达水平低于Hp 阴性胃腺癌。Hp 感染的胃粘膜疾病中，HSP70表达水平以扫描值相对定量由低到高依次为胃腺癌、慢性胃炎和胃溃疡。
3 讨 论
胃癌的发生原因涉及饮食、环境、遗传等，是一个多因素、多步骤的结局。自认识Hp 在胃肠的致病作用以来，大量流行病学资料证明, Hp 感染与胃腺癌密切相关，尤其是肠型胃癌[3]。本研究检测了20例胃腺癌Hp 的感染状况，发现Hp 感染率为55 % (11/20)，低于对照组68.6 %。 Forman[4]认为胃癌发生后，肿瘤部位及生理学、组织学性状改变，使得Hp 失去了生存条件，该结果支持这种观点，同时也可以解释Hp 多在癌周组织内检出，而且胃癌患者的Hp 阳性率相对较低的原因。
, 百拇医药
PCNA为36 ku的核蛋白，又称为周期蛋白(Cyclin)，是DNA多聚酶δ的一种助因子。静止细胞含量很少，G1晚期开始增多，S期达到高峰，G2期、M期下降，是评价细胞增殖状态的重要指标[5]。通常慢性胃炎在临床上被作为潜在的癌前疾病，该研究对Hp 阳性慢性胃炎的PCNA 阳性细胞标记指数进行了分析，显示其LI(20.6±4.7)高于Hp 阴性者, 说明Hp 相关慢性胃炎的粘膜上皮具有较高增生水平，提示Hp感染对胃炎粘膜的增殖现象有一定的作用。Lynch等[6]以同样方法观察Hp相关胃炎者, 在根除Hp 前后胃粘膜的增殖状况，发现Hp 根除后胃粘膜细胞增水平恢复正常，认为高的细胞增生水平增加了细胞基因受损的机会，清除Hp 可减少胃癌发生的危险性。HSP70为具有自稳和保护作用的蛋白，本研究以Northern-blot 检测HSP70 RNA的表达, 作扫描相对定量发现HSP70在Hp阳性胃腺癌组织中表达低于Hp阴性胃腺癌者，且低于本研究中的Hp感染相关的慢性胃炎和胃溃疡,初步提示Hp感染可致胃腺癌HSP70表达降低，可能使胃腺癌组织的HSP70抗肿瘤作用降低。Hp致HSP70减少的机制尚不清楚，我们推测可能为胃癌部位感染的Hp 消失，而降低了HSP 表达刺激物的强度所致。由此看来，Hp相关慢性胃炎具有胃粘膜细胞高增殖状态，并有抗肿瘤作用降低，因此Hp 感染是胃癌形成机制中的一种重要因素。
, 百拇医药
作者简介：任宏宇, 男, 1967年生,博士, 主治医师
参考文献
1 Agoff S N, Hou J, Lizer D I H et al. Regulation of human HSP70 promoter by p53. Science, 1993,259:84
2 Kolodziejczyk K P, Yao T, Oya M et al. Long term follow up study of patients with gastric adenomas with malignant tranformation: A immunohistochemical and histochemical analysis. Cancer, 1994,74: 2 896
3 The Eurogast Study Group. An international assocition between helicobacter pylori infection and gastric cancer. Lancet ,1993, 341:1 359
, 百拇医药
4 Forman D, Dewell D G, Fullerton F et al. Association between infection with helicobacter pylori and risk of gastric cancer: evidence from a prospective investigation. Br Med J, 1991,302: 1 302
5 Ohyama S,Yonemura Y,Miyazaki I et al.Proliferative activity and malignancy in human gastric cancers:signifinace of the proliferation rate and its clinical application. Cancer, 1992, 69 :314
6 Lynch DAF,Mapstone NP,Clarke AT et al.Cell proliferation in helicobacter pylori associated gastritis and the effect of eradication therapy. Gut, 1995, 36:346
收稿日期：1998-06-03, 百拇医药
单位：同济医科大学附属协和医院消化科， 武汉 430022
关键词：幽门螺杆菌；胃炎；胃腺癌；增殖细胞核抗原；热休克蛋白70
同济医科大学学报990217
摘要 为探讨幽门螺杆菌(Hp)在胃癌发生过程中的作用机制, 采用了免疫组织化学和Northern-blot方法, 对35例慢性胃炎和2 0 例胃腺癌患者进行了对比观察，其中24/35 例慢性胃炎检出Hp，另11/20 例胃腺癌为Hp阳性。Hp相关慢性胃炎者增殖细胞核抗原(PCNA) 标计指数(LI) 为20.6±4.7,高于Hp阴性慢性胃炎LI(11.3±5.2) (P<0.05); Hp阳性胃腺癌组织HSP70 表达水平低于Hp阴性胃腺癌者，并低于Hp阳性的慢性胃炎者。结果提示,Hp感染的存在，可能具有促使慢性胃炎者胃粘膜增生, 降低胃腺癌HSP70表达的作用。
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中图法分类号 R378.2, R573.3, R735
Expression of PCNA and HSP70 in Patients with Hp Infected Gastric Mucosa
Ren Hongyu, Yi Cuiqiong,
Departmentt of Gastroenterology, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Abstract By using immunohistochemical and Northern-blot methods, comparative observation was performed on 35 cases of chronic gastritis, and 20 cases of gastric adenocarcinoma to investigate the mechnism that helicobater pyloric (Hp) played the role in the process of gastric carcinogenesis. The results showed that positive Hp was detected in the 24/35 cases of chronic gastritis and 11/20 cases of gastric adenocarcinoma. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) positive cell labelling index(LI) in Hp associated chronic gastritis (LI=20.6±4.7) was higher than in Hp negative chronic gastrits (LI=11.3±5.2) (P<0.05). HSP70 expression in gastric adenocarcinoma tissue in Hp infected patients was lower than in Hp non-infected gastric cancer, as well as lower than HP infected chronic gastritis. The results suggested that Hp infection may enhance gastric cell proliferation, and decrease the expression of HSP70 in gastric adenocarcinoma.
, 百拇医药
Key words helicobacter pylori; chronic gastritis; gastric adenocarcinoma; proliferating cell nuclear antigen; heat shock protein 70
幽门螺杆菌(Hp)是专嗜人胃粘膜的致病菌，其感染在胃十二指肠疾病的演变过程中，所产生的潜在的致癌机制尚未明确。肿瘤的典型组织学特点为细胞的恶性增生, 细胞的增殖动力学研究表明, 细胞内的某些蛋白质和细胞因子对细胞生长及分化起着重要的调节作用, 其中增殖细胞核抗原(PCNA)作为一项评价细胞增殖状态的指标, 被广泛用于肿瘤的临床研究。热休克蛋白(HSP)能保护细胞，抵御损伤因子，具有抗肿瘤和抗感染免疫的重要作用，可与癌基因、抑癌基因相互作用，调节细胞增殖。[1]本研究试图通过观察Hp 相关慢性胃炎、胃腺癌的PCNA 及HSP70 mRNA 的表达，以认识Hp 的可能致癌作用方式。
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1 材料和方法
1.1 标本来源
20例胃腺癌标本为手术切取的胃腺癌和癌周组织(距癌组织2 cm)，对照组非肿瘤性胃组织经胃镜取自35例慢性胃炎和1例胃溃疡患者，均经病理诊断证实。
1.2 Hp感染的检测
采用尿素酶试纸法和Giemsa组织染色方法进行，两方法均阳性即判断该标本为Hp阳性。
1.3 免疫组织化学检测
鼠抗PCNA (PC10)、p53(Do-1)单克隆抗体及链霉亲生物素-过氧化酶(S-P)试剂盒均为Santa Cruz Biotech.Inc产品，购自北京中山生物技术公司。以已知阳性片和PBS作阳、阴性对照。
, 百拇医药
1.4 HSP70表达检测
1.4.1 组织RNA提取:液氮冻存胃粘膜组织标本500 mg 研磨后，以异硫氰酸胍一步法提取组织总RNA ; 将从4 例Hp(+)胃腺癌、2例Hp(-)胃腺癌和Hp(+)胃炎、胃溃疡各1例组织获得的RNA样品经聚乙二醛和二甲亚砜(DMSO)变性，点至琼脂糖凝胶作RNA电泳, 再转印到硝酸纤维素膜上, 干燥备用。经重复试验获得相同结果。
1.4.2 探针的制备:质粒PUC709(HSP70)，由Dr. Hickey(University of Nevada, USA)惠赠。该质粒经扩增、纯化和酶切片段回收，获得片段大小约为2.6 kb的DNA，以32P-dCTP(中国原子能科研院同位素所)作随机引物法记。
1.4.3 Northern印迹:先以20 mmol/L Tris.HCl 清洗RNA膜，并浸湿于6×SSC 溶液，再将该膜与预杂交液(5×Denhardts液，5×SSC, 0.05 g/L SDS, 5 g/L去离子甲酰胺)混放于杂交袋内，68 ℃预杂交4 h ，再加入已知变性的HSP70/cDNA 探针, 过夜，用含0.01 g/L SDS 不同浓度SSC液洗膜数次，-20 ℃放射自显影7 d。
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1.4.4 杂交结果分析: 使用色谱扫描仪(CS-930, Shimada Co.)扫描杂交条带行相对定量。
1.5 结果分析
PCNA 阳性细胞计数以阳性细胞标记指数(Labeling Index, LI)评价[2],即LI=PCNA 阳性细胞/计数细胞×100 % ，是于中倍镜下任选连续视野计数1 000个上皮细胞核着色阳性细胞所占百分比。
统计学处理采用χ2 和Students t检验。
2 结 果
2.1 Hp 感染状况的检测
经尿素酶试纸法和Giemsa染色两方法检测，发现从慢性胃炎者胃窦粘膜检出Hp 的阳性率为68.6 % , 胃腺癌Hp检出率为55.0 % ，癌组织中未发现Hp 感染，均从癌旁组织或其他非癌部位的
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正常粘膜中检出, 见表1。
表1 Hp感染状况的检测 病理
例数
(n)
Hp(+)
Hp(-)
n
%
n
%
慢性胃炎
35
24
, http://www.100md.com
68.8
11
31.4
胃腺癌
20
11
55.0*
9
45.0
与慢性胃炎比较 *P<0.05
2.2 PCNA 的表达
2.2.1 染色特点：PCNA 染色呈棕色颗粒，定位于细胞核。PCNA 在正常胃粘膜的表达主要是胃腺腔部细胞。
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2.2.2 胃粘膜PCNA阳性细胞标记指数分析：结果见表2。
表2 PCNA 阳性细胞标记指数分析
n
PCNA(+)
LI%(
±s)慢性胃炎
Hp(+)
24
20
20.6±4.7
Hp(-)
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11
7
11.3±5.2*
胃腺癌
Hp(+)
11
11
68.3±8.5**
Hp(-)
9
9
54.6±7.1
, http://www.100md.com 与慢性胃炎Hp(+)组比较 *P<0.05 **P<0.012.3 HSP70表达及与Hp 感染间的关系
Hp 阳性胃腺癌组织HSP70表达水平低于Hp 阴性胃腺癌。Hp 感染的胃粘膜疾病中，HSP70表达水平以扫描值相对定量由低到高依次为胃腺癌、慢性胃炎和胃溃疡。
3 讨 论
胃癌的发生原因涉及饮食、环境、遗传等，是一个多因素、多步骤的结局。自认识Hp 在胃肠的致病作用以来，大量流行病学资料证明, Hp 感染与胃腺癌密切相关，尤其是肠型胃癌[3]。本研究检测了20例胃腺癌Hp 的感染状况，发现Hp 感染率为55 % (11/20)，低于对照组68.6 %。 Forman[4]认为胃癌发生后，肿瘤部位及生理学、组织学性状改变，使得Hp 失去了生存条件，该结果支持这种观点，同时也可以解释Hp 多在癌周组织内检出，而且胃癌患者的Hp 阳性率相对较低的原因。
, 百拇医药
PCNA为36 ku的核蛋白，又称为周期蛋白(Cyclin)，是DNA多聚酶δ的一种助因子。静止细胞含量很少，G1晚期开始增多，S期达到高峰，G2期、M期下降，是评价细胞增殖状态的重要指标[5]。通常慢性胃炎在临床上被作为潜在的癌前疾病，该研究对Hp 阳性慢性胃炎的PCNA 阳性细胞标记指数进行了分析，显示其LI(20.6±4.7)高于Hp 阴性者, 说明Hp 相关慢性胃炎的粘膜上皮具有较高增生水平，提示Hp感染对胃炎粘膜的增殖现象有一定的作用。Lynch等[6]以同样方法观察Hp相关胃炎者, 在根除Hp 前后胃粘膜的增殖状况，发现Hp 根除后胃粘膜细胞增水平恢复正常，认为高的细胞增生水平增加了细胞基因受损的机会，清除Hp 可减少胃癌发生的危险性。HSP70为具有自稳和保护作用的蛋白，本研究以Northern-blot 检测HSP70 RNA的表达, 作扫描相对定量发现HSP70在Hp阳性胃腺癌组织中表达低于Hp阴性胃腺癌者，且低于本研究中的Hp感染相关的慢性胃炎和胃溃疡,初步提示Hp感染可致胃腺癌HSP70表达降低，可能使胃腺癌组织的HSP70抗肿瘤作用降低。Hp致HSP70减少的机制尚不清楚，我们推测可能为胃癌部位感染的Hp 消失，而降低了HSP 表达刺激物的强度所致。由此看来，Hp相关慢性胃炎具有胃粘膜细胞高增殖状态，并有抗肿瘤作用降低，因此Hp 感染是胃癌形成机制中的一种重要因素。
, 百拇医药
作者简介：任宏宇, 男, 1967年生,博士, 主治医师
参考文献
1 Agoff S N, Hou J, Lizer D I H et al. Regulation of human HSP70 promoter by p53. Science, 1993,259:84
2 Kolodziejczyk K P, Yao T, Oya M et al. Long term follow up study of patients with gastric adenomas with malignant tranformation: A immunohistochemical and histochemical analysis. Cancer, 1994,74: 2 896
3 The Eurogast Study Group. An international assocition between helicobacter pylori infection and gastric cancer. Lancet ,1993, 341:1 359
, 百拇医药
4 Forman D, Dewell D G, Fullerton F et al. Association between infection with helicobacter pylori and risk of gastric cancer: evidence from a prospective investigation. Br Med J, 1991,302: 1 302
5 Ohyama S,Yonemura Y,Miyazaki I et al.Proliferative activity and malignancy in human gastric cancers:signifinace of the proliferation rate and its clinical application. Cancer, 1992, 69 :314
6 Lynch DAF,Mapstone NP,Clarke AT et al.Cell proliferation in helicobacter pylori associated gastritis and the effect of eradication therapy. Gut, 1995, 36:346
收稿日期：1998-06-03, 百拇医药