急性坏死性胰腺炎继发感染的防治研究
作者：黎沾良 邓群 陆连荣 姚咏明 祝小枫 熊德鑫 梁延杰 于燕 孙小庆
单位：黎沾良 邓群：解放军304医院普通外科，北京 100037；陆连荣 姚咏明 祝小枫 熊德鑫 于燕 孙小庆解放军304医院创伤中心研究室 梁延杰：解放军304医院病理科
关键词：急性坏死性胰腺炎；继发感染；防治措施
军医进修学院学报990202 摘要 目的：观察不同措施对大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)继发内毒素和细菌移位的防治效果。方法：Wistar大鼠随机分为正常对照组和 6 个治疗组，观察胰腺病理、肠上皮细胞间紧密连接、血淀粉酶、内毒素、TNF-α、IL-1β、肠通透性、肠道菌群、脏器细菌移位率和死亡率的变化。结果：中药清胰汤和SDD的效果最好，中药在抑制胰酶分泌和维护肠通透性方面略胜一筹，而SDD则在改善菌群结构方面更具优势；两者在减轻内毒素和细菌移位上效果相当。单纯导泻效果令人失望。生长抑素从多方面显示出其有益的作用，但主要发挥于ANP的早期。两种细胞因子拮抗剂在一定程度上减轻ANP的病情。结论：中药清胰汤、SDD、生长抑素是防治ANP继发感染的有效措施。免疫干预有潜在的应用前景。
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中国图书资料分类法分类号 R 657.51
Intervention strategies for secondary infection following acute necrotizing pancreatitis in rats
Li Zhanliang,Deng Qun,Lu Lianrong,Yao Yongming,Zhu Xiaofeng,Xiong Dexin,Liang Yanjie,Yu Yan,Sun Xiaoqing(Department ofgeneral Surgery,304thhospital of PLA,Beijing 100037)
Abstract Objective:To observe the effects of 6 interventionmeasures ongut barrier function and endotoxin-bacterial translocation (BT) following acute necrotizing pancreatitis (ANP) in rats.Methods:A lethalmodel of ANP was reproduced by infusion of artificial bile into biliopancreatic duct and then divided randomly into: (1) ANPgroup (n=39,no treatment),(2) Chinesemedicinegroup (n=9),(3)mgSO4group (n=6),(4) SDDgroup (n=8),(5) somatostatingroup (n=19),(6)TNFα-McAbgroup (n=6) and (7) IL-1ragroup (n=6).Blood levels of amylase,D-lactic acid,TNFα，IL-1β and endotoxin weremeasured,intestinal flora and incidence of BT to organs were examined,andmorphology of pancreas and tight junction on ileum epithelia was assessed on cryofracture replicas at various time points.Results: In early stage of ANP,flora disturbance and tight junction damage occurred in thegut,plasma D-lactate and endotoxin levels were increased,and BT rate was ashigh as 59.5% at 72h.Serum TNFα and IL-1β were elevated significantly.Treatment with Chinesemedicinemarkedly improvedgut barrier function and reduced BT rate (37%),blood levels of amylase,endotoxin and cytokines.Having similar purgative response as Chinesemedicine,MgSO4 did not show any beneficial effect ongut barrier protection,and the incidence of endotoxemia and BT was not reduced.In SDDgroup,flora balance was preserved well,and similar results as Chinesemedicine were obtained.Somatostatinmarkedly blunted amylase and cytokine release and amelioratedgut barrier damage during early phase of ANP.TNFα-McAb and IL-1ra also alleviated pathologic changes in pancreas and endotoxemia.Conclusion: Treatment with Chinesemedicine,SDD and somatostatin attenuatedgut barrier damage and BT after ANP,and could be advisable for reducing the chance of secondary infection after ANP,while purgation alone was not effective.
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Key words acute necrotizing pancreatitis; secondary infection; therapeuticmeasures
急性坏死性胰腺炎(ANP)时肠屏障功能受损导致肠道内毒素和细菌移位是引发胰腺炎继发感染的根源，严重者可出现多器官功能障碍综合征〔1，2〕。本研究采用中药、导泻、选择性消化道去污染(SDD)、生长抑素、细胞因子拮抗剂等几种措施，对大鼠实验性ANP进行干预治疗，观察其疗效并探讨其作用机制，为临床综合治疗提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 模型建立及动物分组 Wistar大鼠，随机分为正常对照组(Norm，n＝6)、假手术组(Sham,n＝30，单纯剖腹探查)、ANP组(n＝14，胰管内注入牛胆酸钠和胰蛋白酶溶液复制ANP模型〔3〕)、中药治疗组[CM，n＝9，手术后 4h (下同)起灌服清胰汤 2ml,1/12h；配方：大黄、南柴胡、白芍各 24g，黄芩、胡黄连、元胡、木香、芒硝各 18g，两煎共得 150ml]、导泻组(WD，n＝6，灌服 50% 硫酸镁 2ml，1/12h)、SDD组(n＝8，灌服多粘菌素E10万U，妥布霉素 10mg，制霉菌素 10 万 U，1/8h)、生长抑素组(SS，n＝19，皮下注射善得定 10μg/kg,1/8h)、抗TNF单抗组(McAb)和白介素-1 受体拮抗剂组(IL-1ra)，各n＝6，30min 后分别静脉注射TNFα-mcAb 2mg/kg 和IL-1ra 2mg/kg。动物于 2h、8h、24h、48 和 72h 分批或一次活杀。
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1.2 标本采集 无菌条件下剖腹，记录大体所见。分别抽取门静脉血(测内毒素)和腹主动脉血(测其它指标)；切除胰、肝、脾、肺、肾及肠系膜淋巴结(MLN)作细菌培养；切取胰、回肠组织作光镜检查及肠上皮冷冻蚀刻；另取回肠组织及盲肠内容物作肠道菌群分析。
1.3 检测指标 ①胰、肠光镜观察；②胰腺炎组织学评分〔4〕；③回肠上皮细胞间紧密连接冷冻蚀刻观察(冷冻复型电镜技术)；④血清淀粉酶测定；⑤肠通透性检测(血浆D-乳酸定量，酶学分光光度法〔5〕)；⑥血清TNF-α及IL-1β测定(ELISA法)；⑦血浆内毒素测定(偶氮显色鲎试验法)；⑧肠道菌群分析；⑨脏器细菌培养及移位发生率计算；⑩死亡率统计。
1.4 统计学处理 采用SAS软件包，分别作t检验、方差分析和χ2检验。数据以
±s表示。
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2 结果
2.1 大体所见 术后 72h，假手术组腹腔内未见异常；ANP组有血性腹水，胰腺明显肿硬，暗红色，可见坏死灶及大量皂化斑；前 4 个治疗组血性腹水均有减少，胰腺出血、坏死减轻，皂化斑减少。
2.2 胰腺、回肠组织学变化及胰腺炎组织学评分 Sham组胰、肠在光镜下无异常变化，评分为 0。ANP组胰腺可见间质和腺小叶大量炎症细胞浸润，有弥漫性出血及大片坏死，胰周脂肪坏死，72h 组织学评分为 4.18±0.43。回肠粘膜及粘膜下水肿，充血，部分绒毛上皮轻度脱落。前 4 个治疗组的胰、肠组织学变化均比ANP组轻；胰腺炎组织学评分CM组为 3.11±0.84 (与ANP组比较，P<0.05)，McAb组和IL-1ra组分别为 2.58±0.50 和 2.48±0.48 (P<0.01)，而导泻组、SDD组和SS组分别为 3.34±1.11，3.64±0.45 和 3.81±1.12，差异均未达显著性意义。
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2.3 回肠上皮细胞间紧密连接的变化 正常动物回肠上皮的细胞间紧密连接为4～6排连续的嵴状突起条索，表面平滑，粗细均匀，平行排列，并横向相连形成网状结构。Sham组该结构完整。ANP组可见条索断裂、缩短、数量减少，网状结构模糊甚至消失。CM组、SDD组和SS组均可见某些嵴状条索中断，出现游离终端，但条索数目无明显减少，网状结构基本维持。导泻组与ANP组比，改善不明显。
2.4 血清淀粉酶(U/L)变化 ANP组急剧升高，24h 到达顶峰，为Sham组的 11.5 倍，72h 仍在较高水平(6 231±4 461)。CM组、SDD组和SS组 72h 血清淀粉酶分别为 1850±1567、2486±1395 和 2648±1798，明显低于ANP组(P<0.05)，以CM组效果最好(P<0.01)；导泻组(3224±1997)则与ANP组无显著性差异。McAb组和IL-1ra组 8h 淀粉酶有所下降，差异也未达显著性意义。
2.5 血浆D-乳酸(μg/ml)变化 ANP组在 24h 最高，为正常的 4 倍，72h (8.05±3.05)仍显著高于Sham组(3.99±1.53，P<0.01)。CM组、SDD组 72h D-乳酸分别为 3.59±1.75 和 3.95±1.83，明显低于ANP组(P<0.01)，导泻组(6.73±1.95)则无变化。SS组在 8h、 24h 显著比ANP组低，分别为 6.13±2.01 比 11.42±3.54 (P<0.05)和 8.01±4.16 比 14.71±4.86 (P<0.01)，72h 则差异未达显著意义。McAb组和IL-1ra组 8h D-乳酸分别为 6.55±2.97 和5.11±1.82，与ANP组的 11.42±3.54 比，P值分别<0.05 和<0.01。
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2.6 肠道菌群分析 ANP后 72h，肠道菌群中大肠杆菌增加了 40 倍，而双歧杆菌减少了 86%。以双歧杆菌/大肠杆菌(B/E)的比值代表厌氧菌与需氧菌的比例关系，肠内容物B/E值由 912 降到 7.6，粘膜菌群B/E值倒置，由 27 变为 1/2.36。中药组与导泻组B/E值均有回升，接近或达到显著水平。SDD组B/E值回升最显著，P<0.01。
2.7 血清TNF和IL-1水平变化 ANP组TNF和IL-1显著升高，与之相比各治疗组 72h TNF水平均有明显下降，CM组和SS组同时有IL-1 下降，见表1。
表1 各组72h血清TNF及IL-1水平(ρ/pg.ml-1) 组别
TNF
IL-1
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Norm(Oh)
8.56±5.06
14.84±9.97
Sham
13.94±4.72
12.26±4.65
ANP
46.79±24.31**
103.12±39.93**
CM
16.73±13.07△△
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46.43±34.65△
WD
20.50±13.34△
-
SDD
15.41±10.32△△
72.29±57.76*
SS
23.23±20.87△
50.05±24.51△
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*和**与Sham组比，P<0.05和P<0.01；△和△△与ANP组比，P<0.05和P<0.01
IL-1ra能将TNF水平从ANP组的 56.16±17.75 降低到 21.73±4.86(P<0.01)，但TNFmcAb却未能降低血浆中IL-1 水平(P>0.05)。
2.8 门静脉血浆内毒素水平(EU/ml)变化 ANP组 72h 内毒素水平异常升高 (0.423±0.155)，CM组、SDD组分别为 0.235±0.072、 0.227±0.084，较ANP组明显下降(P<0.01)，SS组为 0.284±0.063(P<0.05)，导泻组无下降(0.398±0.125)。McAb组和IL-1ra组 8h 内毒素水平分别为 0.274±0.11 和 0.229±0.076，与ANP组 (0.449±0.164) 比，P值分别<0.05和<0.01。
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2.9 脏器细菌移位率 Sham组肾及MLN培养阳性各 1 例。ANP组 72h 脏器培养阳性者所占的比例(细菌移位率)高达 59.5%，95% 是G-肠道杆菌；CM组、SDD组明显下降(仍显著高于Sham组)；导泻组比ANP组还高；SS组在 24h 低于ANP组 (22.2% 比 54.4%，P<0.01)，但 72h 时反高于ANP组(表 2)。
表2 各组72h细菌培养阳性脏器数及细菌移位率 组别
n
胰
肝
脾
肺
肾
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MLN
移位率(%)
Sham
6
0
0
0
0
1
1
5.6
ANP
14
9
, 百拇医药
5
7
10
7
12
59.5**
CM
9
7
2
1
1
2
, http://www.100md.com 7
37.0**#
WD
6
5
4
4
2
3
5
63.9**
SDD
7
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3
1
3
0
3
4
33.3**#
SS
7
7
5
4
3
6
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7
76.2**
** 与Sham组比，P<0.01；#与ANP组比，P<0.05
2.10 动物死亡率 72h 以前死亡的动物不参加数据分析，但参加死亡率统计。ANP组死亡率高达58.8%；SDD组、SS组明显下降，分别为 14.3% 和 16.7%，P<0.05；CM组有所降低(36.3%)，但差异未达显著，WD(46.2%)组无下降。McAb组及IL-1ra组动物于 8h 活杀，不参加死亡率统计。
3 讨论
本实验结果表明，ANP时肠屏障功能发生严重障碍。冷冻蚀刻电镜直观地反映了上皮细胞间紧密连接的损害，血浆D-乳酸检测结果从另外一个角度证实了ANP动物肠通透性的异常升高〔6〕。肠道菌群紊乱则反映了粘膜生物屏障的损害。肠屏障功能障碍导致了内毒素和细菌移位，成为胰腺继发感染的根源。
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本实验采用几种措施，从不同角度对ANP的病程进行干预。中药清胰汤(天津南开医院方)作为治疗急性胰腺炎的基本方剂，在国内许多医院已应用多年，对非重症胰腺炎确有疗效，但对其作用机理尚知之不多，在重症胰腺炎时应用很少，疗效有待评价。我们以前的研究〔7〕和本次实验表明，清胰汤在减轻胰腺病理变化、降低胰酶水平、维护肠通透性、减轻菌群紊乱、抑制促炎细胞因子(TNF、IL-1)水平、减少内毒素和细菌移位等方面都发挥了有益作用，说明它除了直接减轻胰腺病理损害以外，还对肠屏障功能提供较好的保护，有利于防治继发感染，改善预后。灌服清胰汤后腹泻明显，这一“攻里通下”作用是否就是清胰汤的功效所在?为此我们设置了50%硫酸镁导泻组，在泻下作用相同的条件下比较两种方法的效果。结果表明，单纯导泻除了在改善肠道菌群结构和降低TNF水平方面有一定作用外，对其余各项指标均未显示出有益的影响。这说明清胰汤的药理作用应是多方面的，绝非局限于泻下。选择性消化道去污染(SDD)是通过口服不吸收抗生素，抑制消化道的需氧菌和真菌，同时保护构成定植抗力的专性厌氧菌，应用于外科患者以控制肠源性感染已有10余年的历史，有报告称对急性胰腺炎有效〔8〕。本实验证明，SDD有助于维持肠道菌群的正常结构，降低血中淀粉酶、D-乳酸、TNF和内毒素水平，减少脏器发生细菌移位的机会，显著改善动物生存率，但对胰腺本身的病理损害无明显减轻作用。生长抑素强烈抑制胰腺外分泌，近年已越来越多地用于重症胰腺炎并取得肯定的疗效。我们的结果表明，SS确能减轻胰腺病理损害，降低血中淀粉酶、D-乳酸、内毒素和促炎细胞因子TNF和IL-1的水平，减少细菌移位和 72h 死亡率。但SS的作用大多显现于ANP发病早期，如减少胰腺病损、维护肠通透性、减轻内毒素血症和细菌移位、降低TNF水平等，都主要表现于发病 24h 以内甚至 8h 以内，提示胰酶自身消化的影响在ANP早期相当强烈，往后则有所减弱，而病情则按照其特有的、与多种因素相关的规律发展，不能单靠抑制胰酶加以左右，治疗应是综合性的。综合分析表明，中药清胰汤效果最好，SDD其次，而导泻效果令人失望。中药在抑制胰酶分泌和维护肠通透性方面作用突出，而SDD则在改善菌群结构方面更具优势；两者在减轻内毒素和细菌移位上效果相当。生长抑素从多方面显示出其有益的作用，但主要发挥于ANP的早期，提示作为综合措施之一，生长抑素应尽早使用。两种细胞因子拮抗剂在一定程度上减轻ANP的病情，提示进行免疫干预，在关键环节阻断或削弱细胞因子的级联放大效应，不失为防治ANP并发症的一条思路。
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参考文献
[1]Medich DS,Lee TK,MelhemmF et al.Pathogenesis of pancreatic sepsis.Am J Surg,1993,165:46
[2]吴承堂，黎沾良.急性坏死性胰腺炎并发感染的机理研究.中华外科杂志，1998，36：230
[3]Grewal DS,Mohey el Din A,Gaber LW et al.Amelioration of the physiologic and biochemical changes of acute pancreatitis using an anti-TNFα polyclonal antibody.Am J Surg,1994,167:214
[4]Hughes CB,GrewalhP,Gaber LW et al.Anti-TNFα therapy improves survival and ameliorates the pathophysiologic sequelae in acute pancreatitis in the rat.Am J Surg,1996,171:274
, http://www.100md.com
[5]Brandt RB,Siegel SA,WatersmG et al.Spectrophotometric assay for D-lactate in plasma.Anal Biochem,1980,102:39
[6]Yao YM,Yu Y,Wu Y et al.Plasma D-lactate as a newmarker for diagnosis of acute intestinal injury following ischemia-reperfusion.China Natl J Newgastroenterol,1997,3:225
[7]黎沾良，吴承堂，熊德鑫等.中药“清胰汤”减轻急性坏死性胰腺炎时氧自由基损伤的研究.外科，1997，2：190
[8]Luiten EJT,Hop WCJ,Lange JF et al.Controlled clinical trial of selective decontamination for severe acute pancreatitis.Ann Surg,1995,222:57
(1998—10—20收稿，1998—11—18修回), http://www.100md.com
单位：黎沾良 邓群：解放军304医院普通外科，北京 100037；陆连荣 姚咏明 祝小枫 熊德鑫 于燕 孙小庆解放军304医院创伤中心研究室 梁延杰：解放军304医院病理科
关键词：急性坏死性胰腺炎；继发感染；防治措施
军医进修学院学报990202 摘要 目的：观察不同措施对大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)继发内毒素和细菌移位的防治效果。方法：Wistar大鼠随机分为正常对照组和 6 个治疗组，观察胰腺病理、肠上皮细胞间紧密连接、血淀粉酶、内毒素、TNF-α、IL-1β、肠通透性、肠道菌群、脏器细菌移位率和死亡率的变化。结果：中药清胰汤和SDD的效果最好，中药在抑制胰酶分泌和维护肠通透性方面略胜一筹，而SDD则在改善菌群结构方面更具优势；两者在减轻内毒素和细菌移位上效果相当。单纯导泻效果令人失望。生长抑素从多方面显示出其有益的作用，但主要发挥于ANP的早期。两种细胞因子拮抗剂在一定程度上减轻ANP的病情。结论：中药清胰汤、SDD、生长抑素是防治ANP继发感染的有效措施。免疫干预有潜在的应用前景。
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中国图书资料分类法分类号 R 657.51
Intervention strategies for secondary infection following acute necrotizing pancreatitis in rats
Li Zhanliang,Deng Qun,Lu Lianrong,Yao Yongming,Zhu Xiaofeng,Xiong Dexin,Liang Yanjie,Yu Yan,Sun Xiaoqing(Department ofgeneral Surgery,304thhospital of PLA,Beijing 100037)
Abstract Objective:To observe the effects of 6 interventionmeasures ongut barrier function and endotoxin-bacterial translocation (BT) following acute necrotizing pancreatitis (ANP) in rats.Methods:A lethalmodel of ANP was reproduced by infusion of artificial bile into biliopancreatic duct and then divided randomly into: (1) ANPgroup (n=39,no treatment),(2) Chinesemedicinegroup (n=9),(3)mgSO4group (n=6),(4) SDDgroup (n=8),(5) somatostatingroup (n=19),(6)TNFα-McAbgroup (n=6) and (7) IL-1ragroup (n=6).Blood levels of amylase,D-lactic acid,TNFα，IL-1β and endotoxin weremeasured,intestinal flora and incidence of BT to organs were examined,andmorphology of pancreas and tight junction on ileum epithelia was assessed on cryofracture replicas at various time points.Results: In early stage of ANP,flora disturbance and tight junction damage occurred in thegut,plasma D-lactate and endotoxin levels were increased,and BT rate was ashigh as 59.5% at 72h.Serum TNFα and IL-1β were elevated significantly.Treatment with Chinesemedicinemarkedly improvedgut barrier function and reduced BT rate (37%),blood levels of amylase,endotoxin and cytokines.Having similar purgative response as Chinesemedicine,MgSO4 did not show any beneficial effect ongut barrier protection,and the incidence of endotoxemia and BT was not reduced.In SDDgroup,flora balance was preserved well,and similar results as Chinesemedicine were obtained.Somatostatinmarkedly blunted amylase and cytokine release and amelioratedgut barrier damage during early phase of ANP.TNFα-McAb and IL-1ra also alleviated pathologic changes in pancreas and endotoxemia.Conclusion: Treatment with Chinesemedicine,SDD and somatostatin attenuatedgut barrier damage and BT after ANP,and could be advisable for reducing the chance of secondary infection after ANP,while purgation alone was not effective.
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Key words acute necrotizing pancreatitis; secondary infection; therapeuticmeasures
急性坏死性胰腺炎(ANP)时肠屏障功能受损导致肠道内毒素和细菌移位是引发胰腺炎继发感染的根源，严重者可出现多器官功能障碍综合征〔1，2〕。本研究采用中药、导泻、选择性消化道去污染(SDD)、生长抑素、细胞因子拮抗剂等几种措施，对大鼠实验性ANP进行干预治疗，观察其疗效并探讨其作用机制，为临床综合治疗提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 模型建立及动物分组 Wistar大鼠，随机分为正常对照组(Norm，n＝6)、假手术组(Sham,n＝30，单纯剖腹探查)、ANP组(n＝14，胰管内注入牛胆酸钠和胰蛋白酶溶液复制ANP模型〔3〕)、中药治疗组[CM，n＝9，手术后 4h (下同)起灌服清胰汤 2ml,1/12h；配方：大黄、南柴胡、白芍各 24g，黄芩、胡黄连、元胡、木香、芒硝各 18g，两煎共得 150ml]、导泻组(WD，n＝6，灌服 50% 硫酸镁 2ml，1/12h)、SDD组(n＝8，灌服多粘菌素E10万U，妥布霉素 10mg，制霉菌素 10 万 U，1/8h)、生长抑素组(SS，n＝19，皮下注射善得定 10μg/kg,1/8h)、抗TNF单抗组(McAb)和白介素-1 受体拮抗剂组(IL-1ra)，各n＝6，30min 后分别静脉注射TNFα-mcAb 2mg/kg 和IL-1ra 2mg/kg。动物于 2h、8h、24h、48 和 72h 分批或一次活杀。
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1.2 标本采集 无菌条件下剖腹，记录大体所见。分别抽取门静脉血(测内毒素)和腹主动脉血(测其它指标)；切除胰、肝、脾、肺、肾及肠系膜淋巴结(MLN)作细菌培养；切取胰、回肠组织作光镜检查及肠上皮冷冻蚀刻；另取回肠组织及盲肠内容物作肠道菌群分析。
1.3 检测指标 ①胰、肠光镜观察；②胰腺炎组织学评分〔4〕；③回肠上皮细胞间紧密连接冷冻蚀刻观察(冷冻复型电镜技术)；④血清淀粉酶测定；⑤肠通透性检测(血浆D-乳酸定量，酶学分光光度法〔5〕)；⑥血清TNF-α及IL-1β测定(ELISA法)；⑦血浆内毒素测定(偶氮显色鲎试验法)；⑧肠道菌群分析；⑨脏器细菌培养及移位发生率计算；⑩死亡率统计。
1.4 统计学处理 采用SAS软件包，分别作t检验、方差分析和χ2检验。数据以
±s表示。, 百拇医药
2 结果
2.1 大体所见 术后 72h，假手术组腹腔内未见异常；ANP组有血性腹水，胰腺明显肿硬，暗红色，可见坏死灶及大量皂化斑；前 4 个治疗组血性腹水均有减少，胰腺出血、坏死减轻，皂化斑减少。
2.2 胰腺、回肠组织学变化及胰腺炎组织学评分 Sham组胰、肠在光镜下无异常变化，评分为 0。ANP组胰腺可见间质和腺小叶大量炎症细胞浸润，有弥漫性出血及大片坏死，胰周脂肪坏死，72h 组织学评分为 4.18±0.43。回肠粘膜及粘膜下水肿，充血，部分绒毛上皮轻度脱落。前 4 个治疗组的胰、肠组织学变化均比ANP组轻；胰腺炎组织学评分CM组为 3.11±0.84 (与ANP组比较，P<0.05)，McAb组和IL-1ra组分别为 2.58±0.50 和 2.48±0.48 (P<0.01)，而导泻组、SDD组和SS组分别为 3.34±1.11，3.64±0.45 和 3.81±1.12，差异均未达显著性意义。
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2.3 回肠上皮细胞间紧密连接的变化 正常动物回肠上皮的细胞间紧密连接为4～6排连续的嵴状突起条索，表面平滑，粗细均匀，平行排列，并横向相连形成网状结构。Sham组该结构完整。ANP组可见条索断裂、缩短、数量减少，网状结构模糊甚至消失。CM组、SDD组和SS组均可见某些嵴状条索中断，出现游离终端，但条索数目无明显减少，网状结构基本维持。导泻组与ANP组比，改善不明显。
2.4 血清淀粉酶(U/L)变化 ANP组急剧升高，24h 到达顶峰，为Sham组的 11.5 倍，72h 仍在较高水平(6 231±4 461)。CM组、SDD组和SS组 72h 血清淀粉酶分别为 1850±1567、2486±1395 和 2648±1798，明显低于ANP组(P<0.05)，以CM组效果最好(P<0.01)；导泻组(3224±1997)则与ANP组无显著性差异。McAb组和IL-1ra组 8h 淀粉酶有所下降，差异也未达显著性意义。
2.5 血浆D-乳酸(μg/ml)变化 ANP组在 24h 最高，为正常的 4 倍，72h (8.05±3.05)仍显著高于Sham组(3.99±1.53，P<0.01)。CM组、SDD组 72h D-乳酸分别为 3.59±1.75 和 3.95±1.83，明显低于ANP组(P<0.01)，导泻组(6.73±1.95)则无变化。SS组在 8h、 24h 显著比ANP组低，分别为 6.13±2.01 比 11.42±3.54 (P<0.05)和 8.01±4.16 比 14.71±4.86 (P<0.01)，72h 则差异未达显著意义。McAb组和IL-1ra组 8h D-乳酸分别为 6.55±2.97 和5.11±1.82，与ANP组的 11.42±3.54 比，P值分别<0.05 和<0.01。
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2.6 肠道菌群分析 ANP后 72h，肠道菌群中大肠杆菌增加了 40 倍，而双歧杆菌减少了 86%。以双歧杆菌/大肠杆菌(B/E)的比值代表厌氧菌与需氧菌的比例关系，肠内容物B/E值由 912 降到 7.6，粘膜菌群B/E值倒置，由 27 变为 1/2.36。中药组与导泻组B/E值均有回升，接近或达到显著水平。SDD组B/E值回升最显著，P<0.01。
2.7 血清TNF和IL-1水平变化 ANP组TNF和IL-1显著升高，与之相比各治疗组 72h TNF水平均有明显下降，CM组和SS组同时有IL-1 下降，见表1。
表1 各组72h血清TNF及IL-1水平(ρ/pg.ml-1) 组别
TNF
IL-1
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Norm(Oh)
8.56±5.06
14.84±9.97
Sham
13.94±4.72
12.26±4.65
ANP
46.79±24.31**
103.12±39.93**
CM
16.73±13.07△△
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46.43±34.65△
WD
20.50±13.34△
-
SDD
15.41±10.32△△
72.29±57.76*
SS
23.23±20.87△
50.05±24.51△
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*和**与Sham组比，P<0.05和P<0.01；△和△△与ANP组比，P<0.05和P<0.01
IL-1ra能将TNF水平从ANP组的 56.16±17.75 降低到 21.73±4.86(P<0.01)，但TNFmcAb却未能降低血浆中IL-1 水平(P>0.05)。
2.8 门静脉血浆内毒素水平(EU/ml)变化 ANP组 72h 内毒素水平异常升高 (0.423±0.155)，CM组、SDD组分别为 0.235±0.072、 0.227±0.084，较ANP组明显下降(P<0.01)，SS组为 0.284±0.063(P<0.05)，导泻组无下降(0.398±0.125)。McAb组和IL-1ra组 8h 内毒素水平分别为 0.274±0.11 和 0.229±0.076，与ANP组 (0.449±0.164) 比，P值分别<0.05和<0.01。
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2.9 脏器细菌移位率 Sham组肾及MLN培养阳性各 1 例。ANP组 72h 脏器培养阳性者所占的比例(细菌移位率)高达 59.5%，95% 是G-肠道杆菌；CM组、SDD组明显下降(仍显著高于Sham组)；导泻组比ANP组还高；SS组在 24h 低于ANP组 (22.2% 比 54.4%，P<0.01)，但 72h 时反高于ANP组(表 2)。
表2 各组72h细菌培养阳性脏器数及细菌移位率 组别
n
胰
肝
脾
肺
肾
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MLN
移位率(%)
Sham
6
0
0
0
0
1
1
5.6
ANP
14
9
, 百拇医药
5
7
10
7
12
59.5**
CM
9
7
2
1
1
2
, http://www.100md.com 7
37.0**#
WD
6
5
4
4
2
3
5
63.9**
SDD
7
, 百拇医药
3
1
3
0
3
4
33.3**#
SS
7
7
5
4
3
6
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7
76.2**
** 与Sham组比，P<0.01；#与ANP组比，P<0.05
2.10 动物死亡率 72h 以前死亡的动物不参加数据分析，但参加死亡率统计。ANP组死亡率高达58.8%；SDD组、SS组明显下降，分别为 14.3% 和 16.7%，P<0.05；CM组有所降低(36.3%)，但差异未达显著，WD(46.2%)组无下降。McAb组及IL-1ra组动物于 8h 活杀，不参加死亡率统计。
3 讨论
本实验结果表明，ANP时肠屏障功能发生严重障碍。冷冻蚀刻电镜直观地反映了上皮细胞间紧密连接的损害，血浆D-乳酸检测结果从另外一个角度证实了ANP动物肠通透性的异常升高〔6〕。肠道菌群紊乱则反映了粘膜生物屏障的损害。肠屏障功能障碍导致了内毒素和细菌移位，成为胰腺继发感染的根源。
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本实验采用几种措施，从不同角度对ANP的病程进行干预。中药清胰汤(天津南开医院方)作为治疗急性胰腺炎的基本方剂，在国内许多医院已应用多年，对非重症胰腺炎确有疗效，但对其作用机理尚知之不多，在重症胰腺炎时应用很少，疗效有待评价。我们以前的研究〔7〕和本次实验表明，清胰汤在减轻胰腺病理变化、降低胰酶水平、维护肠通透性、减轻菌群紊乱、抑制促炎细胞因子(TNF、IL-1)水平、减少内毒素和细菌移位等方面都发挥了有益作用，说明它除了直接减轻胰腺病理损害以外，还对肠屏障功能提供较好的保护，有利于防治继发感染，改善预后。灌服清胰汤后腹泻明显，这一“攻里通下”作用是否就是清胰汤的功效所在?为此我们设置了50%硫酸镁导泻组，在泻下作用相同的条件下比较两种方法的效果。结果表明，单纯导泻除了在改善肠道菌群结构和降低TNF水平方面有一定作用外，对其余各项指标均未显示出有益的影响。这说明清胰汤的药理作用应是多方面的，绝非局限于泻下。选择性消化道去污染(SDD)是通过口服不吸收抗生素，抑制消化道的需氧菌和真菌，同时保护构成定植抗力的专性厌氧菌，应用于外科患者以控制肠源性感染已有10余年的历史，有报告称对急性胰腺炎有效〔8〕。本实验证明，SDD有助于维持肠道菌群的正常结构，降低血中淀粉酶、D-乳酸、TNF和内毒素水平，减少脏器发生细菌移位的机会，显著改善动物生存率，但对胰腺本身的病理损害无明显减轻作用。生长抑素强烈抑制胰腺外分泌，近年已越来越多地用于重症胰腺炎并取得肯定的疗效。我们的结果表明，SS确能减轻胰腺病理损害，降低血中淀粉酶、D-乳酸、内毒素和促炎细胞因子TNF和IL-1的水平，减少细菌移位和 72h 死亡率。但SS的作用大多显现于ANP发病早期，如减少胰腺病损、维护肠通透性、减轻内毒素血症和细菌移位、降低TNF水平等，都主要表现于发病 24h 以内甚至 8h 以内，提示胰酶自身消化的影响在ANP早期相当强烈，往后则有所减弱，而病情则按照其特有的、与多种因素相关的规律发展，不能单靠抑制胰酶加以左右，治疗应是综合性的。综合分析表明，中药清胰汤效果最好，SDD其次，而导泻效果令人失望。中药在抑制胰酶分泌和维护肠通透性方面作用突出，而SDD则在改善菌群结构方面更具优势；两者在减轻内毒素和细菌移位上效果相当。生长抑素从多方面显示出其有益的作用，但主要发挥于ANP的早期，提示作为综合措施之一，生长抑素应尽早使用。两种细胞因子拮抗剂在一定程度上减轻ANP的病情，提示进行免疫干预，在关键环节阻断或削弱细胞因子的级联放大效应，不失为防治ANP并发症的一条思路。
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参考文献
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[2]吴承堂，黎沾良.急性坏死性胰腺炎并发感染的机理研究.中华外科杂志，1998，36：230
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[5]Brandt RB,Siegel SA,WatersmG et al.Spectrophotometric assay for D-lactate in plasma.Anal Biochem,1980,102:39
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[7]黎沾良，吴承堂，熊德鑫等.中药“清胰汤”减轻急性坏死性胰腺炎时氧自由基损伤的研究.外科，1997，2：190
[8]Luiten EJT,Hop WCJ,Lange JF et al.Controlled clinical trial of selective decontamination for severe acute pancreatitis.Ann Surg,1995,222:57
(1998—10—20收稿，1998—11—18修回), http://www.100md.com