生物心瓣材料细胞毒性试验方法敏感性比较
作者：程述森 石应康 梁卫东 李炜如熊英
单位：华西医科大学附属第一医院胸心外科(成都610041)
关键词：生物心脏瓣膜材料；细胞毒性；试验方法
华西医学WEST CHINA MEDICAL JOURNAL1999年 第14卷 第2期 Vol 摘要：此研究采用培养的人胚肺成纤维细胞(HEL)和鼠L-929细胞、分别采用琼脂覆盖法和直接接触法对商业用生物心瓣材料的细胞毒性分析比较。计算浸泡前和浸泡10、20、30天周期中材料的细胞增殖抑制指数，并参照国际标准化组织(ISO)要求评定材料细胞毒性。结果显示：在琼脂覆盖法试验中，无论使用HEL或L-929细胞在生物心瓣材料各浸泡阶段均未观察到明显的脱色区和细胞溶解现象，细胞毒性评价为0-Ⅰ级。在直接接触法试验中，HEL或L-929细胞在生物心瓣材料各浸泡阶段均显示出明显长期的细胞毒性。作者认为，商业用生物心瓣材料的细胞毒性试验使用直接接触法更为敏感与准确。
, http://www.100md.com
[中图分类号]R318.11 [文献标识码]A
[文章编号]1002-0179(1999)02-0158-02
Comparison of Sensitivity of Different Testing Methods in Assessing the Cytotoxicity of Bioprosthetic Heart Valve Materials
CHENG Shu-sen,SHI Ying-kang,LIANG Wei-dong,et al.
Department of Cardiothoraic Surgery,The First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu.610041.
, http://www.100md.com
Abstract:Objective：The difference in cytotoxicity of bioprosthetic cardiac valve materials was compared by using agar overlay and direct contact assay methods.Method:The material was crosslinked by glutaral dehyde and stored in 4% formaldehyde.The cells used for testing were human embryonic fibroblasts and mouse L-929 cells.The agar overlay and direct contact assay methods were used and their results were analyzed and compared.The cell proliferative inhibition index(CPII)was calculated for the testing materials being at the periods before,10,20 and 30 days after immerising the testing materials in the cellular suspension fluid.Conclusion:It was concluded that the direct contact method was more sensitive in the detection of cytotoxicity of the material than that of the agar overlay method.It was considered that in testing the cytotoxicity of the prosthetic heart valve material the direct contact method was preferable because it was more sensitive and accurate.
, http://www.100md.com
Key words:Bioprosthetic heart valve materials;Cytotoxicity;Sensitive
(Received date:1999-02-05)
生物心脏瓣膜已广泛应用于临床。生物心瓣材料除应具有良好的力学和理化性能外，更重要的是它应对组织、细胞无任何毒副作用，促进组织生长并与之结合。因此对材料的生物相容性检测是筛选生物材料十分重要的环节。目前商业用生物心瓣都是经戊二醛交联处理，国内外报道其细胞毒性结果差异很大，分析原因可能是采用的实验方法不同。本研究旨在评价不同的实验方法对商业用生物心瓣材料细胞毒性检测的敏感性。以选择合理、准确的评价生物材料细胞毒性的实验方法。
1 材料
生物心瓣材料制备：采集健康牦牛的完整心包，剥去心包表面的脂肪组织，取心前区部分用生理盐水充分漂洗后用Hank's液处理，使用戊二醛(Glutoraldehyde,GA)交联处理，然后分别置于4%甲醛防霉液中4～10℃保存。实验样品剪裁成1cm×1cm圆形片，每片重约30mg。
, http://www.100md.com
实验细胞使用人胚肺成纤维细胞(HEL)及L-929细胞，RPMI-1640加入10%小牛血清，2mmol/L L-谷氨酰胺作为培养液。5%CO2孵箱37℃条件下培养3～4天，0.025%胰酶消化后加入RPMI-1640培养液稀释制成细胞悬液，细胞记数2.62×103/ml。
2 方法
取出保存的心包样品用生理盐水彻底冲洗，再用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗两次。心包样品以“M”表示，实验分四阶段进行，第一阶段为未浸泡期、以“M1”表示，第二至四阶段心包材料使用DMEM液浸泡，浸泡液内含青霉素80iu/ml，链霉素80μg/ml。浸泡液量为1∶10(即每1.0cm材料加10ml液浸泡)。第二阶段为浸泡10天、心包材料以M2表示，第三阶段为浸泡20天、心包材料以M3表示，第四阶段为浸泡30天、心包材料以M4表示。每实验组每阶段的样品数均为4(n=4)。浸泡过程如图1所示。
, 百拇医药
图1 浸泡过程和浸泡材料示意图
Fig Preparation method for extracts and extracted material
2.1 直接接触法：细胞培养实验采用24孔细胞培养板2个，分别加入HEL和L-929细胞悬液，每孔3ml，每孔放一片心包材料。每组每阶段同时设正常对照(n=4)，加入DMEM液0.3ml。5%CO2、37℃条件下培养7天后去除心包材料和培养液，并用PBS液4ml冲洗3次，贴附于培养孔内壁的细胞层用0.25%胰酶消化。采用血球记数法分别计算各孔活细胞数，取其均数计算各组各阶段心包材料的细胞增殖抑制指数(Cell Proliferation Inhibition Index CPⅡ)：
CPII(%)=100-
, http://www.100md.com
2.2 琼脂覆盖试验：将制备好的HEL和L-929细胞悬液分别加入四个直径为90mm的玻璃培养皿中，每个培养皿15ml，5%CO2、37℃条件下培养24小时后去除培养液，留下贴附培养皿生长的细胞层。加入3%琼脂液和RPMI-1640培养液各5ml，并加入2%中性红染色液(0.1m中性红/10ml培养基)混合均匀制成培养基。将心包样品、阴性标准材料医用聚乙烯和阳性标准材料(20%酚溶液浸湿滤膜片)对称放在琼脂层表面，每个培养皿放各浸泡阶段心包样品2片。24小时后显微镜下观察材料周围和材料下面脱色区范围及脱色区内细胞形态变化。材料的毒性反应大小用“反应指标”R表示，R=Z/L。Z为区域指标、与脱色区大小有关，L为细胞溶解指标、与脱色区内细胞溶解有关。参照国际标准化组织(ISO)要求评价材料的细胞毒性。
3 结果
L-929细胞琼脂覆盖试验中，各浸泡阶段生物心瓣材料均未观察到明显的脱色区及细胞溶解现象，细胞毒性等级均为0级。L-929细胞直接接触法中，各浸泡阶段生物心瓣材料均显示出明显的细胞毒性，未经浸泡的材料CPⅡ高达83.3%，经过30天浸泡的材料CPⅡ仍有31.8%。见表1。
, http://www.100md.com
表1.不同浸泡阶段生物心瓣材料L-929细胞琼脂覆盖法和直接接触法的细胞毒性
Table 1.Study of cytotoxicity in different extractive periods,using L-929 and different methods. material
Agar overlay method
material
Direct confact method
R
cytotoxicity
Cell number(
±s)×103/ml CPⅡ
, 百拇医药
positive control*
2/2
Ⅱ
negitive control**
0/0
0
control
3.89±0.63
0
M1
0/0
0
, 百拇医药
M1
0.65±0.10
83.3
M2
0/0
0
M2
1.10±0.24
71.7
M3
0/0
0
M3
, 百拇医药
2.12±0.25
45.5
M4
0/0
0
M4
2.65±0.28
31.8
*20%酚溶液浸湿滤膜片
**医用聚乙烯
HEL细胞琼脂覆盖试验中，第一阶段心瓣材料(M1)下方可观察到一局限性脱色区，脱色区内未观察到明显的细胞溶解现象，细胞毒性等级为0-Ⅰ级。其余各浸泡阶段的心瓣样品均未观察到明显的脱色区和细胞溶解现象，细胞毒性等级为0级。HEL细胞直接接触法中，各浸泡阶段的心瓣材料均显示出明显的细胞毒性，未浸泡的材料CPII高达95.6%，经过30天浸泡漂洗后材料的CPII仍有26.4%。见表2。
, http://www.100md.com
表2.不同浸泡阶段生物心瓣材料HEL细胞琼脂覆盖法和直接接触法的细胞毒性
Table 2. Study of cytotoxicity in different extractive periods,using HEL and different methods. material
Agar overlay method
material
Direct confact method
R
cytotoxicity
Cell number(±s)×103/ml CPⅡ
, http://www.100md.com
positive control*
2/2
Ⅱ
negitive control**
0/0
0
control
3.89±0.63
0
M1
0/0
0
, 百拇医药
M1
0.65±0.10
83.3
M2
0/0
0
M2
1.10±0.24
71.7
M3
0/0
0
M3
, 百拇医药
2.12±0.25
45.5
M4
0/0
0
M4
2.65±0.28
31.8
*20%酚溶液浸湿滤膜片
**医用聚乙烯
4 讨论
生物心脏瓣膜植入人体后的耐久性问题迄今尚未解决，严重阻碍生物心瓣在临床上的广泛应用。影响生物心瓣耐久性的重要原因是瓣膜的钙化。采用内皮细胞生长覆盖生物材料表面，依赖活细胞正常的离子泵功能防止生物材料钙化是当今生物心脏瓣膜研究的新思路。内皮细胞具有维持成纤维细胞的营养，参与合成某些结缔组织成份，防止血小板粘附，加速血栓素灭活，合成前列环素，参与纤维蛋白溶解等重要功能[1]。要使内皮细胞在生物材料表面牢固附着生长，首先要求交联处理的生物心瓣材料没有细胞毒性〔2〕。六十年代末七十年代国内外相继研究成功并应用于临床的生物心瓣是由牛心包或猪主动脉瓣经戊二醛交联固定〔3〕，材料的生物相容性检测参照国际标准化组织(ISO)要求，采用鼠皮下成纤维细胞(L-929)、琼脂覆盖试验判断其细胞毒性〔4〕。韩波等报道戊二醛与环氧分别交联处理的牛心包材料和浸提液对培养L-929细胞生长无影响，细胞毒性均为0级〔5〕。金磊报道铬配合物与戊二醛分别交联处理的牛心包对L-929细胞生长无影响，材料的细胞毒性分别为0-Ⅰ级〔6〕。近年Van Luyn〔7〕，石应康〔8〕等使用人成纤维细胞、Eberl〔2〕使用内皮细胞，采用直接接触法均证实商品化戊二醛处理的牛心包材料具有明显长期的细胞毒性。这些相互矛盾的实验结果说明目前生物心瓣材料的细胞毒性评价方法急待改进和规范。
, http://www.100md.com
本研究采用人成纤维细胞(HEL)与L-929细胞进行生物心瓣材料细胞毒性试验，分别采用琼脂覆盖法和直接接触法。结果显示：在琼脂覆盖法试验中，无论使用HEL或L-929细胞在生物心瓣材料各浸泡阶段均未观察到明显的脱色区和细胞溶解现象，细胞毒性评价为0级、0-Ⅰ级。在直接接触法试验中，HEL或L-929细胞在生物心瓣材料各浸泡阶段均显示出明显长期的细胞毒性，未经浸泡的生物心瓣材料CPⅡ高达91%～95%，即使浸泡30天后材料的CPⅡ仍达26%～32%。Wiebe〔9〕发现商品化生物心瓣材料长期释放戊二醛，极微量的戊二醛对内皮细胞有明显的细胞毒性。这可能是商品化生物心瓣缺乏内皮细胞生长的重要原因之一。由此可见，在生物心瓣材料试验中采用直接接触法可能更为合理和准确。
琼脂覆盖法是由Dubecco等1952年提出〔10〕，该法具有试验周期短、48小时可观察结果，操作简单，可同时对大批量生物材料进行筛选的优点。但该方法敏感性受材料溶出物在琼脂层上扩散程度的影响，当材料溶出物分子量小且易溶于水时其毒性易于发现。另外细胞毒性的观察是在光学显微镜下观察细胞形态变化，结果受主观影响较大，并且只能定性反映材料细胞毒性大小，材料之间细胞毒性比较缺乏统计学依据。直接接触法是材料与细胞混合培养，克服了琼脂覆盖法的缺陷，并且通过计算细胞增殖抑制指数(CPⅡ)定量反映材料的细胞毒性，同时还可以检测材料浸泡液的细胞毒性。因此作者认为直接接触法比琼脂覆盖法更敏感地反映生物心瓣材料的细胞毒性。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目
作者简介：李炜如熊英 华西医科大学附属第二医院儿科
5 参考文献
1 Jonas RA,Ziemer G,Bitton L et al:Cryopreserred and fresh amtibiotic steriliyed valved aortic homograft conduits in a long-term sheep model homodynamic,angiogrephic and histologic comparisons.J Thorac Cardiovase Surg,1998;96∶746.
2 Eberl T,Siedler S,Schumacher B et al∶Experimeutal in vitro endothelialiyation of cardiac valve leaflets.Ann Thorac Surg,1992;53(3)∶487.
, 百拇医药
3 蔡用之，主编∶人造心脏瓣膜与瓣膜置换术。北京：人民卫生出版社，1986：P77-101。
4 吕晓迎，邱立崇，薛 淼，等：十二种生物材料的细胞毒性研究—组织培养琼脂覆盖试验。上海生物医学工程通讯，1986；1(2)∶29。
5 Han Bao,Wuzhengshu,Yue Yilun et al:A new crosslinking agent for tissue valve.In∶Proceedings of Xi'an satellite coference of MP-BME,world congress,1991∶B5-1.
6 金磊，朱晓东，陈兰英∶铬配合物处理的牛心包瓣材料生物相容性的初步评价。透析与人工器官，1992；2(3)∶94。
7 Van Luyn MJA,Van Wachem PB,Damink LO et al∶Pelations between in vitro cytotoxicity and crosslinked dermal sheep collagens.J Biomed Mat Res,1992;26∶1091.
, 百拇医药
8 石应康，程述森，魏蜀亮，等∶不同交联改性牛心包材料的细胞毒性研究。生物医学工程学杂志，1995；12(4)∶350-354。
9 Wiebe D∶Glutaraldehyde releae from vascular prostheses of biologic orgin.Surgery,1988;104(1)∶26.
10 Wallace L,Guess S,Alan Rosenbluth et al∶Agar deffusion method for toxicity screening of plastics on culture cell monolayers.Journal of phyarmaceutical science,1965;54(10)∶1545-1547.
(收稿日期：1999-02-05), http://www.100md.com
单位：华西医科大学附属第一医院胸心外科(成都610041)
关键词：生物心脏瓣膜材料；细胞毒性；试验方法
华西医学WEST CHINA MEDICAL JOURNAL1999年 第14卷 第2期 Vol 摘要：此研究采用培养的人胚肺成纤维细胞(HEL)和鼠L-929细胞、分别采用琼脂覆盖法和直接接触法对商业用生物心瓣材料的细胞毒性分析比较。计算浸泡前和浸泡10、20、30天周期中材料的细胞增殖抑制指数，并参照国际标准化组织(ISO)要求评定材料细胞毒性。结果显示：在琼脂覆盖法试验中，无论使用HEL或L-929细胞在生物心瓣材料各浸泡阶段均未观察到明显的脱色区和细胞溶解现象，细胞毒性评价为0-Ⅰ级。在直接接触法试验中，HEL或L-929细胞在生物心瓣材料各浸泡阶段均显示出明显长期的细胞毒性。作者认为，商业用生物心瓣材料的细胞毒性试验使用直接接触法更为敏感与准确。
, http://www.100md.com
[中图分类号]R318.11 [文献标识码]A
[文章编号]1002-0179(1999)02-0158-02
Comparison of Sensitivity of Different Testing Methods in Assessing the Cytotoxicity of Bioprosthetic Heart Valve Materials
CHENG Shu-sen,SHI Ying-kang,LIANG Wei-dong,et al.
Department of Cardiothoraic Surgery,The First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu.610041.
, http://www.100md.com
Abstract:Objective：The difference in cytotoxicity of bioprosthetic cardiac valve materials was compared by using agar overlay and direct contact assay methods.Method:The material was crosslinked by glutaral dehyde and stored in 4% formaldehyde.The cells used for testing were human embryonic fibroblasts and mouse L-929 cells.The agar overlay and direct contact assay methods were used and their results were analyzed and compared.The cell proliferative inhibition index(CPII)was calculated for the testing materials being at the periods before,10,20 and 30 days after immerising the testing materials in the cellular suspension fluid.Conclusion:It was concluded that the direct contact method was more sensitive in the detection of cytotoxicity of the material than that of the agar overlay method.It was considered that in testing the cytotoxicity of the prosthetic heart valve material the direct contact method was preferable because it was more sensitive and accurate.
, http://www.100md.com
Key words:Bioprosthetic heart valve materials;Cytotoxicity;Sensitive
(Received date:1999-02-05)
生物心脏瓣膜已广泛应用于临床。生物心瓣材料除应具有良好的力学和理化性能外，更重要的是它应对组织、细胞无任何毒副作用，促进组织生长并与之结合。因此对材料的生物相容性检测是筛选生物材料十分重要的环节。目前商业用生物心瓣都是经戊二醛交联处理，国内外报道其细胞毒性结果差异很大，分析原因可能是采用的实验方法不同。本研究旨在评价不同的实验方法对商业用生物心瓣材料细胞毒性检测的敏感性。以选择合理、准确的评价生物材料细胞毒性的实验方法。
1 材料
生物心瓣材料制备：采集健康牦牛的完整心包，剥去心包表面的脂肪组织，取心前区部分用生理盐水充分漂洗后用Hank's液处理，使用戊二醛(Glutoraldehyde,GA)交联处理，然后分别置于4%甲醛防霉液中4～10℃保存。实验样品剪裁成1cm×1cm圆形片，每片重约30mg。
, http://www.100md.com
实验细胞使用人胚肺成纤维细胞(HEL)及L-929细胞，RPMI-1640加入10%小牛血清，2mmol/L L-谷氨酰胺作为培养液。5%CO2孵箱37℃条件下培养3～4天，0.025%胰酶消化后加入RPMI-1640培养液稀释制成细胞悬液，细胞记数2.62×103/ml。
2 方法
取出保存的心包样品用生理盐水彻底冲洗，再用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗两次。心包样品以“M”表示，实验分四阶段进行，第一阶段为未浸泡期、以“M1”表示，第二至四阶段心包材料使用DMEM液浸泡，浸泡液内含青霉素80iu/ml，链霉素80μg/ml。浸泡液量为1∶10(即每1.0cm材料加10ml液浸泡)。第二阶段为浸泡10天、心包材料以M2表示，第三阶段为浸泡20天、心包材料以M3表示，第四阶段为浸泡30天、心包材料以M4表示。每实验组每阶段的样品数均为4(n=4)。浸泡过程如图1所示。
, 百拇医药
图1 浸泡过程和浸泡材料示意图
Fig Preparation method for extracts and extracted material
2.1 直接接触法：细胞培养实验采用24孔细胞培养板2个，分别加入HEL和L-929细胞悬液，每孔3ml，每孔放一片心包材料。每组每阶段同时设正常对照(n=4)，加入DMEM液0.3ml。5%CO2、37℃条件下培养7天后去除心包材料和培养液，并用PBS液4ml冲洗3次，贴附于培养孔内壁的细胞层用0.25%胰酶消化。采用血球记数法分别计算各孔活细胞数，取其均数计算各组各阶段心包材料的细胞增殖抑制指数(Cell Proliferation Inhibition Index CPⅡ)：
CPII(%)=100-
, http://www.100md.com
2.2 琼脂覆盖试验：将制备好的HEL和L-929细胞悬液分别加入四个直径为90mm的玻璃培养皿中，每个培养皿15ml，5%CO2、37℃条件下培养24小时后去除培养液，留下贴附培养皿生长的细胞层。加入3%琼脂液和RPMI-1640培养液各5ml，并加入2%中性红染色液(0.1m中性红/10ml培养基)混合均匀制成培养基。将心包样品、阴性标准材料医用聚乙烯和阳性标准材料(20%酚溶液浸湿滤膜片)对称放在琼脂层表面，每个培养皿放各浸泡阶段心包样品2片。24小时后显微镜下观察材料周围和材料下面脱色区范围及脱色区内细胞形态变化。材料的毒性反应大小用“反应指标”R表示，R=Z/L。Z为区域指标、与脱色区大小有关，L为细胞溶解指标、与脱色区内细胞溶解有关。参照国际标准化组织(ISO)要求评价材料的细胞毒性。
3 结果
L-929细胞琼脂覆盖试验中，各浸泡阶段生物心瓣材料均未观察到明显的脱色区及细胞溶解现象，细胞毒性等级均为0级。L-929细胞直接接触法中，各浸泡阶段生物心瓣材料均显示出明显的细胞毒性，未经浸泡的材料CPⅡ高达83.3%，经过30天浸泡的材料CPⅡ仍有31.8%。见表1。
, http://www.100md.com
表1.不同浸泡阶段生物心瓣材料L-929细胞琼脂覆盖法和直接接触法的细胞毒性
Table 1.Study of cytotoxicity in different extractive periods,using L-929 and different methods. material
Agar overlay method
material
Direct confact method
R
cytotoxicity
Cell number(
±s)×103/ml CPⅡ, 百拇医药
positive control*
2/2
Ⅱ
negitive control**
0/0
0
control
3.89±0.63
0
M1
0/0
0
, 百拇医药
M1
0.65±0.10
83.3
M2
0/0
0
M2
1.10±0.24
71.7
M3
0/0
0
M3
, 百拇医药
2.12±0.25
45.5
M4
0/0
0
M4
2.65±0.28
31.8
*20%酚溶液浸湿滤膜片
**医用聚乙烯
HEL细胞琼脂覆盖试验中，第一阶段心瓣材料(M1)下方可观察到一局限性脱色区，脱色区内未观察到明显的细胞溶解现象，细胞毒性等级为0-Ⅰ级。其余各浸泡阶段的心瓣样品均未观察到明显的脱色区和细胞溶解现象，细胞毒性等级为0级。HEL细胞直接接触法中，各浸泡阶段的心瓣材料均显示出明显的细胞毒性，未浸泡的材料CPII高达95.6%，经过30天浸泡漂洗后材料的CPII仍有26.4%。见表2。
, http://www.100md.com
表2.不同浸泡阶段生物心瓣材料HEL细胞琼脂覆盖法和直接接触法的细胞毒性
Table 2. Study of cytotoxicity in different extractive periods,using HEL and different methods. material
Agar overlay method
material
Direct confact method
R
cytotoxicity
Cell number(
±s)×103/ml CPⅡ, http://www.100md.com
positive control*
2/2
Ⅱ
negitive control**
0/0
0
control
3.89±0.63
0
M1
0/0
0
, 百拇医药
M1
0.65±0.10
83.3
M2
0/0
0
M2
1.10±0.24
71.7
M3
0/0
0
M3
, 百拇医药
2.12±0.25
45.5
M4
0/0
0
M4
2.65±0.28
31.8
*20%酚溶液浸湿滤膜片
**医用聚乙烯
4 讨论
生物心脏瓣膜植入人体后的耐久性问题迄今尚未解决，严重阻碍生物心瓣在临床上的广泛应用。影响生物心瓣耐久性的重要原因是瓣膜的钙化。采用内皮细胞生长覆盖生物材料表面，依赖活细胞正常的离子泵功能防止生物材料钙化是当今生物心脏瓣膜研究的新思路。内皮细胞具有维持成纤维细胞的营养，参与合成某些结缔组织成份，防止血小板粘附，加速血栓素灭活，合成前列环素，参与纤维蛋白溶解等重要功能[1]。要使内皮细胞在生物材料表面牢固附着生长，首先要求交联处理的生物心瓣材料没有细胞毒性〔2〕。六十年代末七十年代国内外相继研究成功并应用于临床的生物心瓣是由牛心包或猪主动脉瓣经戊二醛交联固定〔3〕，材料的生物相容性检测参照国际标准化组织(ISO)要求，采用鼠皮下成纤维细胞(L-929)、琼脂覆盖试验判断其细胞毒性〔4〕。韩波等报道戊二醛与环氧分别交联处理的牛心包材料和浸提液对培养L-929细胞生长无影响，细胞毒性均为0级〔5〕。金磊报道铬配合物与戊二醛分别交联处理的牛心包对L-929细胞生长无影响，材料的细胞毒性分别为0-Ⅰ级〔6〕。近年Van Luyn〔7〕，石应康〔8〕等使用人成纤维细胞、Eberl〔2〕使用内皮细胞，采用直接接触法均证实商品化戊二醛处理的牛心包材料具有明显长期的细胞毒性。这些相互矛盾的实验结果说明目前生物心瓣材料的细胞毒性评价方法急待改进和规范。
, http://www.100md.com
本研究采用人成纤维细胞(HEL)与L-929细胞进行生物心瓣材料细胞毒性试验，分别采用琼脂覆盖法和直接接触法。结果显示：在琼脂覆盖法试验中，无论使用HEL或L-929细胞在生物心瓣材料各浸泡阶段均未观察到明显的脱色区和细胞溶解现象，细胞毒性评价为0级、0-Ⅰ级。在直接接触法试验中，HEL或L-929细胞在生物心瓣材料各浸泡阶段均显示出明显长期的细胞毒性，未经浸泡的生物心瓣材料CPⅡ高达91%～95%，即使浸泡30天后材料的CPⅡ仍达26%～32%。Wiebe〔9〕发现商品化生物心瓣材料长期释放戊二醛，极微量的戊二醛对内皮细胞有明显的细胞毒性。这可能是商品化生物心瓣缺乏内皮细胞生长的重要原因之一。由此可见，在生物心瓣材料试验中采用直接接触法可能更为合理和准确。
琼脂覆盖法是由Dubecco等1952年提出〔10〕，该法具有试验周期短、48小时可观察结果，操作简单，可同时对大批量生物材料进行筛选的优点。但该方法敏感性受材料溶出物在琼脂层上扩散程度的影响，当材料溶出物分子量小且易溶于水时其毒性易于发现。另外细胞毒性的观察是在光学显微镜下观察细胞形态变化，结果受主观影响较大，并且只能定性反映材料细胞毒性大小，材料之间细胞毒性比较缺乏统计学依据。直接接触法是材料与细胞混合培养，克服了琼脂覆盖法的缺陷，并且通过计算细胞增殖抑制指数(CPⅡ)定量反映材料的细胞毒性，同时还可以检测材料浸泡液的细胞毒性。因此作者认为直接接触法比琼脂覆盖法更敏感地反映生物心瓣材料的细胞毒性。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目
作者简介：李炜如熊英 华西医科大学附属第二医院儿科
5 参考文献
1 Jonas RA,Ziemer G,Bitton L et al:Cryopreserred and fresh amtibiotic steriliyed valved aortic homograft conduits in a long-term sheep model homodynamic,angiogrephic and histologic comparisons.J Thorac Cardiovase Surg,1998;96∶746.
2 Eberl T,Siedler S,Schumacher B et al∶Experimeutal in vitro endothelialiyation of cardiac valve leaflets.Ann Thorac Surg,1992;53(3)∶487.
, 百拇医药
3 蔡用之，主编∶人造心脏瓣膜与瓣膜置换术。北京：人民卫生出版社，1986：P77-101。
4 吕晓迎，邱立崇，薛 淼，等：十二种生物材料的细胞毒性研究—组织培养琼脂覆盖试验。上海生物医学工程通讯，1986；1(2)∶29。
5 Han Bao,Wuzhengshu,Yue Yilun et al:A new crosslinking agent for tissue valve.In∶Proceedings of Xi'an satellite coference of MP-BME,world congress,1991∶B5-1.
6 金磊，朱晓东，陈兰英∶铬配合物处理的牛心包瓣材料生物相容性的初步评价。透析与人工器官，1992；2(3)∶94。
7 Van Luyn MJA,Van Wachem PB,Damink LO et al∶Pelations between in vitro cytotoxicity and crosslinked dermal sheep collagens.J Biomed Mat Res,1992;26∶1091.
, 百拇医药
8 石应康，程述森，魏蜀亮，等∶不同交联改性牛心包材料的细胞毒性研究。生物医学工程学杂志，1995；12(4)∶350-354。
9 Wiebe D∶Glutaraldehyde releae from vascular prostheses of biologic orgin.Surgery,1988;104(1)∶26.
10 Wallace L,Guess S,Alan Rosenbluth et al∶Agar deffusion method for toxicity screening of plastics on culture cell monolayers.Journal of phyarmaceutical science,1965;54(10)∶1545-1547.
(收稿日期：1999-02-05), http://www.100md.com