蛋白合成抑制剂促进TNFa 诱导大肠癌细胞凋亡
作者：梁卫江 黄卓垣 丁彦青 张万岱
单位：空军广州医院儿科，广州，510602；第一军医大学病理学教研室，南方医院全军消化内科研究所，广州，510515
关键词：细胞凋亡；大肠肿瘤；肿瘤坏死因子α；放线菌酮
第一军医大学学报990207 摘要：目的 探索放线菌酮和TNFα协同诱导人大肠癌LoVo细胞凋亡的发生规律。方法 用细胞体外培养方法，以放线菌酮和TNFα均小剂量作用于人大肠癌LoVo细胞，经Hoechst33258荧光染色，光镜观察形态改变，并用流式细胞术检测DNA断裂情况。结果 单用TNFα5 万U/L或放线菌酮4 mg/L，均未引起LoVo细胞凋亡效应。而两者协同，作用12 h至48 h，LoVo细胞逐渐出现明显的凋亡形态学改变和DNA断裂。结论 小剂量的放线菌酮和TNFα协同作用于人大肠癌LoVo细胞，出现明显的凋亡效应。
, 百拇医药
中图分类号：R735.3
Promotion of TNFα-induced apoptosis with cycloheximide in colorectal carcinoma cell line LoVo
Liang Weijiang1, Huang Zhuoyuan2, Ding Yanqing2, Zhang Wandai3
1Guangzhou Hospital of Air Force, Guangzhou, 510602; Department of Pathology2, PLA Institute for Digestive Diseases, Nanfang Hospital3, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
, 百拇医药
Abstract: Objective To explore the regulation of apoptosis in human colorectal carcinoma cell line LoVo induced by cooperation cycloheximide (CHX) with tumor necrosis factor-α(TNFα). Methods LoVo cells were cultured in vitro and treated with small doses of CHX and TNFα. The morphological changes associated with apoptosis were observed under optical microscope after Hoechst 33258 staining, and DNA fragments were assayed by flow cytometry. Results LoVo cells did not undergo apoptosis when they were treated by only 4 mg/L CHX or 5×105 U/L TNFα from 12 to 48 h, but did when by combination CHX and TNFα. The morphological changes associated with apoptosis were noted and DNA fragments detected. Conclusion Combination of the small doses of CHX and TNFα could induce obvious apoptosis effect on LoVo cell line.
, 百拇医药
Key words: apoptosis; colorectal neoplasm; tumor necrosis factor alpha; cycloheximide 细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，受内在基因调控，通过主动的生化过程而自杀死亡的现象。肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)是一种细胞毒因子，通过与细胞膜表面TNF受体(TNFR)结合，激活细胞内信号传导系统，引起某些肿瘤细胞凋亡[1]。是否引起细胞凋亡及其强弱，与TNFR的多少无关，而推测与是否产生保护性蛋白有关[2]。本实验就保护性蛋白的存在与否，作进一步探索。
1材料与方法
1.1 细胞培养及处理 人大肠癌LoVo细胞用含10%小牛血清的RPMI-1640(美国GIBCO BRL)培养液常规培养，5×108/L传代至35 ml培养瓶中，对数生长期加处理因素。设两组。第1组又设4个小组各4瓶细胞，1小组为空白对照，2、3小组分别单加放线菌酮(Cycloheximide，CHX，Sigma)4 mg/L和TNFα(北京邦定公司基因工程合成)5 万U /L，第4小组加CHX 4 mg/L, 2 h后加TNFα5 万U/L，于48 h收集细胞。第2组设5瓶细胞，Ⅰ号瓶作为空白对照，Ⅱ-Ⅴ号瓶加CHX 4 mg/L， 2 h后加TNFα5 万U/L，分别于12、24、36和48 h收集细胞。
, http://www.100md.com
1.2 荧光染色显微镜观察 第1组细胞根据文献[3]进行Hoechst33258染色并观察形态改变。
1.3 流式细胞术检测 第2组细胞根据文献[3]进行碘化丙啶染色和检测。凋亡百分率用细胞仪计算，统计处理c 2检验。
2 结果
2.1 荧光显微镜观察 Hoechst33258只与双链DNA结合使核呈黄绿色，RNA和胞浆不着色。第一组每小组内各瓶细胞形态相似，1、2、3小组多为大小较一致、染色均匀的圆形核，偶见固缩浓染核。第4小组大多数为凋亡细胞核：固缩浓染，形态不规则，呈颗粒或小块状。
2.2 流式细胞术检测 I号DNA直方图显示LoVo细胞生活周期分布(图1a)，在G1峰前检出8.5%凋亡细胞。Ⅱ-Ⅴ号在G1峰前出现随作用时间延长而增高的亚G1峰(Ⅴ号见图1b)。细胞仪计算结果见表1。
, 百拇医药
图1 流式细胞仪对LoVo细胞内DNA的检测
Fig.1 Detection of DNA in LoVo cell by flow cytometrya The DNA histogram of cultured normally LoVo cell
b The DNA histogram of LoVo cell after treatment for 48 h with CHX and TNFα
表1 CHX和TNFα协同作用不同时间的比较
Tab.1 Percentage of apoptotic LoVo cells treated by CHX and TNFαat different times No.
, 百拇医药
h
Number of cell
Number of Apo
%
Ⅰ
0
2 679
229
8.5
Ⅱ
12
5 363
1 279
, 百拇医药
23.8
Ⅲ
24
5 354
1 550
29.0
Ⅳ
36
5 594
2 274
40.7
Ⅴ
48
, 百拇医药
10 583
5 392
50.9
c 2=2407.2140 P <0.0001
Apo=apoptosis cells
3 讨论
细胞发生凋亡时，形态学上出现特征性改变[4]。流式细胞术检测可见亚G1峰[5]。TNF通过与靶细胞膜上TNFR结合，引起细胞内一连串信号传导的变化，使Ca2+浓度增加，激活核酸内切酶，DNA在核小体连接处断裂，使多种肿瘤细胞发生凋亡[4]。靶细胞的敏感性与TNFR多少无关，而可能与产生了保护性蛋白有关。加用代谢抑制剂，可能增强靶细胞对TNF的敏感性[2]。CHX为蛋白合成抑制剂，对于不同的细胞株,可起抑制或诱导凋亡的不同作用[6]。根据细胞种类不同，CHX或TNFα诱导凋亡剂量差别很大，但未见诱导大肠癌凋亡的报道。我们在试验中，用两者诱导LoVo细胞凋亡剂量分别为20 mg/L和250 万U/L以上。
, 百拇医药
本实验单用小剂量CHX 4 mg/L或TNFα 5 万U/L, 均未引起LoVo细胞凋亡的形态学改变；两者协同，则出现明显的凋亡形态学改变：Hoechst 33258染色后、在荧光显微镜下，大多数细胞核固缩浓染，呈颗粒或小块状。流式细胞术检测到，对照培养细胞在G1峰前就有8.5%的细胞凋亡，与国外文献报道相似[5], 是在细胞培养及标本处理过程中发生的；两者协同，出现随作用时间延长而增高的亚G1峰和凋亡百分率。这可能是CHX抑制了LoVo细胞内阻止TNFα诱导凋亡的蛋白质的合成，使小剂量TNFα发挥凋亡效应。
临床已应用TNF治疗肿瘤, 但剂量大, 副作用大, 使用上受到限制。如果合用小剂量蛋白合成抑制剂，则可提高TNF的应用价值。本实验作为TNF诱导细胞凋亡机理的研究，为临床应用TNF治疗肿瘤提供了信息和理论依据。
参考文献
1曹 炜，牛建昭. 细胞凋亡的概念及其基因的研究进展. 日本医学介绍，1995,16(3):137
, 百拇医药
2 Kirstein M, Baglioni C. Tumor necrosis factor induces synthesis of two proteine in human fibroblasts. J Bio Chem, 1986,261:9565
3姜 泊，张亚历，周殿元. 分子生物学常用实验方法.北京:人民军医出版社，1996,174～176
4 Fesus L, Peter JA, Piacentini M. Apoptosis; molecular mechanisms in programmed cell death. Eur J Cell Biol, 1991,56:170
5 Dolzhanskiy A, Basch RS. Flow cytometric determinaion of apoptosis in heterogeneous cell populations. J Immunol Methods, 1995,180:131
6 Van de Loosdrecht AA, Ossenkoppele GJ, Beelen RHJ et al. Apoptosis in tumor necrosis factor-α-dependent, monocyte-mediated leukemic cell death: a functional, morphologic, and flow-cytometric analysis. Exp Hematol, 1993,21:1628
(收稿日期：1998-10-03), http://www.100md.com
单位：空军广州医院儿科，广州，510602；第一军医大学病理学教研室，南方医院全军消化内科研究所，广州，510515
关键词：细胞凋亡；大肠肿瘤；肿瘤坏死因子α；放线菌酮
第一军医大学学报990207 摘要：目的 探索放线菌酮和TNFα协同诱导人大肠癌LoVo细胞凋亡的发生规律。方法 用细胞体外培养方法，以放线菌酮和TNFα均小剂量作用于人大肠癌LoVo细胞，经Hoechst33258荧光染色，光镜观察形态改变，并用流式细胞术检测DNA断裂情况。结果 单用TNFα5 万U/L或放线菌酮4 mg/L，均未引起LoVo细胞凋亡效应。而两者协同，作用12 h至48 h，LoVo细胞逐渐出现明显的凋亡形态学改变和DNA断裂。结论 小剂量的放线菌酮和TNFα协同作用于人大肠癌LoVo细胞，出现明显的凋亡效应。
, 百拇医药
中图分类号：R735.3
Promotion of TNFα-induced apoptosis with cycloheximide in colorectal carcinoma cell line LoVo
Liang Weijiang1, Huang Zhuoyuan2, Ding Yanqing2, Zhang Wandai3
1Guangzhou Hospital of Air Force, Guangzhou, 510602; Department of Pathology2, PLA Institute for Digestive Diseases, Nanfang Hospital3, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
, 百拇医药
Abstract: Objective To explore the regulation of apoptosis in human colorectal carcinoma cell line LoVo induced by cooperation cycloheximide (CHX) with tumor necrosis factor-α(TNFα). Methods LoVo cells were cultured in vitro and treated with small doses of CHX and TNFα. The morphological changes associated with apoptosis were observed under optical microscope after Hoechst 33258 staining, and DNA fragments were assayed by flow cytometry. Results LoVo cells did not undergo apoptosis when they were treated by only 4 mg/L CHX or 5×105 U/L TNFα from 12 to 48 h, but did when by combination CHX and TNFα. The morphological changes associated with apoptosis were noted and DNA fragments detected. Conclusion Combination of the small doses of CHX and TNFα could induce obvious apoptosis effect on LoVo cell line.
, 百拇医药
Key words: apoptosis; colorectal neoplasm; tumor necrosis factor alpha; cycloheximide 细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，受内在基因调控，通过主动的生化过程而自杀死亡的现象。肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)是一种细胞毒因子，通过与细胞膜表面TNF受体(TNFR)结合，激活细胞内信号传导系统，引起某些肿瘤细胞凋亡[1]。是否引起细胞凋亡及其强弱，与TNFR的多少无关，而推测与是否产生保护性蛋白有关[2]。本实验就保护性蛋白的存在与否，作进一步探索。
1材料与方法
1.1 细胞培养及处理 人大肠癌LoVo细胞用含10%小牛血清的RPMI-1640(美国GIBCO BRL)培养液常规培养，5×108/L传代至35 ml培养瓶中，对数生长期加处理因素。设两组。第1组又设4个小组各4瓶细胞，1小组为空白对照，2、3小组分别单加放线菌酮(Cycloheximide，CHX，Sigma)4 mg/L和TNFα(北京邦定公司基因工程合成)5 万U /L，第4小组加CHX 4 mg/L, 2 h后加TNFα5 万U/L，于48 h收集细胞。第2组设5瓶细胞，Ⅰ号瓶作为空白对照，Ⅱ-Ⅴ号瓶加CHX 4 mg/L， 2 h后加TNFα5 万U/L，分别于12、24、36和48 h收集细胞。
, http://www.100md.com
1.2 荧光染色显微镜观察 第1组细胞根据文献[3]进行Hoechst33258染色并观察形态改变。
1.3 流式细胞术检测 第2组细胞根据文献[3]进行碘化丙啶染色和检测。凋亡百分率用细胞仪计算，统计处理c 2检验。
2 结果
2.1 荧光显微镜观察 Hoechst33258只与双链DNA结合使核呈黄绿色，RNA和胞浆不着色。第一组每小组内各瓶细胞形态相似，1、2、3小组多为大小较一致、染色均匀的圆形核，偶见固缩浓染核。第4小组大多数为凋亡细胞核：固缩浓染，形态不规则，呈颗粒或小块状。
2.2 流式细胞术检测 I号DNA直方图显示LoVo细胞生活周期分布(图1a)，在G1峰前检出8.5%凋亡细胞。Ⅱ-Ⅴ号在G1峰前出现随作用时间延长而增高的亚G1峰(Ⅴ号见图1b)。细胞仪计算结果见表1。
, 百拇医药
图1 流式细胞仪对LoVo细胞内DNA的检测
Fig.1 Detection of DNA in LoVo cell by flow cytometrya The DNA histogram of cultured normally LoVo cell
b The DNA histogram of LoVo cell after treatment for 48 h with CHX and TNFα
表1 CHX和TNFα协同作用不同时间的比较
Tab.1 Percentage of apoptotic LoVo cells treated by CHX and TNFαat different times No.
, 百拇医药
h
Number of cell
Number of Apo
%
Ⅰ
0
2 679
229
8.5
Ⅱ
12
5 363
1 279
, 百拇医药
23.8
Ⅲ
24
5 354
1 550
29.0
Ⅳ
36
5 594
2 274
40.7
Ⅴ
48
, 百拇医药
10 583
5 392
50.9
c 2=2407.2140 P <0.0001
Apo=apoptosis cells
3 讨论
细胞发生凋亡时，形态学上出现特征性改变[4]。流式细胞术检测可见亚G1峰[5]。TNF通过与靶细胞膜上TNFR结合，引起细胞内一连串信号传导的变化，使Ca2+浓度增加，激活核酸内切酶，DNA在核小体连接处断裂，使多种肿瘤细胞发生凋亡[4]。靶细胞的敏感性与TNFR多少无关，而可能与产生了保护性蛋白有关。加用代谢抑制剂，可能增强靶细胞对TNF的敏感性[2]。CHX为蛋白合成抑制剂，对于不同的细胞株,可起抑制或诱导凋亡的不同作用[6]。根据细胞种类不同，CHX或TNFα诱导凋亡剂量差别很大，但未见诱导大肠癌凋亡的报道。我们在试验中，用两者诱导LoVo细胞凋亡剂量分别为20 mg/L和250 万U/L以上。
, 百拇医药
本实验单用小剂量CHX 4 mg/L或TNFα 5 万U/L, 均未引起LoVo细胞凋亡的形态学改变；两者协同，则出现明显的凋亡形态学改变：Hoechst 33258染色后、在荧光显微镜下，大多数细胞核固缩浓染，呈颗粒或小块状。流式细胞术检测到，对照培养细胞在G1峰前就有8.5%的细胞凋亡，与国外文献报道相似[5], 是在细胞培养及标本处理过程中发生的；两者协同，出现随作用时间延长而增高的亚G1峰和凋亡百分率。这可能是CHX抑制了LoVo细胞内阻止TNFα诱导凋亡的蛋白质的合成，使小剂量TNFα发挥凋亡效应。
临床已应用TNF治疗肿瘤, 但剂量大, 副作用大, 使用上受到限制。如果合用小剂量蛋白合成抑制剂，则可提高TNF的应用价值。本实验作为TNF诱导细胞凋亡机理的研究，为临床应用TNF治疗肿瘤提供了信息和理论依据。
参考文献
1曹 炜，牛建昭. 细胞凋亡的概念及其基因的研究进展. 日本医学介绍，1995,16(3):137
, 百拇医药
2 Kirstein M, Baglioni C. Tumor necrosis factor induces synthesis of two proteine in human fibroblasts. J Bio Chem, 1986,261:9565
3姜 泊，张亚历，周殿元. 分子生物学常用实验方法.北京:人民军医出版社，1996,174～176
4 Fesus L, Peter JA, Piacentini M. Apoptosis; molecular mechanisms in programmed cell death. Eur J Cell Biol, 1991,56:170
5 Dolzhanskiy A, Basch RS. Flow cytometric determinaion of apoptosis in heterogeneous cell populations. J Immunol Methods, 1995,180:131
6 Van de Loosdrecht AA, Ossenkoppele GJ, Beelen RHJ et al. Apoptosis in tumor necrosis factor-α-dependent, monocyte-mediated leukemic cell death: a functional, morphologic, and flow-cytometric analysis. Exp Hematol, 1993,21:1628
(收稿日期：1998-10-03), http://www.100md.com