等容大鼠心脏机械功能与能量代谢的同步观测*
作者：程增江 杜泽涵 李红昕 董华进 冯锐 李光玉
单位：程增江：解放军总医院微量元素研究室，北京 100853；杜泽涵 冯锐 李光玉：军事医学科学院国家生物医学分析中心，北京 100850；李红昕：山东省立医院心外科，济南 250021；董华进：军事医学科学院毒物药物研究所
关键词：核磁共振；离体心脏；血流动力学
军医进修学院学报990214 摘要 目的：在核磁共振谱仪上建立对同一大鼠心脏机械功能与能量代谢同时测定的技术方法。方法：制备离体等容大鼠心脏模型，通过建立计算机心功能监测系统测量和分析心脏的血流动力学参数；利用心脏的磷-31核磁共振(31P-NMR)谱观测心肌组织的能量代谢。结果：在所建NMR等容心脏模型上，心脏的机械和代谢功能可以实时、动态观测，且在实验结束后即可得到整个实验过程中心脏的血流动力学数据和心肌能量代谢的数据；离体大鼠心脏在NMR实验条件下具有较好的稳定性。结论：所建立的对等容大鼠心脏同时进行NMR和血流动力学观测的实验模型为国内基础心血管医学的研究提供了先进的技术手段。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 O 482.532
Simultaneous observations of hemodynamics and energymetabolism in isovolumic rat heartmodel
Cheng Zengjiang,Du Zehan,Li Hongxin,Dong Huajin,Feng Rui,Li Guangyu (Trace Element Research Laboratory,General Hospitial of PLA,Beijing 100853)
Abstract Objective:To establish a technique for simultaneous observations ofmechanical functions and energymetabolic status in the isolated rat heartmodel.Methods:Isolated isovolumic rat heartmodels were prepared,heart hemodynamic parameters were determined and processed bymeans of establishing acomputerized heart functionmonitoring system,andmyocardial energymetabolism was investigated bycollecting 31P NMR spectra.Results:By establishing the NMR isovolumic rat heart preparation,themechanical andmetabolic functions of the heart were sequentially observed on real-time,and all the hemodynamic andmyocardial energymetabolic datacould be obtained just after the experiments finished.meanwhile ,the heart preparations were found to be stable under the NMR experimentalconditions.conclusion:The established isovolumic rat heart preparations for simultaneous NMR and hemodynamic determinationsmay provide advanced techniques that are very useful for domestic findamental researches incardiovascularmedicine.
, 百拇医药
Key words NMR;isolated heart;hemodynamics
测定离体心脏的磷-31 核磁共振(31P-NMR)谱，可以在接近正常生理状态的情况下对心肌细胞内的多种能量代谢物质如磷酸肌酸(PCr)、ATP、无机磷酸盐以及心肌细胞内的pH值进行连续动态观测〔1，2〕。前文〔3，4〕我们曾报道了在立式窄孔磁体的 400mHz 超导核磁共振谱仪上进行Langendorff灌流心脏31P NMR谱测定的方法，并以此方法研究了维拉帕米对大鼠心脏缺血/再灌注损伤的保护作用〔5〕。由于NMR是一种非损伤性的测定方法，故而可以在NMR谱仪上同时测定同一心脏的功能与代谢。我们在前期工作的基础上，利用等容大鼠心脏模型实现了心脏血流动力学与31P-NMR谱的同步观测，从而能够直接考察同一心脏在实验过程中机械功能和自身代谢之间的关系。而以往只能对不同心脏分别进行功能和代谢的测定，或是对同一心脏先测定机械功能再经过冷冻、匀浆提取等处理后再进行生化代谢方面的测定，这不仅大大增加了实验的工作量，而且经过冷冻等处理后的心肌已经不再是生理状态，其细胞的代谢状态可能已经发生较大改变。本文所建立的对大鼠心脏功能、代谢进行连续动态观测的实验方法无疑为国内基础心血管医学的研究提供了新的技术手段。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器 磷酸肌酸(PCr)和亚甲基二膦酸(MDP)为Sigma公司产品；95% O2 和 5%cO2 混合气体，北京分析仪器厂温泉气体厂；硫化胶乳液，北京乳胶厂；其它常规试剂为分析纯级。JNM GX-400 型超导核磁共振谱仪及 25mm 31P 探头，日本电子公司；YH-1 型压力传感器，北京航天航空医学研究所；模/数(A/D)转换器，上海喜龙教学仪器厂；XY-1 型血压放大器，上海喜龙教学仪器厂；奔腾 586 微机，IBM兼容机；CARDIO 2 左心室内压分析软件，上海医科大学生理教研室；电磁阀：PQ22DF，北京自动经仪表七厂。
1.2 Wistar大鼠，雌雄兼用 (260～300 g)，按前文〔3〕所述方法制备Langendorff灌流大鼠心脏，用 16 号针头在左心室尖部扎一小孔，用以排出回流至心室的液体；再在左心耳中间剪一小口，从该口处将充水的、头部带一薄壁乳胶小球的塑料导管(Φ＝1.5mm) 经二尖瓣插入左心室。插入导管前先将乳胶球中的水 (100 μl) 转至三通阀上的微量注射器中，待乳胶球到达左心室合适位置后，将微量注射器中的水再充入乳胶球中，然后将导管结扎固定在心耳切口处。导管的另一端经一三通阀与压力传感器相联。信号放大后经模/数(A/D)转换接口到达计算机对血流动力学数据进行采集与分析。模/数转换器字长 8 位，转换电压 0～5 V，转换时间 15 μs，最大采样速率为 50 kHz。采用CARDIO 2 左心室内压分析软件实时测量如下血流动力学指标：收缩压，舒张末期压(LVEDP)，左心室发展压(Left ventricular developed pressure,LVDP)，室内压最大上升速率(+dp/dtmax)，室内压最大下降速率(-dp/dtmax)，心率(HR)以及心率室内压乘积(Rate and pressure product,RPP)。用量筒定时收集 1min 内由蠕动泵排出的冠脉流出液作为冠脉流量。
, 百拇医药
将制备好的灌流心脏固定于 25mm 外径的测试管中并置于磁体中探头线圈所在的位置按前文〔3，4〕所述方法进行NMR测定，使用电磁阀自动保持灌流液液面高度 110cm 以维持恒定的灌注压 10.8 kPa。
图 1 是我们在NMR谱仪进行心脏功能与代谢测定的实验装置示意图。
图1 等容大鼠心脏功能与代谢同步测定的实验装置示意图
3 结果和讨论
3.1 NMR等容大鼠心脏模型 通常使用的心脏灌流模型都可用于NMR测定。简单的Langendorff心脏只能进行代谢研究；工作心脏能够模仿心脏的生理做功，并可在NMR谱仪上同时观测心脏的功能与代谢〔6〕。但如前所述，由于装置复杂，操作较为困难，使用也较少；等容心脏是在Langerndorff心脏的基础上使心室相对于一充水乳胶小球进行等容收缩，其优点是可以利用Starling曲线研究心脏固有的收缩性能〔7〕。在国外，等容心脏模型是一种应用非常广泛的离体心脏模型〔8～10〕，然而该模型在国内却很少见有使用。
, 百拇医药
由于没有商品化的用于等容心脏实验的乳胶球，我们自制玻璃模具，使用硫化胶乳液和陶土粘合剂，经过反复摸索，制做了厚薄及大小较适合的顺应性好的乳胶气球。调节球中液体的体积可设置合适的LVEDP，文献中LVEDP一般采用 0.53～1.06 kPa，该压力构成了等容心脏模型中心脏的前负荷〔10〕。
3.2 计算机心功能监测系统 建立计算机心功能数据采集与分析系统，使得一个人能够进行整个离体心脏的NMR实验和心功能监测，并且在实验结束后即可得到整个实验过程中心脏的血流动力学数据和心肌能量代谢的数据。为此我们选用了上海嘉龙教学仪器厂SMUP-PC型生物信号处理系统中的A/D转换器，并与上海医科大学生理教研室合作开发了“CARDIO 2 左心室内压分析”软件。用该软件可方便、快捷地对实验过程中心脏的主要血流动力学参数进行记录、测量和分析，其主要特点是：①采用C语言与汇编语言编写，具有高速的实时处理能力。②选用于最能反映等容心脏功能的血流动力学参数：收缩压，LVDP(＝收缩压峰值-EDP)，+dp/dtmax，-dp/dtmax，HR以及RPP(＝LVD×HR)。引入LVDP和RPP这两个参数可以很好地反映心肌绝对收缩幅度和心室做功的大小。通过记录心室内压图形可随时对这些参数进行测量和分析。
, 百拇医药
3.3 NMR灌流大鼠心脏的稳定性 图 2 为一等容大鼠心脏在 2 h 灌流过程中血流动力学参数和高能磷化物水平的变化情况，其中PCr和ATP的相对峰强度以灌注开始后 20～25min 所记的第一个谱中的数据作为 100%。从线性回归图线看，在 2 h 灌注期内ATP无明显变化，而PCr下降约 35%，下降幅度比Langendorff心脏(约10%)稍大。主要血流动力学指标HR，LVDP和RPP在灌流 30min 后趋于稳定，+dp/dtmax和HR在灌流开始 50min 后趋于稳定，灌注 2 h 后LVDP和RPP略有下降，冠脉流量从 11.5ml/min 降至 8.5ml/min。以上数据说明，等容大鼠心脏在NMR实验条件下具有较好的稳定性，能够满足通常的实验需要。
图2 大鼠心脏在 2 h 灌流过程中血流动力学参数和高能磷化物的变化
, 百拇医药 —▲—+dp/dtmax，(kPa/s)，—△—HR(beats/min)，—●—ATP(%初始值)，—○—PCr(%初始值)，—◆—RPP×10-2(kPa beats/min)，—◇—LVDP(kPa)
* “九五”军队卫生科研基金资助项目，批准号 96M042
参考文献
[1]程增江，董华进.离体灌流心脏的31P-核磁共振观测及其在心血管药理学研究中的应用.国外医学(药学分册)，1997,24(1)：1
[2]Cheng Zeng-Jiang,Du Ze-Han. Phosphorus-31 nuclearmagnetic resonance spectroscopy of isolated hearts. 波谱学杂志， 1997，14(1)：81
, 百拇医药
[3]程增江，杜泽涵，董华进等.Langendorff灌流心脏的31P NMR谱测定.波谱学杂志，1996，13(5)：411
[4]程增江，杜泽涵，董华进等.缺血及再灌注大鼠心肌细胞内pH的31P核磁共振测定.军事医学科学院院刊，1996，20(3)：161
[5]Cheng Zeng-Jiang,Du Ze-Han,Feng-Rui et al. 31P-NMR studies of protective effects on the ischemicreperfused ratmyocardium with verapamil pre-ischemic treatment. 波谱学杂志，1997，14(4)：291
[6]Werrmann JG,Cohen SM.comparision of effects of angiotensin-convering enzyme inhibition with those of angiotention Ⅱ receptor antagonism on functional andmetabolic recovery in postischemic working rat heart as studied by [31P] nuclearmagnetic resonance. Jcardiovasc Pharmacol,1994,24:573
, 百拇医药
[7]Abe H.mechnanics and energetics of overstretch:the relationship of altered left ventricular volume to the Frand-Starlingmechanism and phosphorylation potential. Am Heart J,1988,116:447
[8]GormanmW,HemX,Sparks HV et al. Adenosine formation during hypoxia in isolated hearts:effect of adrenergic blockade. Jmolcellcardiol,1994,26:1613
[9]Hanem S,Gronas T,Holten T et al. Intracelluar pHmeasured by 31P-NMR in isolated rat heart during alpha-1-adrenoceptor stimulation. Jmolcellcardiol,1994,26:669
[10]Clarke K,Anderson RE,Nedelec JF et al. Intracellular and extracellular spaces and the direct quantification ofmolar intracellularconcentrations of phosphorusmetabolites in the isolated rat heart using 31P NMR spectroscopy and phosphonatemarkers.magn Resonmed,1994,32:181
(1998—10—16收稿，1998—12—08修回), 百拇医药
单位：程增江：解放军总医院微量元素研究室，北京 100853；杜泽涵 冯锐 李光玉：军事医学科学院国家生物医学分析中心，北京 100850；李红昕：山东省立医院心外科，济南 250021；董华进：军事医学科学院毒物药物研究所
关键词：核磁共振；离体心脏；血流动力学
军医进修学院学报990214 摘要 目的：在核磁共振谱仪上建立对同一大鼠心脏机械功能与能量代谢同时测定的技术方法。方法：制备离体等容大鼠心脏模型，通过建立计算机心功能监测系统测量和分析心脏的血流动力学参数；利用心脏的磷-31核磁共振(31P-NMR)谱观测心肌组织的能量代谢。结果：在所建NMR等容心脏模型上，心脏的机械和代谢功能可以实时、动态观测，且在实验结束后即可得到整个实验过程中心脏的血流动力学数据和心肌能量代谢的数据；离体大鼠心脏在NMR实验条件下具有较好的稳定性。结论：所建立的对等容大鼠心脏同时进行NMR和血流动力学观测的实验模型为国内基础心血管医学的研究提供了先进的技术手段。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 O 482.532
Simultaneous observations of hemodynamics and energymetabolism in isovolumic rat heartmodel
Cheng Zengjiang,Du Zehan,Li Hongxin,Dong Huajin,Feng Rui,Li Guangyu (Trace Element Research Laboratory,General Hospitial of PLA,Beijing 100853)
Abstract Objective:To establish a technique for simultaneous observations ofmechanical functions and energymetabolic status in the isolated rat heartmodel.Methods:Isolated isovolumic rat heartmodels were prepared,heart hemodynamic parameters were determined and processed bymeans of establishing acomputerized heart functionmonitoring system,andmyocardial energymetabolism was investigated bycollecting 31P NMR spectra.Results:By establishing the NMR isovolumic rat heart preparation,themechanical andmetabolic functions of the heart were sequentially observed on real-time,and all the hemodynamic andmyocardial energymetabolic datacould be obtained just after the experiments finished.meanwhile ,the heart preparations were found to be stable under the NMR experimentalconditions.conclusion:The established isovolumic rat heart preparations for simultaneous NMR and hemodynamic determinationsmay provide advanced techniques that are very useful for domestic findamental researches incardiovascularmedicine.
, 百拇医药
Key words NMR;isolated heart;hemodynamics
测定离体心脏的磷-31 核磁共振(31P-NMR)谱，可以在接近正常生理状态的情况下对心肌细胞内的多种能量代谢物质如磷酸肌酸(PCr)、ATP、无机磷酸盐以及心肌细胞内的pH值进行连续动态观测〔1，2〕。前文〔3，4〕我们曾报道了在立式窄孔磁体的 400mHz 超导核磁共振谱仪上进行Langendorff灌流心脏31P NMR谱测定的方法，并以此方法研究了维拉帕米对大鼠心脏缺血/再灌注损伤的保护作用〔5〕。由于NMR是一种非损伤性的测定方法，故而可以在NMR谱仪上同时测定同一心脏的功能与代谢。我们在前期工作的基础上，利用等容大鼠心脏模型实现了心脏血流动力学与31P-NMR谱的同步观测，从而能够直接考察同一心脏在实验过程中机械功能和自身代谢之间的关系。而以往只能对不同心脏分别进行功能和代谢的测定，或是对同一心脏先测定机械功能再经过冷冻、匀浆提取等处理后再进行生化代谢方面的测定，这不仅大大增加了实验的工作量，而且经过冷冻等处理后的心肌已经不再是生理状态，其细胞的代谢状态可能已经发生较大改变。本文所建立的对大鼠心脏功能、代谢进行连续动态观测的实验方法无疑为国内基础心血管医学的研究提供了新的技术手段。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器 磷酸肌酸(PCr)和亚甲基二膦酸(MDP)为Sigma公司产品；95% O2 和 5%cO2 混合气体，北京分析仪器厂温泉气体厂；硫化胶乳液，北京乳胶厂；其它常规试剂为分析纯级。JNM GX-400 型超导核磁共振谱仪及 25mm 31P 探头，日本电子公司；YH-1 型压力传感器，北京航天航空医学研究所；模/数(A/D)转换器，上海喜龙教学仪器厂；XY-1 型血压放大器，上海喜龙教学仪器厂；奔腾 586 微机，IBM兼容机；CARDIO 2 左心室内压分析软件，上海医科大学生理教研室；电磁阀：PQ22DF，北京自动经仪表七厂。
1.2 Wistar大鼠，雌雄兼用 (260～300 g)，按前文〔3〕所述方法制备Langendorff灌流大鼠心脏，用 16 号针头在左心室尖部扎一小孔，用以排出回流至心室的液体；再在左心耳中间剪一小口，从该口处将充水的、头部带一薄壁乳胶小球的塑料导管(Φ＝1.5mm) 经二尖瓣插入左心室。插入导管前先将乳胶球中的水 (100 μl) 转至三通阀上的微量注射器中，待乳胶球到达左心室合适位置后，将微量注射器中的水再充入乳胶球中，然后将导管结扎固定在心耳切口处。导管的另一端经一三通阀与压力传感器相联。信号放大后经模/数(A/D)转换接口到达计算机对血流动力学数据进行采集与分析。模/数转换器字长 8 位，转换电压 0～5 V，转换时间 15 μs，最大采样速率为 50 kHz。采用CARDIO 2 左心室内压分析软件实时测量如下血流动力学指标：收缩压，舒张末期压(LVEDP)，左心室发展压(Left ventricular developed pressure,LVDP)，室内压最大上升速率(+dp/dtmax)，室内压最大下降速率(-dp/dtmax)，心率(HR)以及心率室内压乘积(Rate and pressure product,RPP)。用量筒定时收集 1min 内由蠕动泵排出的冠脉流出液作为冠脉流量。
, 百拇医药
将制备好的灌流心脏固定于 25mm 外径的测试管中并置于磁体中探头线圈所在的位置按前文〔3，4〕所述方法进行NMR测定，使用电磁阀自动保持灌流液液面高度 110cm 以维持恒定的灌注压 10.8 kPa。
图 1 是我们在NMR谱仪进行心脏功能与代谢测定的实验装置示意图。
图1 等容大鼠心脏功能与代谢同步测定的实验装置示意图
3 结果和讨论
3.1 NMR等容大鼠心脏模型 通常使用的心脏灌流模型都可用于NMR测定。简单的Langendorff心脏只能进行代谢研究；工作心脏能够模仿心脏的生理做功，并可在NMR谱仪上同时观测心脏的功能与代谢〔6〕。但如前所述，由于装置复杂，操作较为困难，使用也较少；等容心脏是在Langerndorff心脏的基础上使心室相对于一充水乳胶小球进行等容收缩，其优点是可以利用Starling曲线研究心脏固有的收缩性能〔7〕。在国外，等容心脏模型是一种应用非常广泛的离体心脏模型〔8～10〕，然而该模型在国内却很少见有使用。
, 百拇医药
由于没有商品化的用于等容心脏实验的乳胶球，我们自制玻璃模具，使用硫化胶乳液和陶土粘合剂，经过反复摸索，制做了厚薄及大小较适合的顺应性好的乳胶气球。调节球中液体的体积可设置合适的LVEDP，文献中LVEDP一般采用 0.53～1.06 kPa，该压力构成了等容心脏模型中心脏的前负荷〔10〕。
3.2 计算机心功能监测系统 建立计算机心功能数据采集与分析系统，使得一个人能够进行整个离体心脏的NMR实验和心功能监测，并且在实验结束后即可得到整个实验过程中心脏的血流动力学数据和心肌能量代谢的数据。为此我们选用了上海嘉龙教学仪器厂SMUP-PC型生物信号处理系统中的A/D转换器，并与上海医科大学生理教研室合作开发了“CARDIO 2 左心室内压分析”软件。用该软件可方便、快捷地对实验过程中心脏的主要血流动力学参数进行记录、测量和分析，其主要特点是：①采用C语言与汇编语言编写，具有高速的实时处理能力。②选用于最能反映等容心脏功能的血流动力学参数：收缩压，LVDP(＝收缩压峰值-EDP)，+dp/dtmax，-dp/dtmax，HR以及RPP(＝LVD×HR)。引入LVDP和RPP这两个参数可以很好地反映心肌绝对收缩幅度和心室做功的大小。通过记录心室内压图形可随时对这些参数进行测量和分析。
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3.3 NMR灌流大鼠心脏的稳定性 图 2 为一等容大鼠心脏在 2 h 灌流过程中血流动力学参数和高能磷化物水平的变化情况，其中PCr和ATP的相对峰强度以灌注开始后 20～25min 所记的第一个谱中的数据作为 100%。从线性回归图线看，在 2 h 灌注期内ATP无明显变化，而PCr下降约 35%，下降幅度比Langendorff心脏(约10%)稍大。主要血流动力学指标HR，LVDP和RPP在灌流 30min 后趋于稳定，+dp/dtmax和HR在灌流开始 50min 后趋于稳定，灌注 2 h 后LVDP和RPP略有下降，冠脉流量从 11.5ml/min 降至 8.5ml/min。以上数据说明，等容大鼠心脏在NMR实验条件下具有较好的稳定性，能够满足通常的实验需要。
图2 大鼠心脏在 2 h 灌流过程中血流动力学参数和高能磷化物的变化
, 百拇医药 —▲—+dp/dtmax，(kPa/s)，—△—HR(beats/min)，—●—ATP(%初始值)，—○—PCr(%初始值)，—◆—RPP×10-2(kPa beats/min)，—◇—LVDP(kPa)
* “九五”军队卫生科研基金资助项目，批准号 96M042
参考文献
[1]程增江，董华进.离体灌流心脏的31P-核磁共振观测及其在心血管药理学研究中的应用.国外医学(药学分册)，1997,24(1)：1
[2]Cheng Zeng-Jiang,Du Ze-Han. Phosphorus-31 nuclearmagnetic resonance spectroscopy of isolated hearts. 波谱学杂志， 1997，14(1)：81
, 百拇医药
[3]程增江，杜泽涵，董华进等.Langendorff灌流心脏的31P NMR谱测定.波谱学杂志，1996，13(5)：411
[4]程增江，杜泽涵，董华进等.缺血及再灌注大鼠心肌细胞内pH的31P核磁共振测定.军事医学科学院院刊，1996，20(3)：161
[5]Cheng Zeng-Jiang,Du Ze-Han,Feng-Rui et al. 31P-NMR studies of protective effects on the ischemicreperfused ratmyocardium with verapamil pre-ischemic treatment. 波谱学杂志，1997，14(4)：291
[6]Werrmann JG,Cohen SM.comparision of effects of angiotensin-convering enzyme inhibition with those of angiotention Ⅱ receptor antagonism on functional andmetabolic recovery in postischemic working rat heart as studied by [31P] nuclearmagnetic resonance. Jcardiovasc Pharmacol,1994,24:573
, 百拇医药
[7]Abe H.mechnanics and energetics of overstretch:the relationship of altered left ventricular volume to the Frand-Starlingmechanism and phosphorylation potential. Am Heart J,1988,116:447
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[9]Hanem S,Gronas T,Holten T et al. Intracelluar pHmeasured by 31P-NMR in isolated rat heart during alpha-1-adrenoceptor stimulation. Jmolcellcardiol,1994,26:669
[10]Clarke K,Anderson RE,Nedelec JF et al. Intracellular and extracellular spaces and the direct quantification ofmolar intracellularconcentrations of phosphorusmetabolites in the isolated rat heart using 31P NMR spectroscopy and phosphonatemarkers.magn Resonmed,1994,32:181
(1998—10—16收稿，1998—12—08修回), 百拇医药