紫杉醇增敏放射对培养的胶质母细胞瘤细胞凋亡和增殖活性的影响
作者：修波 段国升 刘宗惠 薛毅珑
单位：刘宗惠 修波：海军总医院神经外科，北京 100037；段国升 薛毅珑：解放军总医院，北京 100853
关键词：紫杉醇；放射增敏；胶质母细胞瘤；凋亡；AgNORs
军医进修学院学报990205 摘要 目的：探讨紫杉醇增敏放射对胶质母细胞瘤细胞凋亡和增殖活性的影响。方法：采用人胶质母细胞瘤细胞系BT325。 ① 细胞经紫杉醇和(或)照射处理后，每 6h 收集一批细胞，至 48h 结束。行流式细胞术细胞凋亡分析。 ② 细胞经紫杉醇和(或)照射处理后，培养 4d，作嗜银染色、AgNOR计数。结果：照射后 24h 出现凋亡率高峰；紫杉醇加照射组的凋亡率高于单纯照射组，尤其是较低剂量照射 (2 和 4Gy)时，相差更为显著。对照组、紫杉醇组、照射组和紫杉醇加照射组平均每个细胞的AgNOR数分别为 22.8、16.2、15.5 和 6.4。结论：紫杉醇能促进放射诱导的胶质母细胞瘤细胞凋亡。紫杉醇增敏放射后残存肿瘤细胞的增殖活性显著下降。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R 739.410.5
Influnce of taxol radiosensitization on apoptosis and proliferation ofGlioblastoma in vi-tro
Xiu Bo,duanGuosheng, Liu Zonghui, Xue Yilong (Department of Neurosurgery, NavyGeneralhospital of PLA, Beijing 100037)
Abstract Objective:Todetermine the influnce of taxol radiosensitization on apoptosis and proliferation ofGlioblastoma.Methods:1.Thecells treated with taxol or / and radiation (RT) wereharvested at 6h intervals within 48hours.Flowcytometry was performed to estimate the percentage of apoptosis.2.Thecells treated with taxol or / and RT were incubated for 4d, and then silver staining and AgNORscount were performed.Results:The peak incidence of apoptosis occurred at 24h after RT.The percentage of apoptosis in taxol plus RTGroup washigher than that in only RTGroup, especially whencells were irradiated with 2 to 4Gy.The numbers of AgNORs /cell were 22.8 incontrol, 16.2 in taxol, 15.5 in RT and 6.4 in taxol plus RTGroup respectively.Conclusion:Taxolmay enhance radiation-induced apoptosis.Proliferation ofGlioblastomacellscan be inhibited significantly by RT with taxol.
, 百拇医药
Key words taxol; radiosentizing;Glioblastoma; apoptosis; AgNORs
紫杉醇(Taxol)是一种新型抗癌药。近年来发现它除具有抗癌活性外，还可增强某些肿瘤的放射效应〔1〕。但紫杉醇对中枢神经系统肿瘤的放射增敏作用尚缺乏深入研究。为了从分子(DNA、蛋白质)水平上探讨紫杉醇增敏放射杀死胶质瘤细胞的方式、抑制肿瘤细胞增殖的机制，我们做了流式细胞术细胞凋亡分析及核仁组成区嗜银蛋白(AgNOR)银染计数研究。
1 材料和方法
1.1 ①人脑胶质母细胞瘤细胞系BT-325〔2〕；②紫杉醇(美国Sigma公司)；③IMDM培养基(美国Gibco公司，内含 15% 新生牛血清)；④DNA荧光探针碘化丙啶(PI， 美国Sigma公司)；⑤流式细胞仪(FACS420，美国BD公司)；⑥直线加速器(美国Varian,clinac 1800),X线， 8mV， 剂量率 400cGy/min。
, 百拇医药
1.2
1.2.1 流式细胞术细胞凋亡分析 将对数生长期的人胶质母细胞瘤细胞 5×106 个接种于 75cm2 的培养瓶中，用含 15% 新生牛血清的IMDM培养基培养 24h。随机将培养细胞分成对照组、紫杉醇组、照射组及紫杉醇+照射组。紫杉醇组和紫杉醇+照射组更换成含有 10 nM 紫杉醇的培养基 10ml；对照组和照射组仍用IMDM培养液 10ml，继续培养 24h。照射组和紫杉醇+照射组用直线加速器分别照射 2Gy、4Gy、6Gy、8 和 10Gy。于照射后 6h、12h、18h、24h、36h 和 48h 每组分别取两瓶，收集细胞。细胞用 0.1% RNA酶在 37℃ 恒温水浴中消化 30min；用PBS漂洗、离心后，加入 0.05% 碘化丙啶 1ml，振荡离散成单细胞悬液， 4℃ 下避光对DNA染色。最后，用尼龙网过滤标本，上机检测。用计算机软件分析凋亡比率。
1.2.2 AgNOR银染计数 培养细胞分组及紫杉醇处理方法同上。将照射组和紫杉醇+照射组用直线加速器照射 6Gy。照射后，各组培养细胞立即用胰酶消化。 IMDM培养液洗涤。接种 1 ×104 个细胞于 6cm 培养皿中的盖玻片上，37 ℃ 培养 4d。取出盖玻片立即用中性缓冲福尔马林固定。将盖玻片浸入胶质银工作液，暗室内室温下反应 45min。定影、脱水、透明、封片。×1000油镜下观察 100 个细胞，计算出每个细胞AgNOR的平均值。AgNOR的计数标准参照“1995年方案”〔3〕。
, 百拇医药
2 结果
2.1 细胞凋亡分析 细胞受照射后第 24h 不同照射剂量的细胞凋亡率达到高峰，而 6h、12h、18h、24h、36h 和 48h 时间点的细胞凋亡率均在 9% 以下。照射后 24h 时，各照射剂量点的细胞凋亡率明显高于对照组，细胞凋亡比率与照射剂量呈正相关。
2.2 AgNOR计数 AgNOR银染细胞核背景呈淡黄色，AgNOR呈黑色颗粒状，颗粒主要为核仁内型及弥散型(图 1、图 2)。对照组、照射组、紫杉醇组及紫杉醇+照射组的AgNOR计数分别为 22.8、16.2、15.5 和 6.4。
图1 对照组细胞嗜银染色 ×400
, 百拇医药
图2 紫杉醇+照射组细胞嗜银染色 ×400
3 讨论
3.1 紫杉醇放射增敏的机制 放射生物学研究表明：G1-S期肿瘤细胞具有高度抗放射线性。因此，促使肿瘤G1-S期细胞进入并停留在对放射线敏感的G2-M期，是提高肿瘤放射敏感性、改善疗效的一个重要途径〔4〕。在细胞增殖周期中，紫杉醇与微管亚单位中的微管蛋白牢固结合，促进微管聚合，抑制着丝点微管解聚，从而阻止染色体的移动及去极化，使细胞阻滞在晚G2-M期，主要在分裂后期〔5〕。此期的染色体已解散成染色单体，最易受射线损伤。这可能是紫杉醇增强肿瘤细胞放射反应的重要机制之一。
3.2 紫杉醇增敏放射诱发的肿瘤细胞凋亡 细胞死亡一般有两种方式，即细胞坏死(Necrosis)和细胞凋亡(Apoptosis)。过去，肿瘤放疗研究多集中在“细胞坏死”方面，目前已知放射能诱导肿瘤细胞凋亡，从而使我们对肿瘤放疗的机制、治疗技术的优化有了新的认识。放射诱发的凋亡是可以人为调控的，增加或撤除某些特定物质可以改变细胞的易感性，调控凋亡过程〔6〕。
, 百拇医药
放射诱发凋亡的潜伏期因不同细胞而异，但众多报道的肿瘤细胞潜伏期多为数小时，且不受放射剂量的影响。这是因为放射损伤作为凋亡过程的一种“扳机”，一旦扣动，凋亡便按照自身特定的动力学进行。本实验结果显示照射后 24h 凋亡达到高峰，增敏放射组的凋亡率(46.7%)高于单纯照射组(38.7%)，表明紫杉醇可增强肿瘤放射诱导的凋亡。但更有意义的是两组凋亡率曲线形状上的差异：单纯照射组在 8Gy 以上时出现平台；而增敏放射组的凋亡率则在较低剂量(2 和 4Gy)时升高更为明显， 6Gy 以上时出现平台。增敏放射组的凋亡特点十分重要，因为临床放疗的单次剂量一般约为 2Gy(后装间质照射的单次剂量为 5Gy)。这提示临床上采用分次照射可能获得更高的凋亡比率。两组出现凋亡率平台的原因可能是由于进一步提高照射剂量将导致细胞坏死而不是凋亡。
3.3 紫杉醇增敏放射对AgNOR的影响 AgNOR是位于核仁组成区的酸性非组蛋白。其作用是保持rDNA链的伸展，调节rDNA的转录，参与rRNA的加工与装配。近年来开展的AgNOR银染技术能够反映细胞内rDNA转录活性及细胞的增殖活性，增殖越旺盛的细胞其AgNOR计数亦越高〔7，8〕。本实验结果显示人脑胶质母细胞瘤细胞系BT325 经紫杉醇增敏放射后，AgNOR的数量显著低于对照组、照射组及紫杉醇组。说明增敏放射除可杀死肿瘤细胞外，残存细胞的增殖活性亦明显下降；紫杉醇增敏放射抑制肿瘤细胞增殖活性的作用大于单纯照射或单用紫杉醇。由于rDNA转录活性下降，rRNA合成减少，残存细胞的亚致死损伤及潜在致死性损伤的修复能力亦下降。这提示我们，经过适宜的多次增敏照射后，部分残存细胞可因亚致死损伤的积累而被杀死。
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参考文献
[1]Liebmann J,cook JA, Fisher J et al.In vitro studies of taxol as a radiation sensitizer inhuman tumorcells.J Natcaner Inst, 1994,86:441
[2]邵文钊.人脑多形胶质母细胞瘤细胞系BT325.细胞生物学杂志，1985，7：92
[3]许良中.关于核仁组织区(AgNOR)研究工作的标准化方案.癌症，1996，15：75
[4]Rubin LL, philpott KL, Brooks SF.Thecellcycle andcelldeath.Curr Biol, 1993,3:391
[5]Foa R, Norton L, Seidman AD.Taxol (paclitaxel):Anovel anti-microtubule agent with remarkable anti-neoplastic activity.Int Jclin Lab Res, 1994,24:6
, http://www.100md.com
[6]AllandJ.Radiation-induced apoptosis:its role in aMADCaT(mitosis-differentiation-calcium toxicity)shceme ofcytotoxicitymechanisms.Iint J Radiat biol, 1992,62:145
[7]徐根兴.定量细胞学化学技术.长春：吉林科学技术出版社，1993.202～204
[8]李峰，浦佩玉，彭 琼 等.加温对人脑多形胶质母细胞瘤体外细胞株增殖的影响.癌症，1995，14：109
(1998—09—23收稿，1998—11—15修回), 百拇医药
单位：刘宗惠 修波：海军总医院神经外科，北京 100037；段国升 薛毅珑：解放军总医院，北京 100853
关键词：紫杉醇；放射增敏；胶质母细胞瘤；凋亡；AgNORs
军医进修学院学报990205 摘要 目的：探讨紫杉醇增敏放射对胶质母细胞瘤细胞凋亡和增殖活性的影响。方法：采用人胶质母细胞瘤细胞系BT325。 ① 细胞经紫杉醇和(或)照射处理后，每 6h 收集一批细胞，至 48h 结束。行流式细胞术细胞凋亡分析。 ② 细胞经紫杉醇和(或)照射处理后，培养 4d，作嗜银染色、AgNOR计数。结果：照射后 24h 出现凋亡率高峰；紫杉醇加照射组的凋亡率高于单纯照射组，尤其是较低剂量照射 (2 和 4Gy)时，相差更为显著。对照组、紫杉醇组、照射组和紫杉醇加照射组平均每个细胞的AgNOR数分别为 22.8、16.2、15.5 和 6.4。结论：紫杉醇能促进放射诱导的胶质母细胞瘤细胞凋亡。紫杉醇增敏放射后残存肿瘤细胞的增殖活性显著下降。
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中国图书资料分类法分类号 R 739.410.5
Influnce of taxol radiosensitization on apoptosis and proliferation ofGlioblastoma in vi-tro
Xiu Bo,duanGuosheng, Liu Zonghui, Xue Yilong (Department of Neurosurgery, NavyGeneralhospital of PLA, Beijing 100037)
Abstract Objective:Todetermine the influnce of taxol radiosensitization on apoptosis and proliferation ofGlioblastoma.Methods:1.Thecells treated with taxol or / and radiation (RT) wereharvested at 6h intervals within 48hours.Flowcytometry was performed to estimate the percentage of apoptosis.2.Thecells treated with taxol or / and RT were incubated for 4d, and then silver staining and AgNORscount were performed.Results:The peak incidence of apoptosis occurred at 24h after RT.The percentage of apoptosis in taxol plus RTGroup washigher than that in only RTGroup, especially whencells were irradiated with 2 to 4Gy.The numbers of AgNORs /cell were 22.8 incontrol, 16.2 in taxol, 15.5 in RT and 6.4 in taxol plus RTGroup respectively.Conclusion:Taxolmay enhance radiation-induced apoptosis.Proliferation ofGlioblastomacellscan be inhibited significantly by RT with taxol.
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Key words taxol; radiosentizing;Glioblastoma; apoptosis; AgNORs
紫杉醇(Taxol)是一种新型抗癌药。近年来发现它除具有抗癌活性外，还可增强某些肿瘤的放射效应〔1〕。但紫杉醇对中枢神经系统肿瘤的放射增敏作用尚缺乏深入研究。为了从分子(DNA、蛋白质)水平上探讨紫杉醇增敏放射杀死胶质瘤细胞的方式、抑制肿瘤细胞增殖的机制，我们做了流式细胞术细胞凋亡分析及核仁组成区嗜银蛋白(AgNOR)银染计数研究。
1 材料和方法
1.1 ①人脑胶质母细胞瘤细胞系BT-325〔2〕；②紫杉醇(美国Sigma公司)；③IMDM培养基(美国Gibco公司，内含 15% 新生牛血清)；④DNA荧光探针碘化丙啶(PI， 美国Sigma公司)；⑤流式细胞仪(FACS420，美国BD公司)；⑥直线加速器(美国Varian,clinac 1800),X线， 8mV， 剂量率 400cGy/min。
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1.2
1.2.1 流式细胞术细胞凋亡分析 将对数生长期的人胶质母细胞瘤细胞 5×106 个接种于 75cm2 的培养瓶中，用含 15% 新生牛血清的IMDM培养基培养 24h。随机将培养细胞分成对照组、紫杉醇组、照射组及紫杉醇+照射组。紫杉醇组和紫杉醇+照射组更换成含有 10 nM 紫杉醇的培养基 10ml；对照组和照射组仍用IMDM培养液 10ml，继续培养 24h。照射组和紫杉醇+照射组用直线加速器分别照射 2Gy、4Gy、6Gy、8 和 10Gy。于照射后 6h、12h、18h、24h、36h 和 48h 每组分别取两瓶，收集细胞。细胞用 0.1% RNA酶在 37℃ 恒温水浴中消化 30min；用PBS漂洗、离心后，加入 0.05% 碘化丙啶 1ml，振荡离散成单细胞悬液， 4℃ 下避光对DNA染色。最后，用尼龙网过滤标本，上机检测。用计算机软件分析凋亡比率。
1.2.2 AgNOR银染计数 培养细胞分组及紫杉醇处理方法同上。将照射组和紫杉醇+照射组用直线加速器照射 6Gy。照射后，各组培养细胞立即用胰酶消化。 IMDM培养液洗涤。接种 1 ×104 个细胞于 6cm 培养皿中的盖玻片上，37 ℃ 培养 4d。取出盖玻片立即用中性缓冲福尔马林固定。将盖玻片浸入胶质银工作液，暗室内室温下反应 45min。定影、脱水、透明、封片。×1000油镜下观察 100 个细胞，计算出每个细胞AgNOR的平均值。AgNOR的计数标准参照“1995年方案”〔3〕。
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2 结果
2.1 细胞凋亡分析 细胞受照射后第 24h 不同照射剂量的细胞凋亡率达到高峰，而 6h、12h、18h、24h、36h 和 48h 时间点的细胞凋亡率均在 9% 以下。照射后 24h 时，各照射剂量点的细胞凋亡率明显高于对照组，细胞凋亡比率与照射剂量呈正相关。
2.2 AgNOR计数 AgNOR银染细胞核背景呈淡黄色，AgNOR呈黑色颗粒状，颗粒主要为核仁内型及弥散型(图 1、图 2)。对照组、照射组、紫杉醇组及紫杉醇+照射组的AgNOR计数分别为 22.8、16.2、15.5 和 6.4。
图1 对照组细胞嗜银染色 ×400
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图2 紫杉醇+照射组细胞嗜银染色 ×400
3 讨论
3.1 紫杉醇放射增敏的机制 放射生物学研究表明：G1-S期肿瘤细胞具有高度抗放射线性。因此，促使肿瘤G1-S期细胞进入并停留在对放射线敏感的G2-M期，是提高肿瘤放射敏感性、改善疗效的一个重要途径〔4〕。在细胞增殖周期中，紫杉醇与微管亚单位中的微管蛋白牢固结合，促进微管聚合，抑制着丝点微管解聚，从而阻止染色体的移动及去极化，使细胞阻滞在晚G2-M期，主要在分裂后期〔5〕。此期的染色体已解散成染色单体，最易受射线损伤。这可能是紫杉醇增强肿瘤细胞放射反应的重要机制之一。
3.2 紫杉醇增敏放射诱发的肿瘤细胞凋亡 细胞死亡一般有两种方式，即细胞坏死(Necrosis)和细胞凋亡(Apoptosis)。过去，肿瘤放疗研究多集中在“细胞坏死”方面，目前已知放射能诱导肿瘤细胞凋亡，从而使我们对肿瘤放疗的机制、治疗技术的优化有了新的认识。放射诱发的凋亡是可以人为调控的，增加或撤除某些特定物质可以改变细胞的易感性，调控凋亡过程〔6〕。
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放射诱发凋亡的潜伏期因不同细胞而异，但众多报道的肿瘤细胞潜伏期多为数小时，且不受放射剂量的影响。这是因为放射损伤作为凋亡过程的一种“扳机”，一旦扣动，凋亡便按照自身特定的动力学进行。本实验结果显示照射后 24h 凋亡达到高峰，增敏放射组的凋亡率(46.7%)高于单纯照射组(38.7%)，表明紫杉醇可增强肿瘤放射诱导的凋亡。但更有意义的是两组凋亡率曲线形状上的差异：单纯照射组在 8Gy 以上时出现平台；而增敏放射组的凋亡率则在较低剂量(2 和 4Gy)时升高更为明显， 6Gy 以上时出现平台。增敏放射组的凋亡特点十分重要，因为临床放疗的单次剂量一般约为 2Gy(后装间质照射的单次剂量为 5Gy)。这提示临床上采用分次照射可能获得更高的凋亡比率。两组出现凋亡率平台的原因可能是由于进一步提高照射剂量将导致细胞坏死而不是凋亡。
3.3 紫杉醇增敏放射对AgNOR的影响 AgNOR是位于核仁组成区的酸性非组蛋白。其作用是保持rDNA链的伸展，调节rDNA的转录，参与rRNA的加工与装配。近年来开展的AgNOR银染技术能够反映细胞内rDNA转录活性及细胞的增殖活性，增殖越旺盛的细胞其AgNOR计数亦越高〔7，8〕。本实验结果显示人脑胶质母细胞瘤细胞系BT325 经紫杉醇增敏放射后，AgNOR的数量显著低于对照组、照射组及紫杉醇组。说明增敏放射除可杀死肿瘤细胞外，残存细胞的增殖活性亦明显下降；紫杉醇增敏放射抑制肿瘤细胞增殖活性的作用大于单纯照射或单用紫杉醇。由于rDNA转录活性下降，rRNA合成减少，残存细胞的亚致死损伤及潜在致死性损伤的修复能力亦下降。这提示我们，经过适宜的多次增敏照射后，部分残存细胞可因亚致死损伤的积累而被杀死。
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参考文献
[1]Liebmann J,cook JA, Fisher J et al.In vitro studies of taxol as a radiation sensitizer inhuman tumorcells.J Natcaner Inst, 1994,86:441
[2]邵文钊.人脑多形胶质母细胞瘤细胞系BT325.细胞生物学杂志，1985，7：92
[3]许良中.关于核仁组织区(AgNOR)研究工作的标准化方案.癌症，1996，15：75
[4]Rubin LL, philpott KL, Brooks SF.Thecellcycle andcelldeath.Curr Biol, 1993,3:391
[5]Foa R, Norton L, Seidman AD.Taxol (paclitaxel):Anovel anti-microtubule agent with remarkable anti-neoplastic activity.Int Jclin Lab Res, 1994,24:6
, http://www.100md.com
[6]AllandJ.Radiation-induced apoptosis:its role in aMADCaT(mitosis-differentiation-calcium toxicity)shceme ofcytotoxicitymechanisms.Iint J Radiat biol, 1992,62:145
[7]徐根兴.定量细胞学化学技术.长春：吉林科学技术出版社，1993.202～204
[8]李峰，浦佩玉，彭 琼 等.加温对人脑多形胶质母细胞瘤体外细胞株增殖的影响.癌症，1995，14：109
(1998—09—23收稿，1998—11—15修回), 百拇医药