3种低温保存板层角膜移植材料的电镜观察*
作者：蓝平 高明宏 姜彩辉 阎玲 王世贤 孟彤柏
单位：蓝平 高明宏 阎玲 王世贤 孟彤柏：沈阳军区总医院眼科，沈阳 110015；姜彩辉：解放军总医院眼科，北京 100853
关键词：角膜；低温保存；超微结构
3种低温保存板层角膜移植材料的电镜观察 摘要 目的：评价低温保存板层角膜移植材料的效果。方法：将 15 只人尸角膜分三组保存 2 年： 4℃ 甘油脱水法、角膜液氮冷冻法、全眼球液氮冷冻法。并做透射电镜观察。结果：第一组中，角膜胶原纤维排列紊乱、疏松，缺乏连续性，可见广纤维变性，纤维间可见极低电子密度灶。第二组中，角膜胶原纤维排列规则、连续，电子密度均匀，纤维间可见散在扩大的空隙，呈低电子密度灶。第三组中，角膜胶原纤维排列规则、连续，电子密度欠均匀，纤维间隙增大，可见弥漫的电子密度减低灶。结论：对一般治疗性板层角膜移植，可选用全眼球液氮冷冻法，因这种方法简便易行效果较好。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R 779.6
Electronic microscopic observation of cornea preserved at low temperature for lamellar keratoplasty
Lan Ping,Gao Minghong,Jiang Caihui,YanLing,Wang Shixian,Meng Tongbai (Department of Ophthalmology,General Arymhospital of Shenyang Region,Shenyang 110015)
Abstract Objective:To evaluate the effects of corneal preservation for lamellar keratoplasty at low temperature.Methods:The corneas (15human eyes) were preserved under three conditions:Group 1,preserved in glycerine at 4℃,group 2,cryopreserved at -196℃ and group 3 eyeball cryopreserved at -196℃. The ultrastructural changes of the corneas preserved for two years in each group were studied by transmisson electron microscopy.Results:The corneal collagen fibres in the first group were irregularly arranged,loosened and disconnected with difuse fibre degeneration. In the second group,the corneal collageng fibres were regularly arranged with normal electron density. Interfibral spaces were sporadicly dilated with lower electron density. In the third group,the electron density of corneal collagen fibres were uneven with dilated and low electron-densed interfibral spaces. Conclusion:The corneas cryopreserved at -196℃ are ideal materials for optical lamellar keratoplasty. For generally theraputical lamellar keratoplasty,eyeball cryopressrved at -196℃ is recommended,because this method is easy and effective.
, 百拇医药
Key words cornea; cryopreservation; ultrastructure
自1987年以来，我院眼库先后采用了 4℃ 低温甘油脱水法、角膜片液氮冷冻法、全眼球液氮冷冻法保存板层角膜移植材料，并对这 3 种方法保存的板层角膜材料的支架结构做了透射电镜对比观察，国内外尚无同样报道。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 角膜材料和保存 于供体(18～34 岁)猝死后1h 内无菌操作摘除眼球，湿房内保存送回眼库，湿房保存时间<6h。低温保存前，用含有庆大霉素的生理盐水(1 万 U/100 ml)冲洗眼球 1 次，再用生理盐水冲洗 2 次。然后按照下述方法进行低温保存。
1.1.1 甘油脱水法 制作角膜片后，将角膜片置入95%的灭菌甘油 5 ml 瓶内脱水 24h，然后转移至另一瓶同样的甘油中，胶纸封口，4℃ 冰箱保存。
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1.1.2 角膜片液氮冷冻法 制作带有 1mm 巩膜环的角膜片，按“简化四步法”〔1〕进行低温保存。使用时在 40℃ 水浴中复温。
1.1.3 全眼球液氮冷冻法 用 1 ml 注射器抽空房水，然后将眼球角膜面朝上放入无菌塑料胶卷盒内，并将塑料盒装入绸布袋中，标记后移入液氮中保存。使用时将盛装眼球的胶卷盒取出，移入 60℃ 水浴中复温约 10 min，使眼球完全解融，然后用含有庆大霉素的生理盐水(1 万 U/100ml)冲洗眼球后，再用生理盐水冲洗。复温后的眼球很软，可经残留的视神经断端向眼内注入消毒空气，使眼球保持一定硬度，再制作角膜片。
1.2 透射电镜标本制作 在三种方法的角膜材料中，各取 2 只角膜，保存时间均为 2 年。经 3.1% 戊二醛及 1% 锇酸双固定，丙酮脱水，Epon 812包埋，LKB 8800型切片机超薄切片，柠檬酸铅及醋酸铀双重染色，在Philips CM 10 透射电镜下观察。
, 百拇医药
2 结果
4℃低温甘油脱水法保存的 5 只角膜胶原纤维排列紊乱、疏松，纤维组织缺乏连续性，可见广泛纤维变性和崩解，纤维间可见极低电子密度灶。角膜片液氮冷冻法保存的 5 只角膜胶原纤维排列规则，电子密度均匀、清晰，纤维组织连续，纤维间可见散在的空隙扩大和电子密度减低灶。全眼球液氮冷冻法保存的 2 只角膜胶原纤维排列规则，纤维组织连续，电子密度欠均匀，纤维间隙增大，可见弥漫的电子密度减低灶。
3 讨论
经4℃ 低温甘油脱水法保存的角膜组织，属于非活性组织。一般认为，这种方法保持支架完整的保存时间为半年。但国内一些学者报告，应用保存 1 年以上的角膜材料行板层移植获得成功〔2〕，其中最长保存时间为 5 年〔3〕。本文电镜结果表明，这种方法保存 2 年的角膜组织板层结构已经不完整，支架结构严重破坏，板层移植术后很难起支架作用和保持一定的远期透明率，更不适用于光学性板层角膜移植。
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本文报道的角膜片液氮冷冻法，是一种角膜活组织保存方法。国内学者报道〔4〕，经电镜证实，“简化二步法”液氮低温保存的角膜实质板层中的胶原纤维未发生特殊改变。本文电镜结果表明，“简化四步法”液氮保存的角膜材料支架结构在三种方法中改变最轻，可代替新鲜角膜材料，充当光学性角膜移植材料。
全眼球液氮冷冻方法是近年来受到国内学者重视的一种简易保存板层角膜移植材料的方法〔5〕。本文电镜结果表明，保存 2 年的角膜支架结构基本完整，超微结构改变明显轻于经 4℃ 低温甘油脱水法。我院应用该方法保存的角膜材料行治疗性板层角膜移植获得成功〔5〕。
角膜实质层主要由胶原纤维支架构成，保存板层角膜移植材料关键在于保持胶原纤维支架结构的完整性。维持角膜组织的脱水状态，对防止胶原纤维发生变性至关重要。一般认为，低温冷冻会使组织发生脱水，温度越低，脱水程度越重。 4℃ 温度下，角膜组织很难达到理想的脱水程度，而甘油也不易使角膜完全脱水，因此 4℃ 低温甘油脱水法保存角膜时间不宜过长。国外一些眼库采用冻干法保存板层角膜材料，能获得理想的保存效果，但昂贵的设备和特定的技术操作。液氮温度(-196℃)在医学上属于超低温，能使角膜实质层迅速脱水，其脱水程度近于冻干方法，适合长期保存组织，本文结果也证实了这点。
, 百拇医药
在液氮冷冻保存角膜片方法中，由于采用了冷冻保护剂和速率降温，因此角膜组织在脱水同时减轻了冷冻对组织的损伤，其超微结构的改变轻于全眼球直接冷冻，但技术操作比后者复杂得多，仅限于有较大规模眼库的单位采用。由此可见，在需要采用长期保存的角膜材料时，对材料质量要求严格的光学性板层角膜移植，应首选角膜片液氮冷冻法保存的角膜材料；对一般治疗性板层角膜移植，可选用全眼球液氮冷冻法保存的角膜材料，因这种方法简便易行。
* “九五”军队医药卫生科研基金资助项目，批准号 Q-96001
参考文献
[1]高明宏，蓝 平，陈 伟等.“简化四步法”冻贮角膜技术的实验研究.沈阳部队医药，1998，11(2)：101
[2]谢立信.甘油脱水保存角膜行板层移植的研究.眼科研究，1983，1：91
[3]李凤鸣主编.眼科全书.北京：人民卫生出版社，1996.1465
[4]石珍荣，周惠民，王传富.低温冷冻保存角膜的超微结构观察.青岛医学院学报，1989，25(1)：18
[5]吴振中，蒋幼芹主编.眼科手术学.北京：人民卫生出版社，1994.136
(1998—11—05收稿，1998—12—18修回), http://www.100md.com
单位：蓝平 高明宏 阎玲 王世贤 孟彤柏：沈阳军区总医院眼科，沈阳 110015；姜彩辉：解放军总医院眼科，北京 100853
关键词：角膜；低温保存；超微结构
3种低温保存板层角膜移植材料的电镜观察 摘要 目的：评价低温保存板层角膜移植材料的效果。方法：将 15 只人尸角膜分三组保存 2 年： 4℃ 甘油脱水法、角膜液氮冷冻法、全眼球液氮冷冻法。并做透射电镜观察。结果：第一组中，角膜胶原纤维排列紊乱、疏松，缺乏连续性，可见广纤维变性，纤维间可见极低电子密度灶。第二组中，角膜胶原纤维排列规则、连续，电子密度均匀，纤维间可见散在扩大的空隙，呈低电子密度灶。第三组中，角膜胶原纤维排列规则、连续，电子密度欠均匀，纤维间隙增大，可见弥漫的电子密度减低灶。结论：对一般治疗性板层角膜移植，可选用全眼球液氮冷冻法，因这种方法简便易行效果较好。
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中国图书资料分类法分类号 R 779.6
Electronic microscopic observation of cornea preserved at low temperature for lamellar keratoplasty
Lan Ping,Gao Minghong,Jiang Caihui,YanLing,Wang Shixian,Meng Tongbai (Department of Ophthalmology,General Arymhospital of Shenyang Region,Shenyang 110015)
Abstract Objective:To evaluate the effects of corneal preservation for lamellar keratoplasty at low temperature.Methods:The corneas (15human eyes) were preserved under three conditions:Group 1,preserved in glycerine at 4℃,group 2,cryopreserved at -196℃ and group 3 eyeball cryopreserved at -196℃. The ultrastructural changes of the corneas preserved for two years in each group were studied by transmisson electron microscopy.Results:The corneal collagen fibres in the first group were irregularly arranged,loosened and disconnected with difuse fibre degeneration. In the second group,the corneal collageng fibres were regularly arranged with normal electron density. Interfibral spaces were sporadicly dilated with lower electron density. In the third group,the electron density of corneal collagen fibres were uneven with dilated and low electron-densed interfibral spaces. Conclusion:The corneas cryopreserved at -196℃ are ideal materials for optical lamellar keratoplasty. For generally theraputical lamellar keratoplasty,eyeball cryopressrved at -196℃ is recommended,because this method is easy and effective.
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Key words cornea; cryopreservation; ultrastructure
自1987年以来，我院眼库先后采用了 4℃ 低温甘油脱水法、角膜片液氮冷冻法、全眼球液氮冷冻法保存板层角膜移植材料，并对这 3 种方法保存的板层角膜材料的支架结构做了透射电镜对比观察，国内外尚无同样报道。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 角膜材料和保存 于供体(18～34 岁)猝死后1h 内无菌操作摘除眼球，湿房内保存送回眼库，湿房保存时间<6h。低温保存前，用含有庆大霉素的生理盐水(1 万 U/100 ml)冲洗眼球 1 次，再用生理盐水冲洗 2 次。然后按照下述方法进行低温保存。
1.1.1 甘油脱水法 制作角膜片后，将角膜片置入95%的灭菌甘油 5 ml 瓶内脱水 24h，然后转移至另一瓶同样的甘油中，胶纸封口，4℃ 冰箱保存。
, http://www.100md.com
1.1.2 角膜片液氮冷冻法 制作带有 1mm 巩膜环的角膜片，按“简化四步法”〔1〕进行低温保存。使用时在 40℃ 水浴中复温。
1.1.3 全眼球液氮冷冻法 用 1 ml 注射器抽空房水，然后将眼球角膜面朝上放入无菌塑料胶卷盒内，并将塑料盒装入绸布袋中，标记后移入液氮中保存。使用时将盛装眼球的胶卷盒取出，移入 60℃ 水浴中复温约 10 min，使眼球完全解融，然后用含有庆大霉素的生理盐水(1 万 U/100ml)冲洗眼球后，再用生理盐水冲洗。复温后的眼球很软，可经残留的视神经断端向眼内注入消毒空气，使眼球保持一定硬度，再制作角膜片。
1.2 透射电镜标本制作 在三种方法的角膜材料中，各取 2 只角膜，保存时间均为 2 年。经 3.1% 戊二醛及 1% 锇酸双固定，丙酮脱水，Epon 812包埋，LKB 8800型切片机超薄切片，柠檬酸铅及醋酸铀双重染色，在Philips CM 10 透射电镜下观察。
, 百拇医药
2 结果
4℃低温甘油脱水法保存的 5 只角膜胶原纤维排列紊乱、疏松，纤维组织缺乏连续性，可见广泛纤维变性和崩解，纤维间可见极低电子密度灶。角膜片液氮冷冻法保存的 5 只角膜胶原纤维排列规则，电子密度均匀、清晰，纤维组织连续，纤维间可见散在的空隙扩大和电子密度减低灶。全眼球液氮冷冻法保存的 2 只角膜胶原纤维排列规则，纤维组织连续，电子密度欠均匀，纤维间隙增大，可见弥漫的电子密度减低灶。
3 讨论
经4℃ 低温甘油脱水法保存的角膜组织，属于非活性组织。一般认为，这种方法保持支架完整的保存时间为半年。但国内一些学者报告，应用保存 1 年以上的角膜材料行板层移植获得成功〔2〕，其中最长保存时间为 5 年〔3〕。本文电镜结果表明，这种方法保存 2 年的角膜组织板层结构已经不完整，支架结构严重破坏，板层移植术后很难起支架作用和保持一定的远期透明率，更不适用于光学性板层角膜移植。
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本文报道的角膜片液氮冷冻法，是一种角膜活组织保存方法。国内学者报道〔4〕，经电镜证实，“简化二步法”液氮低温保存的角膜实质板层中的胶原纤维未发生特殊改变。本文电镜结果表明，“简化四步法”液氮保存的角膜材料支架结构在三种方法中改变最轻，可代替新鲜角膜材料，充当光学性角膜移植材料。
全眼球液氮冷冻方法是近年来受到国内学者重视的一种简易保存板层角膜移植材料的方法〔5〕。本文电镜结果表明，保存 2 年的角膜支架结构基本完整，超微结构改变明显轻于经 4℃ 低温甘油脱水法。我院应用该方法保存的角膜材料行治疗性板层角膜移植获得成功〔5〕。
角膜实质层主要由胶原纤维支架构成，保存板层角膜移植材料关键在于保持胶原纤维支架结构的完整性。维持角膜组织的脱水状态，对防止胶原纤维发生变性至关重要。一般认为，低温冷冻会使组织发生脱水，温度越低，脱水程度越重。 4℃ 温度下，角膜组织很难达到理想的脱水程度，而甘油也不易使角膜完全脱水，因此 4℃ 低温甘油脱水法保存角膜时间不宜过长。国外一些眼库采用冻干法保存板层角膜材料，能获得理想的保存效果，但昂贵的设备和特定的技术操作。液氮温度(-196℃)在医学上属于超低温，能使角膜实质层迅速脱水，其脱水程度近于冻干方法，适合长期保存组织，本文结果也证实了这点。
, 百拇医药
在液氮冷冻保存角膜片方法中，由于采用了冷冻保护剂和速率降温，因此角膜组织在脱水同时减轻了冷冻对组织的损伤，其超微结构的改变轻于全眼球直接冷冻，但技术操作比后者复杂得多，仅限于有较大规模眼库的单位采用。由此可见，在需要采用长期保存的角膜材料时，对材料质量要求严格的光学性板层角膜移植，应首选角膜片液氮冷冻法保存的角膜材料；对一般治疗性板层角膜移植，可选用全眼球液氮冷冻法保存的角膜材料，因这种方法简便易行。
* “九五”军队医药卫生科研基金资助项目，批准号 Q-96001
参考文献
[1]高明宏，蓝 平，陈 伟等.“简化四步法”冻贮角膜技术的实验研究.沈阳部队医药，1998，11(2)：101
[2]谢立信.甘油脱水保存角膜行板层移植的研究.眼科研究，1983，1：91
[3]李凤鸣主编.眼科全书.北京：人民卫生出版社，1996.1465
[4]石珍荣，周惠民，王传富.低温冷冻保存角膜的超微结构观察.青岛医学院学报，1989，25(1)：18
[5]吴振中，蒋幼芹主编.眼科手术学.北京：人民卫生出版社，1994.136
(1998—11—05收稿，1998—12—18修回), http://www.100md.com