API0134对凝血酶作用下血小板环核苷酸和胞浆游离钙离子浓度的影响*
作者：李树生 赵华月 郭志凌
单位：李树生 同济医科大学附属同济医院 急诊科 武汉 430030；赵华月 郭志凌 同济医科大学附属同济医院 内科心血管， 武汉 430030
关键词：API0134；环磷酸腺苷；钙离子；凝血酶；血小板活化；噻氯匹定
同济医科大学学报990219 摘要 为观察穿心莲有效成分(API0134)对凝血酶作用下血小板活化的抑制作用,将家兔24只随机分为API0134(A)组(n=9),噻氯匹定(T)组(n=8)和对照组(n=7),治疗1周,然后检测凝血酶作用下血小板内cAMP、cGMP和胞浆游离钙离子浓度,以及血小板超微结构。结果表明cAMP水平在A、T两组显著高于C组(P<0.05),而胞浆游离钙离子浓度明显低于C组(P<0.01),超微结构表明A组和T组血小板脱颗粒现象较C组明显减轻。在A和T组之间各项参数均无统计学差异。结论:API可抑制凝血酶诱导的血小板活化反应。
, 百拇医药
中图法分类号 R973， Q582
Effects of API0134 on the Thrombin-induced Platelet Cyclic
Nucleotide and Cytoplasmic Free Ca2+
Li Shusheng1， Zhao Huayue2， Guo Zhiling2
1 Department of Emergency Medicine,2 Internal Medicine，Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
, 百拇医药
Abstract In order to observe the inhibitory effect of Andrographis Paniculata Isolate-0134(API0134,API) on the anti-thrombin-induced platelet activation, 24 domestic rabbits were randomly divided into API pretreated group (n=9), ticlopidine (T) pretreated group (n=8), and control (C) group (n=7). The rabbits received the treatment for 1 week. After induction with thrombin following parameters were measured: cAMP, cGMP and concentration of cytoplasmic free Ca2+. Ultrastructural changes of platelets were also examined. cAMP level was markedly higher in API and T groups than in C group (P<0.05), while the concentration of free Ca2+ in both API and T groups was markedly lower than in C group (P<0.01). The ultrastructural changes of platelets showed the degranulation in API and T groups was much milder than in C group. API may inhibit thrombin-induced activation of platelets.
, http://www.100md.com
Key words API0134; cyclic nucleotide; calcium ion; thrombin; platelet activating; ticlopidine
凝血酶是体内重要的生理性血小板激动剂,参与体内多种病理生理过程,如止血、血栓形成、溶栓后再闭塞等。本文旨在研究抗血小板药物——穿心莲有效成分(API0134)对凝血酶作用下血小板内环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)和胞浆游离钙离子([Ca2+]i)的影响,以探讨其在抗溶栓后再闭塞的机制,并与抗血小板药物噻氯匹定(ticlopidine,TP)进行比较。
1 材料和方法
1.1 动物模型
实验用健康日本大耳白兔(同济医科大学实验动物学部提供)24只,2.0～2.5 kg,饲养1周后随机分为3组,其中对照组(C组)7只,API0134组(A组)9只,给以API0134(层析纯、本院药厂植化室提供)50 mg/kg静注每d 1次,治疗1周;TP组(T组)8只,给以TP(sanofi winthrop) 50 mg/kg,灌胃,每d 1次,给药1周。
, 百拇医药
1.2 血小板透射电镜检查
给药1周后常规制备血小板悬液,用0.5 u/ml凝血酶作用后,离心得血小板沉淀,制片检查。
1.3 cAMP、cGMP测定
采用放射免疫测定法(药盒由上海中医学院提供)。
1.4 [Ca2+]i测定
采用Fura-2/AM(sigma)荧光标记后用荧光分光光度计(日立F-3000型)测定0.5 u/ml凝血酶作用下细胞内[Ca2+]i浓度。
1.5 统计方法
计量资料以
±s表示,采用样本均数t检验。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 血小板超微结构变化
在凝血酶作用下C组出现明显脱颗粒现象,致密颗粒明显减少,开放小管系统扩张。A组及T组脱颗粒明显减少,但A组与T组比较无明显差异。
2.2 凝血酶作用下cAMP,cGMP和[Ca2+]i变化
结果见附表。
在凝血酶作用下,用API0134和TP治疗1周后的兔血小板内cAMP都明显较对照组高(P<0.05),但A组和T组之间无统计学差异。cGMP在3个组之间均无统计学差异。cAMP/cGMP值在A组和T组较对照组高,但也无统计学区别。
附表 API0134对凝血酶作用下血小板内cAMP、cGMP、cAMP/cGMP及[Ca2+]i变化的影响
, http://www.100md.com
cAMP(pmol*)(n)
cGMP(pmol*)(n)
cAMP/cGMP
[Ca2+]i(nmol/L)(n)
C组
11.35±4.07(7)
2.79±2.0(7)
5.27±2.08
326.38±154.76(5)
A组
19.20±7.23(9)△
, 百拇医药
2.91±1.87(9)
9.36±5.47
104.23±41.82(5)△△
T组
19.05±5.67(8)△
2.57±1.24(8)
8.10±2.89
71.46±23.95(5)△△
与对照组比较 △ P<0.05 △△ P<0.01； * 均指109个血小板cAMP、cGMP浓度
, 百拇医药
在凝血酶作用下,C组血小板内[Ca2+]i为(326.38±154.76) nmol/L,A组和T组分别为(104.23±41.82)和(71.46±23.95) nmol/L,均显著低于C组(P<0.01)。A组与T组之间无统计学差异。
3 讨 论
cAMP作为血小板的第二信使对血小板功能的调节有重要作用,激活血小板的物质如凝血酶、TXA2、PGH2、PGG2等多数抑制腺苷环化酶(AC),降低cAMP水平,而升高cAMP的药物能抑制诱聚剂诱导的血小板激活[1]。cAMP增加时通过以下机制抑制血小板活化:①促进Ca2+摄取,抑制其释放,降低[Ca2+]i水平。血小板内Ca2+对血小板的功能起枢纽作用,如血小板的形态改变、聚集和释放均是[Ca2+]i增加的结果。血小板诱聚剂如肾上腺素、ADP、凝血酶均可通过各自受体、使[Ca2+]i增加。血小板Ca2+在静息状态下大部分处于结合状态或贮存状态,60 %以上贮存在致密管道系统中(DTS),是血小板的主要Ca2+功能池。cAMP增加时激活cAMP依赖性蛋白激酶使DTS膜上钙泵蛋白磷酸化,促进Ca2+摄取,抑制其释放;②影响血小板肌球蛋白磷酸化,进而抑制肌球蛋白与肌动蛋白的结合,抑制血小板活化;③由于[Ca2+]i降低,减少了磷脂酶C和磷脂酶A的激活,从而抑制花生四烯酸(AA)自膜释放,并抑制环氧化酶使前列腺素内过氧化物PGH2、PGG2合成减少;④促进PGE2和PGI2的合成;⑤抑制TXA2合成,抑制凝血酶与其受体结合等[2,3]。
, http://www.100md.com
cGMP则具有激活血小板的作用,它通过cGMP蛋白激酶使磷酸蛋白磷酸化,使cAMP蛋白激酶磷酸化底物发生去磷酸化,以减弱或消除cAMP或cAMP蛋白激酶所引起的生物效应[4];或通过磷酸二酯酶Ⅲ(PDEⅢ)使cAMP水解增加[5]。近年来研究发现有些抗血小板药物如一氧化氮或内皮舒张因子(EDRF)抗血小板聚集时cGMP含量增加,而cAMP无变化,因此目前认为cAMP和cGMP在调节血小板功能时发挥协同作用。还有些作者认为cAMP/cGMP比值可能比单纯cAMP、cGMP变化更有意义,机制还不清楚[2]。药物对cAMP的影响,主要通过抑制或减少AC和PDE活性而产生。凝血酶是一很强的血小板激动剂,它与血小板上特异受体(糖蛋白Ib-TⅩ复合物)结合,抑制AC活性,降低cAMP水平,并使[Ca2+]i增加[6,7]。凝血酶活性增加是心肌梗死溶栓治疗后再闭塞的重要机制之一。API0134已被证实对钙调素依赖性和非依赖性PDE均有抑制作用[8,9],本实验结果证实它可升高凝血酶作用下cAMP水平,并轻度升高cGMP,与cAMP增加相应表现为脱颗粒现象减轻和[Ca2+]i降低(致密颗粒含大量Ca2+,脱颗粒同时释放到胞浆,使[Ca2+]i增加),即API0134可抑制凝血酶引起的血小板活化。凝血酶活性增加是血栓性疾病和溶栓治疗后再闭塞发生的重要机制之一[10]。本文为API0134在预防血栓形成和溶栓后再闭塞治疗中的应用提供了理论依据。
, 百拇医药
TP是一种已被广泛用于临床的抗血小板药物,它通过抑制ADP与血小板膜受体结合,增加血小板cAMP水平,抑制纤维蛋白原受体的暴露而起作用。本文通过比较发现,API0134对凝血酶作用下血小板内cAMP和[Ca2+]i的影响与TP类似。
*卫生部默沙东科研基金资助课题[(95)0411号]
作者简介：李树生，男，1965年生，主治医师，医学博士
参考文献
1 刘俊田,邱培伦.cAMP在血小板调节中的作用.国外医学生理病理科学与临床分册, 1987,7(4):185
2 许澍淮.环核苷酸与血小板功能.生理科学进展, 1992,23(4):318
, http://www.100md.com
3 王振义. 血小板功能的病理生理进展.中华内科杂志, 1984,23(12):768
4 郑广华编著.环核苷酸与临床.天津:天津科学技术出版社,1985.20
5 Grant P G, Colman R W. Purification and characterization of a human platelet cyclic nucleotide phosphodisterase. Biochemistry, 1994,23:1801
6 阮长耿主编.血栓与止血——现代理论和临床实践.南昌:江苏科学技术出版 社,1994.50
7 Feinstein M B, Egan J J, Shaafi R I et al. The cytoplasmic concentration of free calcium in platelet is controlled by stimulation of cyclic AMP production(PGD2, PGE1, Forskolin). Biochem Biophys Res Com,1983, 113:598
, 百拇医药
8 付良武,赵华月,聂 磊等. API0134对钙调素非依赖型环核苷酸磷酸二酯酶的影响.中国药理学通报,1995,11(2):110
9 聂 磊,付良武,张 婷等.API0134对钙调素及其依赖型环核苷酸磷酸二酯酶的作用.中国药理学通报,1994,10(5):341
10 Eisenberg P R. Mechanisms of reocclusion after coronary thrombolysis Z. Kardiol, 1993,82(suppl 2):175
收稿日期：1998-06-29, http://www.100md.com
单位：李树生 同济医科大学附属同济医院 急诊科 武汉 430030；赵华月 郭志凌 同济医科大学附属同济医院 内科心血管， 武汉 430030
关键词：API0134；环磷酸腺苷；钙离子；凝血酶；血小板活化；噻氯匹定
同济医科大学学报990219 摘要 为观察穿心莲有效成分(API0134)对凝血酶作用下血小板活化的抑制作用,将家兔24只随机分为API0134(A)组(n=9),噻氯匹定(T)组(n=8)和对照组(n=7),治疗1周,然后检测凝血酶作用下血小板内cAMP、cGMP和胞浆游离钙离子浓度,以及血小板超微结构。结果表明cAMP水平在A、T两组显著高于C组(P<0.05),而胞浆游离钙离子浓度明显低于C组(P<0.01),超微结构表明A组和T组血小板脱颗粒现象较C组明显减轻。在A和T组之间各项参数均无统计学差异。结论:API可抑制凝血酶诱导的血小板活化反应。
, 百拇医药
中图法分类号 R973， Q582
Effects of API0134 on the Thrombin-induced Platelet Cyclic
Nucleotide and Cytoplasmic Free Ca2+
Li Shusheng1， Zhao Huayue2， Guo Zhiling2
1 Department of Emergency Medicine,2 Internal Medicine，Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
, 百拇医药
Abstract In order to observe the inhibitory effect of Andrographis Paniculata Isolate-0134(API0134,API) on the anti-thrombin-induced platelet activation, 24 domestic rabbits were randomly divided into API pretreated group (n=9), ticlopidine (T) pretreated group (n=8), and control (C) group (n=7). The rabbits received the treatment for 1 week. After induction with thrombin following parameters were measured: cAMP, cGMP and concentration of cytoplasmic free Ca2+. Ultrastructural changes of platelets were also examined. cAMP level was markedly higher in API and T groups than in C group (P<0.05), while the concentration of free Ca2+ in both API and T groups was markedly lower than in C group (P<0.01). The ultrastructural changes of platelets showed the degranulation in API and T groups was much milder than in C group. API may inhibit thrombin-induced activation of platelets.
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Key words API0134; cyclic nucleotide; calcium ion; thrombin; platelet activating; ticlopidine
凝血酶是体内重要的生理性血小板激动剂,参与体内多种病理生理过程,如止血、血栓形成、溶栓后再闭塞等。本文旨在研究抗血小板药物——穿心莲有效成分(API0134)对凝血酶作用下血小板内环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)和胞浆游离钙离子([Ca2+]i)的影响,以探讨其在抗溶栓后再闭塞的机制,并与抗血小板药物噻氯匹定(ticlopidine,TP)进行比较。
1 材料和方法
1.1 动物模型
实验用健康日本大耳白兔(同济医科大学实验动物学部提供)24只,2.0～2.5 kg,饲养1周后随机分为3组,其中对照组(C组)7只,API0134组(A组)9只,给以API0134(层析纯、本院药厂植化室提供)50 mg/kg静注每d 1次,治疗1周;TP组(T组)8只,给以TP(sanofi winthrop) 50 mg/kg,灌胃,每d 1次,给药1周。
, 百拇医药
1.2 血小板透射电镜检查
给药1周后常规制备血小板悬液,用0.5 u/ml凝血酶作用后,离心得血小板沉淀,制片检查。
1.3 cAMP、cGMP测定
采用放射免疫测定法(药盒由上海中医学院提供)。
1.4 [Ca2+]i测定
采用Fura-2/AM(sigma)荧光标记后用荧光分光光度计(日立F-3000型)测定0.5 u/ml凝血酶作用下细胞内[Ca2+]i浓度。
1.5 统计方法
计量资料以
±s表示,采用样本均数t检验。, 百拇医药
2 结 果
2.1 血小板超微结构变化
在凝血酶作用下C组出现明显脱颗粒现象,致密颗粒明显减少,开放小管系统扩张。A组及T组脱颗粒明显减少,但A组与T组比较无明显差异。
2.2 凝血酶作用下cAMP,cGMP和[Ca2+]i变化
结果见附表。
在凝血酶作用下,用API0134和TP治疗1周后的兔血小板内cAMP都明显较对照组高(P<0.05),但A组和T组之间无统计学差异。cGMP在3个组之间均无统计学差异。cAMP/cGMP值在A组和T组较对照组高,但也无统计学区别。
附表 API0134对凝血酶作用下血小板内cAMP、cGMP、cAMP/cGMP及[Ca2+]i变化的影响
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cAMP(pmol*)(n)
cGMP(pmol*)(n)
cAMP/cGMP
[Ca2+]i(nmol/L)(n)
C组
11.35±4.07(7)
2.79±2.0(7)
5.27±2.08
326.38±154.76(5)
A组
19.20±7.23(9)△
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2.91±1.87(9)
9.36±5.47
104.23±41.82(5)△△
T组
19.05±5.67(8)△
2.57±1.24(8)
8.10±2.89
71.46±23.95(5)△△
与对照组比较 △ P<0.05 △△ P<0.01； * 均指109个血小板cAMP、cGMP浓度
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在凝血酶作用下,C组血小板内[Ca2+]i为(326.38±154.76) nmol/L,A组和T组分别为(104.23±41.82)和(71.46±23.95) nmol/L,均显著低于C组(P<0.01)。A组与T组之间无统计学差异。
3 讨 论
cAMP作为血小板的第二信使对血小板功能的调节有重要作用,激活血小板的物质如凝血酶、TXA2、PGH2、PGG2等多数抑制腺苷环化酶(AC),降低cAMP水平,而升高cAMP的药物能抑制诱聚剂诱导的血小板激活[1]。cAMP增加时通过以下机制抑制血小板活化:①促进Ca2+摄取,抑制其释放,降低[Ca2+]i水平。血小板内Ca2+对血小板的功能起枢纽作用,如血小板的形态改变、聚集和释放均是[Ca2+]i增加的结果。血小板诱聚剂如肾上腺素、ADP、凝血酶均可通过各自受体、使[Ca2+]i增加。血小板Ca2+在静息状态下大部分处于结合状态或贮存状态,60 %以上贮存在致密管道系统中(DTS),是血小板的主要Ca2+功能池。cAMP增加时激活cAMP依赖性蛋白激酶使DTS膜上钙泵蛋白磷酸化,促进Ca2+摄取,抑制其释放;②影响血小板肌球蛋白磷酸化,进而抑制肌球蛋白与肌动蛋白的结合,抑制血小板活化;③由于[Ca2+]i降低,减少了磷脂酶C和磷脂酶A的激活,从而抑制花生四烯酸(AA)自膜释放,并抑制环氧化酶使前列腺素内过氧化物PGH2、PGG2合成减少;④促进PGE2和PGI2的合成;⑤抑制TXA2合成,抑制凝血酶与其受体结合等[2,3]。
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cGMP则具有激活血小板的作用,它通过cGMP蛋白激酶使磷酸蛋白磷酸化,使cAMP蛋白激酶磷酸化底物发生去磷酸化,以减弱或消除cAMP或cAMP蛋白激酶所引起的生物效应[4];或通过磷酸二酯酶Ⅲ(PDEⅢ)使cAMP水解增加[5]。近年来研究发现有些抗血小板药物如一氧化氮或内皮舒张因子(EDRF)抗血小板聚集时cGMP含量增加,而cAMP无变化,因此目前认为cAMP和cGMP在调节血小板功能时发挥协同作用。还有些作者认为cAMP/cGMP比值可能比单纯cAMP、cGMP变化更有意义,机制还不清楚[2]。药物对cAMP的影响,主要通过抑制或减少AC和PDE活性而产生。凝血酶是一很强的血小板激动剂,它与血小板上特异受体(糖蛋白Ib-TⅩ复合物)结合,抑制AC活性,降低cAMP水平,并使[Ca2+]i增加[6,7]。凝血酶活性增加是心肌梗死溶栓治疗后再闭塞的重要机制之一。API0134已被证实对钙调素依赖性和非依赖性PDE均有抑制作用[8,9],本实验结果证实它可升高凝血酶作用下cAMP水平,并轻度升高cGMP,与cAMP增加相应表现为脱颗粒现象减轻和[Ca2+]i降低(致密颗粒含大量Ca2+,脱颗粒同时释放到胞浆,使[Ca2+]i增加),即API0134可抑制凝血酶引起的血小板活化。凝血酶活性增加是血栓性疾病和溶栓治疗后再闭塞发生的重要机制之一[10]。本文为API0134在预防血栓形成和溶栓后再闭塞治疗中的应用提供了理论依据。
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TP是一种已被广泛用于临床的抗血小板药物,它通过抑制ADP与血小板膜受体结合,增加血小板cAMP水平,抑制纤维蛋白原受体的暴露而起作用。本文通过比较发现,API0134对凝血酶作用下血小板内cAMP和[Ca2+]i的影响与TP类似。
*卫生部默沙东科研基金资助课题[(95)0411号]
作者简介：李树生，男，1965年生，主治医师，医学博士
参考文献
1 刘俊田,邱培伦.cAMP在血小板调节中的作用.国外医学生理病理科学与临床分册, 1987,7(4):185
2 许澍淮.环核苷酸与血小板功能.生理科学进展, 1992,23(4):318
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3 王振义. 血小板功能的病理生理进展.中华内科杂志, 1984,23(12):768
4 郑广华编著.环核苷酸与临床.天津:天津科学技术出版社,1985.20
5 Grant P G, Colman R W. Purification and characterization of a human platelet cyclic nucleotide phosphodisterase. Biochemistry, 1994,23:1801
6 阮长耿主编.血栓与止血——现代理论和临床实践.南昌:江苏科学技术出版 社,1994.50
7 Feinstein M B, Egan J J, Shaafi R I et al. The cytoplasmic concentration of free calcium in platelet is controlled by stimulation of cyclic AMP production(PGD2, PGE1, Forskolin). Biochem Biophys Res Com,1983, 113:598
, 百拇医药
8 付良武,赵华月,聂 磊等. API0134对钙调素非依赖型环核苷酸磷酸二酯酶的影响.中国药理学通报,1995,11(2):110
9 聂 磊,付良武,张 婷等.API0134对钙调素及其依赖型环核苷酸磷酸二酯酶的作用.中国药理学通报,1994,10(5):341
10 Eisenberg P R. Mechanisms of reocclusion after coronary thrombolysis Z. Kardiol, 1993,82(suppl 2):175
收稿日期：1998-06-29, http://www.100md.com