糖尿病大鼠记忆功能改变及神经生长因子的影响
作者：贾军宏 马学毅 田东华 于国平 杨毅 王会信 赵明
单位：贾军宏 马学毅 杨毅：解放军304医院内分泌科，北京 100037；田东华 于国平：解放军总医院神经内科，北京 100853；王会信 赵明：军事医学研究院基础所八室，北京 100853
关键词：糖尿病；记忆；NGF治疗
军医进修学院学报990216 摘要 目的：观察糖尿病大鼠学习记忆功能的变化及外周投用神经生长因子(NGF)对其的影响。方法：采用水迷宫试验及大脑海马CA1区神经元计数测定糖尿病成模后 2 个月，后肢肌肉注射NGF 200μg.kg-1.d-1，30d 后的学习记忆功能改变，并与正常对照组(NC)组及糖尿病(DM)组比较。结果：DM组与NGF治疗组相似，水迷宫试验游完全程的时间明显长于NC组；错误反应次数明显高于NC组，而海马神经元计数明显少于NC组，P均小于0.001。结论：糖尿病损害大脑的学习记忆功能，外周投用NGF对这种损害的治疗作用不明显。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 58
Changes of thememory and the therapeutic effects of nerve growth factor indiabetic rats
Jia Junhong,Ma Xueyi,Tiandonghua,Yu Guoping,Yang Yi,Wanghuixin,Zhaoming (Department of Endocrinology,304thhospital of PLA,Beijing 100037)
Abstract Objective:To observe thechanges of learning andmemory function and the therapeutic effects of nerve growth factor (NGF) indiabetic rats.Methods:Twomonths after thediabeticmodel was induced,and nerve growth factor 200μg.kg-1.d-1. 30d im was given for the NGF group. the faction of learning andmemory weremeasured by the watermaze testing and thehippocampal pyramidalcells werecounted andcompared with NC group anddM group.Results:Threemonths later,the time ofcompleting the whole swimming journey and the numbers of error reaction weremuchhigher in thedM group than in the NC group. Thecounts ofhippocampal pyramidalcell in thedM group weremuch less than that in the NC group (P<0.001). The parameters in the NGF group were similar todM group.Conclusion:Thecerebral function of learning andmemorymay be injured bydiabetes,and peripheral administration of NGF shows not any improvement for such injury.
, 百拇医药
Key words diabetes;memory; NGF therapy
糖尿病神经病变(Diabetic neuropathy,DNP)是糖尿病的常见并发症，最初，周围神经病变是DNA研究的焦点，由于与糖尿病周围神经病变相比，糖尿病的中枢神经系统(CNS)并发症相对较轻，所以，以往认为脑不是糖尿病慢性并发症的靶器官，有关其神经化学、电生理、组织结构和认知功能等改变的综合研究也甚少。然而，与早期的印象相反，CNS并不是与糖尿病无关〔1〕。近几年糖尿病对CNS的影响越来越引起关注〔2～5〕，我们进行的此实验旨在观察糖尿病时中枢神经系统学习记忆功能的变化及神经生长因子的影响。
1 材料和方法
1.1 大鼠糖尿病模型制备 雄性Wistar大鼠体重 170～230g，购自解放军总医院实验动物中心按体重随机分为三组，正常对照(NC)组；糖尿病对照(DM)组；NGF治疗(NGF)组。链脲佐菌素(STZ Sigma)用pH 4.5 的枸橼酸缓冲液配制，浓度 20mg/ml。大鼠禁食 12h，DM组与NGF组按 75mg/kg 单剂腹腔注射，NC组注射等体积枸橼酸缓冲液。注射 3d 后用血糖仪(ONE TOUCH Ⅱ 强生公司)测尾静脉血糖，> 13mmol/L者入选。三组动物同时在解放军总医院实验动物中心饲养。自由摄食水，未用胰岛素治疗。
, 百拇医药
1.2 NGF治疗 NGF由军事医学科学院基础所八室提供，源于小鼠下颌腺的提取纯化。纯度大于95%。NGF组治疗开始于糖尿病成模后 2 个月(DNP形成)，NGF按 200μg/kg 后肢肌肉注射，1 次/d，共 30d。另外两组注射等体积生理盐水。
1.3 观察指标
1.3.1 一般检查 包括体重、血糖、糖化血红蛋白。其中体重、血糖每月测定一次，糖化血红蛋白于实验结束时心脏取血用微柱法测定。
1.3.2 神经功能测定 水迷宫试验(学习、记忆功能试验)选用Y型游泳迷宫(见图 1)。迷宫为长 90cm，宽 60cm，深 35cm 的长方形塑料水池，池内一端为起始区(A)，左右两侧分别为宽 20cm 的水道(B、C)，水道中间为可穿行的隔腔(D)，左侧水道尽头设一个 9cm ×7cm × 21cm 的安全岛(E)。实验时水深 23cm 左右，水温 (30±1) ℃。将大鼠尾部朝安全岛方向放入起始区，大鼠入池后引导其以最短的距离游向安全岛，并在岛上停留数分钟。每天训练 5 次，测验 5 次，连续 2d。以最短距离游向安全岛为正确反应，如游往安全岛的途中返回或游向对侧水道 1/2 路程为错误反应。记录每只大鼠每次游完全程的时间及错误反应的次数，以判断大鼠的学习记忆能力。
, 百拇医药
图1 水迷宫模式图
1.3.3 海马神经元计数 多聚甲醛心脏灌注固定后取脑组织，石蜡包埋切片，片厚 5μm 苏木素-伊红(HE)染色，Olympus BH-2 显微镜下观察结果，计数 40 倍镜下 1mm 游标卡尺内海马cA1区神经元个数。
2 结果
2.1 体重变化 实验前三组体重无明显差异，实验后DM组及NGF组体重增长明显低于NC组，P<0.000 1。见表 1。
表1 体重变化(
±s，W/g) 分组
n
实验前
, 百拇医药
1个月
2个月
3个月
NC
8
226.25±18.48
370.63±43.21
496.25±66.10
601.34±58.23
DM
9
222.44±47.20
, 百拇医药
296.66±51.72*
318.33±53.27*
285.55±69.63*
NGF
9
218.46±27.33
288.17±39.53*
293.33±46.25*
296.67±48.92*
* 表示与NC组比较P<0.0001
, 百拇医药
2.2 生化指标 见表 2。DM组与NGF组之间血糖和糖化血红蛋白无明显差异 P>0.05，但明显高于NC组P<0.0001。
表2 血糖、糖化血红蛋白比较(
±s) 分组
血糖(mmol.L-1)
GHb(%)
n
成模前
2个月
3个月
NC
, 百拇医药
8
4.02±0.56
3.79±1.02
3.69±0.47
6.98±1.39
DM
9
16.73±3.43*
19.49±4.66*
17.79±3.37*
12.06±1.77*
, 百拇医药
NGF
9
16.65±3.63*
19.68±4.33*
17.28±3.14*
11.84±1.88*
* 表示与NC组比较P<0.0001
2.3 水迷宫试验 结果显示，DM组、NGF组游完全程的时间明显长于NC组，错误反应次数明显高于NC组。P<0.001。NGF组虽略好于DM组，但无明显统计学差异。提示糖尿病动物出现明显的空间辨别学习障碍(表 3)。
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表3 迷宫试验结果(
±s) 分组
n
时间(s)
错误次数
d1
d2
d1
d2
NC
8
6.44±1.73
6.88±2.16
, 百拇医药
0.80±0.45
0.80±0.45
DM
9
26.63±4.81*
25.75±6.73*
8.00±2.78*
7.47±2.56*
NGF
9
23.05±6.25*
, 百拇医药
24.27±4.03*
5.88±1.96*
6.25±1.98*
与NC组比较P<0.0001
2.4 海马CA1区神经元计数 NC组为 122.63±2.62；DM组与NGF组分别为 107.56±5.13； 108.33±5.63 (个/mm)，明显少于NC组，P<0.01 (图 2)。
图2 海马CA1区神经元计数
3 讨论
, 百拇医药
流行病学的调查发现，脑血管病在糖尿病患者中发病率高，是非糖尿病患者的 2～6 倍〔6〕，这引起了人们对糖尿病中枢神经系统损害的警觉，近年的研究发现了糖尿病时脑内多种神经递质的生化改变；发现了脑电图、视觉诱发电位、体感诱发电位等电生理异常；发现了大脑皮层超微结构表现有血管损害，神经突起的线粒体异常，轴突变性和神经元缺失；还发现了慢性糖尿病引起一系列轻微的脑功能障碍较通常认为的要常见。我们利用简易、灵敏、准确的水迷宫试验〔7〕，发现在大鼠实验性糖尿病模型中也表现出学习记忆功能的障碍，水迷宫试验无论是游完全程的时间还是错误反应的次数均较正常大鼠为高。与病理学表现—海马CA1区神经元的计数明显低于正常相吻合。大量研究结果表明，海马CA1区神经元与学习记忆有关，当两侧海马较大范围损伤时，会丧失掌握新事物、新技巧的能力〔8〕，且海马区对缺氧反应敏感，易造成损害〔9〕。NGF是神经系统主要的营养因子，已有实验证实NGF的缺乏和转运异常参与糖尿病神经病变的发病过程，并可能是糖尿病神经病变发病机制中的重要环节。虽然有实验显示脑室内投用NGF可以改善老年大鼠的学习记忆功能〔10〕，但在我们的实验中未观察到NGF对糖尿病大鼠学习记忆功能的明显改善作用，这也许与NGF的剂量、治疗时间、给药途径或大脑对外源性NGF的敏感性等因素有关。特别是给药途径，因外源性NGF主要由神经末梢摄取逆转至神经胞体而起作用，末梢至中枢路途遥远，而血循环中的NGF又不能通过血脑屏障，可能由此影响了NGF对中枢神经系统的作用。
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参考文献
[1]Biessels GJ,Kappelle AC,Bravenboer B et al. Brain function indiabetes.diabetologia,1994，37:643
[2]Mukai N,hori S,Pomeroym et al.cerebral lesions in rats with streptozotocin-induceddiabetes. Acta Neuropathol (Berl),1980,51:79
[3]Reaven GM,Thompson LW,Nahumd et al. Relationship betweenhyperglycemia andcongnitive function in old NIDDM patients.diabetescare,1990,13:16
, 百拇医药
[4]Oejgaard A,Gade A,Larssonh et al. Evidence fordiabetic encephalopathy.diabebesmed,1991,8:162
[5]Krukoff TL,Patel KP. Altorations in brainhexokinase activity associated with steptozotocine-induceddiabettesmellitus in the rat. Brain Res,1990,522:157
[6]Anthony L. Perspectives indiabetes:The impact ofdiabetes on thecNS.diabetes,1992,41:557
[7]Zheng Jun-tian. Themanufacture of watermaze automaticcontroldevice and its application in the neuropharmacological study. J Pharm Anal,1991,11:23
[8]Squire LR.memory brain system and behavior. TINS,1988,11:170
[9]Moncada S. Nitric oxide phisiology,pathophisiology,and pharmacology. Pharmacol Res,1991,43:109
[10]吴承远主编.脑内移植.山东：山东科学技术出版社，1993.79
(1998—10—15收稿，1998—12—22修回), 百拇医药
单位：贾军宏 马学毅 杨毅：解放军304医院内分泌科，北京 100037；田东华 于国平：解放军总医院神经内科，北京 100853；王会信 赵明：军事医学研究院基础所八室，北京 100853
关键词：糖尿病；记忆；NGF治疗
军医进修学院学报990216 摘要 目的：观察糖尿病大鼠学习记忆功能的变化及外周投用神经生长因子(NGF)对其的影响。方法：采用水迷宫试验及大脑海马CA1区神经元计数测定糖尿病成模后 2 个月，后肢肌肉注射NGF 200μg.kg-1.d-1，30d 后的学习记忆功能改变，并与正常对照组(NC)组及糖尿病(DM)组比较。结果：DM组与NGF治疗组相似，水迷宫试验游完全程的时间明显长于NC组；错误反应次数明显高于NC组，而海马神经元计数明显少于NC组，P均小于0.001。结论：糖尿病损害大脑的学习记忆功能，外周投用NGF对这种损害的治疗作用不明显。
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中国图书资料分类法分类号 R 58
Changes of thememory and the therapeutic effects of nerve growth factor indiabetic rats
Jia Junhong,Ma Xueyi,Tiandonghua,Yu Guoping,Yang Yi,Wanghuixin,Zhaoming (Department of Endocrinology,304thhospital of PLA,Beijing 100037)
Abstract Objective:To observe thechanges of learning andmemory function and the therapeutic effects of nerve growth factor (NGF) indiabetic rats.Methods:Twomonths after thediabeticmodel was induced,and nerve growth factor 200μg.kg-1.d-1. 30d im was given for the NGF group. the faction of learning andmemory weremeasured by the watermaze testing and thehippocampal pyramidalcells werecounted andcompared with NC group anddM group.Results:Threemonths later,the time ofcompleting the whole swimming journey and the numbers of error reaction weremuchhigher in thedM group than in the NC group. Thecounts ofhippocampal pyramidalcell in thedM group weremuch less than that in the NC group (P<0.001). The parameters in the NGF group were similar todM group.Conclusion:Thecerebral function of learning andmemorymay be injured bydiabetes,and peripheral administration of NGF shows not any improvement for such injury.
, 百拇医药
Key words diabetes;memory; NGF therapy
糖尿病神经病变(Diabetic neuropathy,DNP)是糖尿病的常见并发症，最初，周围神经病变是DNA研究的焦点，由于与糖尿病周围神经病变相比，糖尿病的中枢神经系统(CNS)并发症相对较轻，所以，以往认为脑不是糖尿病慢性并发症的靶器官，有关其神经化学、电生理、组织结构和认知功能等改变的综合研究也甚少。然而，与早期的印象相反，CNS并不是与糖尿病无关〔1〕。近几年糖尿病对CNS的影响越来越引起关注〔2～5〕，我们进行的此实验旨在观察糖尿病时中枢神经系统学习记忆功能的变化及神经生长因子的影响。
1 材料和方法
1.1 大鼠糖尿病模型制备 雄性Wistar大鼠体重 170～230g，购自解放军总医院实验动物中心按体重随机分为三组，正常对照(NC)组；糖尿病对照(DM)组；NGF治疗(NGF)组。链脲佐菌素(STZ Sigma)用pH 4.5 的枸橼酸缓冲液配制，浓度 20mg/ml。大鼠禁食 12h，DM组与NGF组按 75mg/kg 单剂腹腔注射，NC组注射等体积枸橼酸缓冲液。注射 3d 后用血糖仪(ONE TOUCH Ⅱ 强生公司)测尾静脉血糖，> 13mmol/L者入选。三组动物同时在解放军总医院实验动物中心饲养。自由摄食水，未用胰岛素治疗。
, 百拇医药
1.2 NGF治疗 NGF由军事医学科学院基础所八室提供，源于小鼠下颌腺的提取纯化。纯度大于95%。NGF组治疗开始于糖尿病成模后 2 个月(DNP形成)，NGF按 200μg/kg 后肢肌肉注射，1 次/d，共 30d。另外两组注射等体积生理盐水。
1.3 观察指标
1.3.1 一般检查 包括体重、血糖、糖化血红蛋白。其中体重、血糖每月测定一次，糖化血红蛋白于实验结束时心脏取血用微柱法测定。
1.3.2 神经功能测定 水迷宫试验(学习、记忆功能试验)选用Y型游泳迷宫(见图 1)。迷宫为长 90cm，宽 60cm，深 35cm 的长方形塑料水池，池内一端为起始区(A)，左右两侧分别为宽 20cm 的水道(B、C)，水道中间为可穿行的隔腔(D)，左侧水道尽头设一个 9cm ×7cm × 21cm 的安全岛(E)。实验时水深 23cm 左右，水温 (30±1) ℃。将大鼠尾部朝安全岛方向放入起始区，大鼠入池后引导其以最短的距离游向安全岛，并在岛上停留数分钟。每天训练 5 次，测验 5 次，连续 2d。以最短距离游向安全岛为正确反应，如游往安全岛的途中返回或游向对侧水道 1/2 路程为错误反应。记录每只大鼠每次游完全程的时间及错误反应的次数，以判断大鼠的学习记忆能力。
, 百拇医药
图1 水迷宫模式图
1.3.3 海马神经元计数 多聚甲醛心脏灌注固定后取脑组织，石蜡包埋切片，片厚 5μm 苏木素-伊红(HE)染色，Olympus BH-2 显微镜下观察结果，计数 40 倍镜下 1mm 游标卡尺内海马cA1区神经元个数。
2 结果
2.1 体重变化 实验前三组体重无明显差异，实验后DM组及NGF组体重增长明显低于NC组，P<0.000 1。见表 1。
表1 体重变化(
±s，W/g) 分组n
实验前
, 百拇医药
1个月
2个月
3个月
NC
8
226.25±18.48
370.63±43.21
496.25±66.10
601.34±58.23
DM
9
222.44±47.20
, 百拇医药
296.66±51.72*
318.33±53.27*
285.55±69.63*
NGF
9
218.46±27.33
288.17±39.53*
293.33±46.25*
296.67±48.92*
* 表示与NC组比较P<0.0001
, 百拇医药
2.2 生化指标 见表 2。DM组与NGF组之间血糖和糖化血红蛋白无明显差异 P>0.05，但明显高于NC组P<0.0001。
表2 血糖、糖化血红蛋白比较(
±s) 分组血糖(mmol.L-1)
GHb(%)
n
成模前
2个月
3个月
NC
, 百拇医药
8
4.02±0.56
3.79±1.02
3.69±0.47
6.98±1.39
DM
9
16.73±3.43*
19.49±4.66*
17.79±3.37*
12.06±1.77*
, 百拇医药
NGF
9
16.65±3.63*
19.68±4.33*
17.28±3.14*
11.84±1.88*
* 表示与NC组比较P<0.0001
2.3 水迷宫试验 结果显示，DM组、NGF组游完全程的时间明显长于NC组，错误反应次数明显高于NC组。P<0.001。NGF组虽略好于DM组，但无明显统计学差异。提示糖尿病动物出现明显的空间辨别学习障碍(表 3)。
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表3 迷宫试验结果(
±s) 分组n
时间(s)
错误次数
d1
d2
d1
d2
NC
8
6.44±1.73
6.88±2.16
, 百拇医药
0.80±0.45
0.80±0.45
DM
9
26.63±4.81*
25.75±6.73*
8.00±2.78*
7.47±2.56*
NGF
9
23.05±6.25*
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24.27±4.03*
5.88±1.96*
6.25±1.98*
与NC组比较P<0.0001
2.4 海马CA1区神经元计数 NC组为 122.63±2.62；DM组与NGF组分别为 107.56±5.13； 108.33±5.63 (个/mm)，明显少于NC组，P<0.01 (图 2)。
图2 海马CA1区神经元计数
3 讨论
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流行病学的调查发现，脑血管病在糖尿病患者中发病率高，是非糖尿病患者的 2～6 倍〔6〕，这引起了人们对糖尿病中枢神经系统损害的警觉，近年的研究发现了糖尿病时脑内多种神经递质的生化改变；发现了脑电图、视觉诱发电位、体感诱发电位等电生理异常；发现了大脑皮层超微结构表现有血管损害，神经突起的线粒体异常，轴突变性和神经元缺失；还发现了慢性糖尿病引起一系列轻微的脑功能障碍较通常认为的要常见。我们利用简易、灵敏、准确的水迷宫试验〔7〕，发现在大鼠实验性糖尿病模型中也表现出学习记忆功能的障碍，水迷宫试验无论是游完全程的时间还是错误反应的次数均较正常大鼠为高。与病理学表现—海马CA1区神经元的计数明显低于正常相吻合。大量研究结果表明，海马CA1区神经元与学习记忆有关，当两侧海马较大范围损伤时，会丧失掌握新事物、新技巧的能力〔8〕，且海马区对缺氧反应敏感，易造成损害〔9〕。NGF是神经系统主要的营养因子，已有实验证实NGF的缺乏和转运异常参与糖尿病神经病变的发病过程，并可能是糖尿病神经病变发病机制中的重要环节。虽然有实验显示脑室内投用NGF可以改善老年大鼠的学习记忆功能〔10〕，但在我们的实验中未观察到NGF对糖尿病大鼠学习记忆功能的明显改善作用，这也许与NGF的剂量、治疗时间、给药途径或大脑对外源性NGF的敏感性等因素有关。特别是给药途径，因外源性NGF主要由神经末梢摄取逆转至神经胞体而起作用，末梢至中枢路途遥远，而血循环中的NGF又不能通过血脑屏障，可能由此影响了NGF对中枢神经系统的作用。
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参考文献
[1]Biessels GJ,Kappelle AC,Bravenboer B et al. Brain function indiabetes.diabetologia,1994，37:643
[2]Mukai N,hori S,Pomeroym et al.cerebral lesions in rats with streptozotocin-induceddiabetes. Acta Neuropathol (Berl),1980,51:79
[3]Reaven GM,Thompson LW,Nahumd et al. Relationship betweenhyperglycemia andcongnitive function in old NIDDM patients.diabetescare,1990,13:16
, 百拇医药
[4]Oejgaard A,Gade A,Larssonh et al. Evidence fordiabetic encephalopathy.diabebesmed,1991,8:162
[5]Krukoff TL,Patel KP. Altorations in brainhexokinase activity associated with steptozotocine-induceddiabettesmellitus in the rat. Brain Res,1990,522:157
[6]Anthony L. Perspectives indiabetes:The impact ofdiabetes on thecNS.diabetes,1992,41:557
[7]Zheng Jun-tian. Themanufacture of watermaze automaticcontroldevice and its application in the neuropharmacological study. J Pharm Anal,1991,11:23
[8]Squire LR.memory brain system and behavior. TINS,1988,11:170
[9]Moncada S. Nitric oxide phisiology,pathophisiology,and pharmacology. Pharmacol Res,1991,43:109
[10]吴承远主编.脑内移植.山东：山东科学技术出版社，1993.79
(1998—10—15收稿，1998—12—22修回), 百拇医药