胍对人胎盘碱性磷酸酶内源荧光的影响
作者：耿芳宋 童家明 王秀丽
单位：1.青岛大学医学院 生化教研室；2.物理教研室，山东 青岛 266021
关键词：碱性磷酸酶；盐酸胍；荧光；构象
中国医学物理学杂志990219 摘要：目的：研究盐酸胍对人胎盘碱性磷酸酶内源荧光光谱的影响。方法：用荧光光度计检测了不同浓度盐酸胍溶液中人胎盘碱性磷酸酶内源荧光发射光谱。结果：盐酸胍小于1.0 mol/L时，平衡态酶内源荧光发射强度减小，随胍浓度增大，荧光发射强度增大，且当胍浓度大于1.0 mol/L时，其荧光光谱的最大发射峰位出现明显红移，至胍浓度为4.0 mol/L时红移停止。结论：低浓度胍仅微扰了酶活性部位的构象，而高浓度胍改变了酶的整体构象。
中图分类号：Q632
文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1005-202X(1999)02-0110-02
The effect of guanidium hydrochloride on the intrinsic
fluorescence emission spectrums of human
placental alkaline phosphatase
GENG Fang-song,TONG Jia-ming,WANG Xia-li
(Qingdao Medical College,Qingdao 266021,China)
Abstract:Object:To study the effect of guanidnium hydrochloride (GuHCl) on the intrinsic fluorescence emission spectrums of human placental alkaline phosphatase (PLAP,E.C.3.1.3.1).Method:Fluorescence spectrometer was used to dect the intrinsic fluorescence eission spectrums of human PLAP in GuHCl solutions of different concentration.Result:At low concns.of GuHCl (1.0 mol/L),the fluorescence emission intensity decreased.Increase of the fluoresecnce emission intensity followed and enhance of GuCHl concns.,and its max red shifted from 334 nm to 357 nm. Conclusion:The conformational stat of the active site of enzyme can be disturbed a little by the low concns GuHCl.The whole conformation of the enzymic molecule can be changed by higher concns.GuHCl.
, 百拇医药
Key words:alkaline phosphatase;guanidnium chloride;fluorescence;conformation
人胎盘碱性磷酸酶(Placental alkaline pkosphatase,PLAP,E.C.3.1.3.1)是通过寡糖磷脂酰肌醇锚在细胞膜上的一种糖蛋白，是一个新进化的基因产物，其溶解形式为二聚体，亚基分子量为64，000，其一级结构已较清楚[1]，人PLAP是肿瘤的一个标志酶，虽对其已进行了较为广泛的研究，但其作用机制和生物学功能尚不清楚[2]。本文通过观察不同浓度盐酸胍溶液中人PLAP内源荧光光谱的改变，讨论了盐酸胍对人PLAP构象的影响，这有助于研究人PLAP的作用机制和生物学功能。
1 材料与方法
1.1 人PLAP的制备与鉴定
, 百拇医药
人PLAP按改进Sussman[3]法制备，DEAE-纤维素层析前，将粗酶液60 ℃加热处理 30 min；以DEAE-Sephadex A-50替代Sephadex G-200进行柱层析，纯化酶经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单-区带；反相高压相色谱分析为单-对称峰。酶浓度用紫外吸收法[3](ε280=1.0 mg/ml/cm)测定。
1.2 酶的变性与荧光光谱测量
人PLAP内源荧光光谱的测定在LS-50荧光分光光度计上进行。酶液变性体系中包含16.6 μg/ml,100 mmol/L,pH9.9 Tris-HCl缓冲液及0～6.0 mol/L的指定浓度的盐酸胍，混匀20 ℃保温24小时至平衡态。25 ℃恒温下，用280 nm波长激发，监测300～410 nm的发射光谱。用含相应浓度的盐酸胍缓冲液进行校正。
, 百拇医药 1.3 试剂
DEAE-纤维素系上海试剂二厂产品；DEAE-Sephadex A-50系Pharmacia公司产品；Tris和盐酸胍均为Sigma公司产品；其它试剂均为国产分析纯，用双蒸水配制。
2 结果
图1表明不同浓度的盐酸胍对人PLAP内源荧光光谱的影响。由图可见，随着盐酸胍浓度增加，PLAP的内源荧光发射峰倾向红移。当胍浓度小于1.0 mol/L时，其发射光谱峰位基本不变，均在334 nm处；当胍浓度从1.0 mol/L增加至3.0 mol/L时，其发射峰位急剧红移从334 nm移至357 nm；当胍浓度大于3.0 mol/L时，其发射峰基本保持恒定在357 nm。由发射光谱峰的荧光强度随胍浓度变化的曲线中可以看到，当胍浓度为0.5 mol/L时，发射光谱峰的强度最小，随着胍浓度增加，发射光谱峰的强度持续增强；当胍浓度高于3.0 mol/L时，荧光强度增大的幅度逐渐减小。
, 百拇医药
图1 不同浓度盐酸胍溶液(pH9，9 20 ℃,24小时)中
人PLAP内源荧光变化。酶浓度16.6 μg/ml，激
发波长280 nm，扫描范围300-410 nm。曲线：1
最大发射峰的波长，2最大发射峰的荧光强度。
3 讨论
一般认为疏水氨基酸，如色氨酸残基对维持酶分子结构有重要作用，而色氨酸是一个荧光发射基团，因而通过监测酶的内源荧光发射光谱可以了解酶分子整体构象变化。PLAP是一个二聚体，每个亚基含有4个色氨酸残基和16个酪氨酸残基[4]。图1中胍使人PLAP的内源荧光光谱呈现两个阶段的变化。首先是在低浓度盐酸胍溶液(0.5 mol/L)中，PLAP的荧光强度降低，但峰位不变，当盐酸胍浓度超过0.5 mol/L时，荧光强度回升，峰位不变；而当盐酸胍浓度超过1.0 mol/L时，荧光强度超过天然酶的荧光强度且继续增强，荧光峰位出现明显红移。这种变化可能是由于酶分子内部色氨酸残基和酪氨酸残基从疏水内环境暴露到亲水环境中的结果。
, http://www.100md.com
盐酸胍浓度在2.0 mol/L以内对人PLAP有激活作用[5]，其中0.5 mol/L盐酸胍的激活作用最大；当盐酸胍浓度大于2.0 mol/L时，酶活力降低。将不同浓度胍溶液中人PLAP活力的变化与这两个阶段的荧光光谱变化加以比较，可见酶的激活与第一阶段的荧光变化相对应，酶的失活与第二阶段的荧光变化相对应。因此第一阶段的荧光变化可能是由于低浓度的盐酸胍微扰了酶的活性的部位，使其局部构象发生变化所致；第二阶段荧光峰的明显红移，是由于盐酸胍与酶分子进一步作用引起酶分子整体构象变化而导致的荧光能量淬灭现象[6]。然而这一阶段荧光强度的增强，则可能是由于测定体系pH为9.9，接近酪氨酸羟基的PK值10.07，易使PLAP分子内部的酪氨酸暴露后转变为解离的酪氨酸残基，而胍对解离酪氨酸有明显的荧光增强效应(这种效应不改变荧光发射峰的位置)[6]所引起的。当胍浓度较高时，由于肽链伸展逐渐充分，分子内部可暴露的酪氨酸残基数逐渐减少，使新增加的解离酪氨酸残基数也逐渐减少，从而使荧光强度的增大幅度逐渐减小。此外随着胍浓度增加，色氨酸残基完全暴露，最大发射峰位红移至357 nm。
, 百拇医药
由此可见低浓度的盐酸胍可以微扰人PLAP活性部位的构象，使其由紧密的有序结构转变为松散的结构，有利于酶的催化，使酶活力增强；高浓度的盐酸胍扰乱了人PLAP的整体构象，使其活性部位结构进一步松散破坏，从而导致酶活力的丧失，这与盐酸胍对鸡肝二氢叶酸还原酶的作用是一致的[7]。
基金项目：山东省卫生厅科研基金资助课题
参考文献
[1] Harris,H.Clin Chim Acta,1989,186:133.
[2] Hoylaerts,et al.Biochem J,1992,286:23.
[3] Sussman,H.H.,et al.J Biol Chem,1968,234:160.
[4] Millan,J.L.J Biol Chem,1986,261:3112.
[5] 耿芳宋，等.青岛医学院学报，1996，32(3)：197.
[6] 姚启智，等.中国科学(B辑)，1982，25(10)：892.
[7] 范映辛，等.生物物理学报，1995，11(2)：155.
收稿日期：1998-06-24, http://www.100md.com
单位：1.青岛大学医学院 生化教研室；2.物理教研室，山东 青岛 266021
关键词：碱性磷酸酶；盐酸胍；荧光；构象
中国医学物理学杂志990219 摘要：目的：研究盐酸胍对人胎盘碱性磷酸酶内源荧光光谱的影响。方法：用荧光光度计检测了不同浓度盐酸胍溶液中人胎盘碱性磷酸酶内源荧光发射光谱。结果：盐酸胍小于1.0 mol/L时，平衡态酶内源荧光发射强度减小，随胍浓度增大，荧光发射强度增大，且当胍浓度大于1.0 mol/L时，其荧光光谱的最大发射峰位出现明显红移，至胍浓度为4.0 mol/L时红移停止。结论：低浓度胍仅微扰了酶活性部位的构象，而高浓度胍改变了酶的整体构象。
中图分类号：Q632
文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1005-202X(1999)02-0110-02
The effect of guanidium hydrochloride on the intrinsic
fluorescence emission spectrums of human
placental alkaline phosphatase
GENG Fang-song,TONG Jia-ming,WANG Xia-li
(Qingdao Medical College,Qingdao 266021,China)
Abstract:Object:To study the effect of guanidnium hydrochloride (GuHCl) on the intrinsic fluorescence emission spectrums of human placental alkaline phosphatase (PLAP,E.C.3.1.3.1).Method:Fluorescence spectrometer was used to dect the intrinsic fluorescence eission spectrums of human PLAP in GuHCl solutions of different concentration.Result:At low concns.of GuHCl (1.0 mol/L),the fluorescence emission intensity decreased.Increase of the fluoresecnce emission intensity followed and enhance of GuCHl concns.,and its max red shifted from 334 nm to 357 nm. Conclusion:The conformational stat of the active site of enzyme can be disturbed a little by the low concns GuHCl.The whole conformation of the enzymic molecule can be changed by higher concns.GuHCl.
, 百拇医药
Key words:alkaline phosphatase;guanidnium chloride;fluorescence;conformation
人胎盘碱性磷酸酶(Placental alkaline pkosphatase,PLAP,E.C.3.1.3.1)是通过寡糖磷脂酰肌醇锚在细胞膜上的一种糖蛋白，是一个新进化的基因产物，其溶解形式为二聚体，亚基分子量为64，000，其一级结构已较清楚[1]，人PLAP是肿瘤的一个标志酶，虽对其已进行了较为广泛的研究，但其作用机制和生物学功能尚不清楚[2]。本文通过观察不同浓度盐酸胍溶液中人PLAP内源荧光光谱的改变，讨论了盐酸胍对人PLAP构象的影响，这有助于研究人PLAP的作用机制和生物学功能。
1 材料与方法
1.1 人PLAP的制备与鉴定
, 百拇医药
人PLAP按改进Sussman[3]法制备，DEAE-纤维素层析前，将粗酶液60 ℃加热处理 30 min；以DEAE-Sephadex A-50替代Sephadex G-200进行柱层析，纯化酶经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单-区带；反相高压相色谱分析为单-对称峰。酶浓度用紫外吸收法[3](ε280=1.0 mg/ml/cm)测定。
1.2 酶的变性与荧光光谱测量
人PLAP内源荧光光谱的测定在LS-50荧光分光光度计上进行。酶液变性体系中包含16.6 μg/ml,100 mmol/L,pH9.9 Tris-HCl缓冲液及0～6.0 mol/L的指定浓度的盐酸胍，混匀20 ℃保温24小时至平衡态。25 ℃恒温下，用280 nm波长激发，监测300～410 nm的发射光谱。用含相应浓度的盐酸胍缓冲液进行校正。
, 百拇医药 1.3 试剂
DEAE-纤维素系上海试剂二厂产品；DEAE-Sephadex A-50系Pharmacia公司产品；Tris和盐酸胍均为Sigma公司产品；其它试剂均为国产分析纯，用双蒸水配制。
2 结果
图1表明不同浓度的盐酸胍对人PLAP内源荧光光谱的影响。由图可见，随着盐酸胍浓度增加，PLAP的内源荧光发射峰倾向红移。当胍浓度小于1.0 mol/L时，其发射光谱峰位基本不变，均在334 nm处；当胍浓度从1.0 mol/L增加至3.0 mol/L时，其发射峰位急剧红移从334 nm移至357 nm；当胍浓度大于3.0 mol/L时，其发射峰基本保持恒定在357 nm。由发射光谱峰的荧光强度随胍浓度变化的曲线中可以看到，当胍浓度为0.5 mol/L时，发射光谱峰的强度最小，随着胍浓度增加，发射光谱峰的强度持续增强；当胍浓度高于3.0 mol/L时，荧光强度增大的幅度逐渐减小。
, 百拇医药
图1 不同浓度盐酸胍溶液(pH9，9 20 ℃,24小时)中
人PLAP内源荧光变化。酶浓度16.6 μg/ml，激
发波长280 nm，扫描范围300-410 nm。曲线：1
最大发射峰的波长，2最大发射峰的荧光强度。
3 讨论
一般认为疏水氨基酸，如色氨酸残基对维持酶分子结构有重要作用，而色氨酸是一个荧光发射基团，因而通过监测酶的内源荧光发射光谱可以了解酶分子整体构象变化。PLAP是一个二聚体，每个亚基含有4个色氨酸残基和16个酪氨酸残基[4]。图1中胍使人PLAP的内源荧光光谱呈现两个阶段的变化。首先是在低浓度盐酸胍溶液(0.5 mol/L)中，PLAP的荧光强度降低，但峰位不变，当盐酸胍浓度超过0.5 mol/L时，荧光强度回升，峰位不变；而当盐酸胍浓度超过1.0 mol/L时，荧光强度超过天然酶的荧光强度且继续增强，荧光峰位出现明显红移。这种变化可能是由于酶分子内部色氨酸残基和酪氨酸残基从疏水内环境暴露到亲水环境中的结果。
, http://www.100md.com
盐酸胍浓度在2.0 mol/L以内对人PLAP有激活作用[5]，其中0.5 mol/L盐酸胍的激活作用最大；当盐酸胍浓度大于2.0 mol/L时，酶活力降低。将不同浓度胍溶液中人PLAP活力的变化与这两个阶段的荧光光谱变化加以比较，可见酶的激活与第一阶段的荧光变化相对应，酶的失活与第二阶段的荧光变化相对应。因此第一阶段的荧光变化可能是由于低浓度的盐酸胍微扰了酶的活性的部位，使其局部构象发生变化所致；第二阶段荧光峰的明显红移，是由于盐酸胍与酶分子进一步作用引起酶分子整体构象变化而导致的荧光能量淬灭现象[6]。然而这一阶段荧光强度的增强，则可能是由于测定体系pH为9.9，接近酪氨酸羟基的PK值10.07，易使PLAP分子内部的酪氨酸暴露后转变为解离的酪氨酸残基，而胍对解离酪氨酸有明显的荧光增强效应(这种效应不改变荧光发射峰的位置)[6]所引起的。当胍浓度较高时，由于肽链伸展逐渐充分，分子内部可暴露的酪氨酸残基数逐渐减少，使新增加的解离酪氨酸残基数也逐渐减少，从而使荧光强度的增大幅度逐渐减小。此外随着胍浓度增加，色氨酸残基完全暴露，最大发射峰位红移至357 nm。
, 百拇医药
由此可见低浓度的盐酸胍可以微扰人PLAP活性部位的构象，使其由紧密的有序结构转变为松散的结构，有利于酶的催化，使酶活力增强；高浓度的盐酸胍扰乱了人PLAP的整体构象，使其活性部位结构进一步松散破坏，从而导致酶活力的丧失，这与盐酸胍对鸡肝二氢叶酸还原酶的作用是一致的[7]。
基金项目：山东省卫生厅科研基金资助课题
参考文献
[1] Harris,H.Clin Chim Acta,1989,186:133.
[2] Hoylaerts,et al.Biochem J,1992,286:23.
[3] Sussman,H.H.,et al.J Biol Chem,1968,234:160.
[4] Millan,J.L.J Biol Chem,1986,261:3112.
[5] 耿芳宋，等.青岛医学院学报，1996，32(3)：197.
[6] 姚启智，等.中国科学(B辑)，1982，25(10)：892.
[7] 范映辛，等.生物物理学报，1995，11(2)：155.
收稿日期：1998-06-24, http://www.100md.com