庚型肝炎病毒包膜糖蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达*
作者：朱诗应 潘 卫 戚中田
单位：第二军医大学微生物学教研室，上海200433
关键词：庚型肝炎病毒；包膜糖蛋白E2；昆虫细胞；基因表达
中国病毒学990208 摘 要 用PCR扩增出HGV E2全基因，克隆进杆状病毒表达载体pFASTBACHTa中，构建成重组转座载体pFASTBAC-E2，转化DH10BAC大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性菌落，抽提大分子质粒DNA，获得含HGV E2基因的重组杆状病毒穿梭载体，转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞，出现细胞病变后，收集含有重组病毒颗粒的培养上清，重新感染草地夜蛾Sf9单层细胞及甜菜夜蛾幼虫，分别收集Sf9细胞和甜菜夜蛾幼虫体内的血淋巴细胞，进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，可见表达的融合蛋白带，经亲和层析进行蛋白纯化，用ELISA方法检测各类血清标本，初步研究HGV E2糖蛋白的抗原性。
, 百拇医药
Expression of E2 Glycoprotein Gene of Hepatitis G Virus in Insect Cells
Zhu Shiying Pan Wei Qi Zhongtian
(Department of Microbiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433)
Abstract Hepatitis G virus E2 glycoprotein gene was amplified by polymerase chain reaction, and was inserted into baculovirus expression vector pFASTBACHTa, constructing a recombinant transposing vector pFASTBAC-E2. The plasmid pFASTBAC-E2 was transformed into DH10BAC competent E. coli cells. High molecular weight DNA was prepared from the overnight cultures from the selected E. coli colonies, which was recombinant baculovirus shuttle vector containing HGV E2 gene, named Bacmid-E2. The Bacmid-E2 was transfected into Spodoptera fragiperda (Sf9) cells to get the recombinant virus. Fresh insect Sf9 cells and larvae of Spodoptera exigua were infected with the recombinant virus to express the target protein. The E2 glycoprotein recovering from the Sf9 cells and hemolymph cells of larvae of Spodoptera exigua exhibited a molecular mass of approximataly 54000D. Purified HGV E2 glycoprotein using affinity chromatography was used to develop an ELISA for detection of HGV E2 antibodies in human sera.
, 百拇医药
Key words Hepatitis G virus, Envelope glycoprotein E2, Insect cells, Gene expression
近年来发现的庚型肝炎病毒(HGV)属黄病毒科成员之一，其包膜糖蛋白E2含有产生中和抗体的抗原表位，HGV感染者出现E2抗体往往伴随着病毒血症的消失，是疾病恢复的重要标志[1]。HGV E2抗体的检测可以动态地反映HGV感染者的病情发展及转归。所以获取高活性的HGV E2蛋白，在研究HGV抗原表位、致病机理以及研制完善的诊断试剂等方面具有重要意义。我们选用最新建立的BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统[2]，首次在昆虫细胞中表达了HGV E2糖蛋白。
1 材料与方法
1.1 BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统
, 百拇医药
表达载体pFASTBACHTa、大肠杆菌DH10BAC、草地夜蛾Sf9细胞及甜菜夜蛾幼虫虫卵均由武汉大学病毒学研究所齐义鹏教授提供。Sf9细胞用含有10%胎牛血清的Grace's培养基(GIBCO/BRL公司产品)在28℃培养并传代保存。
1.2 HGV E2全基因
经过计算机分析并设计扩增HGV E2全基因的PCR引物，上游引物序列为5′GTCAGAATTCGCTCCCGCCTCTGTCTTG 3′，5′端加EcoRI酶切位点；下游引物序列为5′AGCAAAGCTTTCTAGAACTGCCAGCTGGTTCAC3′,5′端带HindⅢ酶切位点。以含有HGV E2全长cDNA的HGV-Iw质粒为模板[3]，按常规PCR程序扩增获得长度为1128bp的HGV E2全基因。
1.3 重组转座载体的构建
, http://www.100md.com
用EcoRI和HindⅢ分别双酶切HGV E2全基因和转座载体pFASTBACHTa质粒，用琼脂糖凝胶电泳法回收、纯化，连接后转化受体菌DH5α，选出同时抗Amp和抗Gm的重组子，进行酶切鉴定，得到含HGV E2全基因的重组转座载体，命名为pFASTBAC-E2。
1.4 重组杆状病毒穿梭载体的获得
将pFASTBAC-E2转化DH10BAC大肠杆菌感受态细胞(其中含有一个杆状病毒穿梭载体，简称Bacmid，还有一个助手质粒)，37℃4h复苏后，稀释10-1、10-2、10-3倍，分别涂布含“三抗”(50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素、100μg/mL X-gal、20μg/mL IPTG)的LB平板，37℃培养24～48h后挑选白色菌落，接种LB培养基，37℃摇床过夜后提取高分子量质粒，获得插入HGV E2基因的重组杆状病毒穿梭载体，称为Bacmid-E2。
, 百拇医药
1.5 Bacmid-E2转染Sf9细胞及E2蛋白的表达
每10mL细胞瓶接种1.5×106个Sf9细胞，使用Grace's培养基在28℃培养，待细胞贴壁后，用Lipofectin法将Bacmid-E2转染Sf9细胞，倒置显微镜下观察到Sf9细胞病变后，收集含有重组杆状病毒颗粒的培养上清，作为毒种重新感染Sf9单层细胞，2～3d后收集细胞，经煮沸裂解后进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.6 重组杆状病毒感染甜菜夜蛾幼虫及E2蛋白的表达
将甜菜夜蛾幼虫虫卵在25℃孵化成幼虫，分装于青霉素瓶内以人工饲料喂养4～6d后，每头幼虫注射上述毒种1～2μL，4～5d后感染的幼虫全身脓肿，消毒后剪幼虫倒数第二对腹足收集血淋巴液，离心后将细胞和上清液进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.7 E2糖蛋白的纯化及抗原性测定
, 百拇医药
将重组杆状病毒感染的Sf9细胞和甜菜夜蛾幼虫血淋巴细胞进行超声波破碎后，用Ni-NTA树脂对表达的带有6个组氨酸的E2融合蛋白进行亲和层析，具体步骤按试剂盒(GIBCO/BRL公司产品，Cat：No.10608-016)说明书操作。对纯化的蛋白进行1∶100稀释后包被条排孔，4℃过夜后用间接ELISA法检测各类血清标本。
2 结果
2.1 重组转座载体的构建及鉴定
具体构建过程如图1所示。用EcoRI和HindⅢ双酶切重组转座载体pFASTBAC-E2，所释放的片段大小与HGV E2基因相符(图2)。
图1 重组转座载体的构建
, 百拇医药
Fig.1 Construction of recombinant transposing vector, pFASTBAC-E2
图2 重组转座载体的酶切鉴定
Fig.2 Restriction endonuclease digestion of recombinant transposing vector
1～4： pFASTBAC-E2/EcoRI+HindⅢ； 5:pFASTBACHTa；6:λDNA/EcoRI+HindⅢ marker.
2.2 重组杆状病毒穿梭载体的鉴定
, 百拇医药
pFASTBAC-E2转化DH10BAC大肠杆菌感受态细胞，筛选平皿上的白色菌落接种LB培养基，摇床过夜后提取质粒，紫外透射仪下见高分子量的DNA条带，将其稀释103倍后作为PCR模板，用上述引物进行PCR，能扩增出特异的HGV E2片段(图3)，证实Bacmid-E2为插入HGV E2基因的重组杆状病毒穿梭载体。
图3 Bacmid-E2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳
Fig.3 Electrophoresis of PCR product of Bacmid-E2 1：PCR products of Bacmid-E2； 2:Positive control；3～5: Negtive control； 6:λDNA/EcoRI+HindⅢ marker
, http://www.100md.com
2.3 Bacmid-E2转染Sf9细胞
Bacmid-E2转染Sf9细胞4d后，倒置显微镜下可见转染Sf9细胞核膨大，细胞折光性减低，胞内颗粒增大直至破碎，与正常Sf9细胞差别明显(图4)，此时收集的培养上清，即含有大量的重组杆状病毒。
图4 Sf9细胞的显微镜观察
Fig.4 Observation of Sf9 cells under light microscope 1: Normal Sf9 cells； 2: Bacmid-E2 transfected Sf9 cells.
2.4 HGV E2糖蛋白在Sf9细胞及甜菜夜蛾幼虫体内的表达
, http://www.100md.com 所收集的重组杆状病毒感染的Sf9单层细胞以及甜菜夜蛾幼虫血淋巴细胞，裂解后进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考马斯亮兰R-250染色，均可见分子量约为54000D的融合蛋白带，表达蛋白的大小与HGV E2糖蛋白理论值相符，而对照Sf9细胞及甜菜夜蛾幼虫血淋巴液上清电泳未见此蛋白带(图5)。
图5 表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果
Fig.5 SDS-PAGE analysis of expressed protein 1:normal Sf9 cells；2: sf9 cells infected with recombinant virus； 3.Low molecular weight protein marker (97400,66200,4300,3100,2000,14400)；4～5: hemolymph cells from larvae of Spodoptera exigua infected with recombinant virus；6～7: hemolymph fluid from larvae of Spodoptera exigua infected with recombinant virus.
, 百拇医药
*the arrow shows HGV E2 protein band,molecular weight is approximataly 54000.
2.5 HGV E2糖蛋白抗原的ELISA检测
5份经RT-PCR检测为HGV RNA阳性的血清标本，抗HGV E2抗体均呈阴性反应；16份肝炎患者(丙肝或乙肝)血清中，抗HGV E2抗体阳性者3份；在22例血透病人血清中抗HGV E2抗体阳性者6例；48例正常对照血清中测出抗HGV E2抗体阳性1份。
3 讨论
HGV为单股正链RNA病毒，基因组全长9.4kb左右，仅有一个开放阅读框架(ORF)，编码一个约2900个氨基酸的多聚蛋白前体[4]，其中结构区在宿主细胞蛋白酶的切割下，可加工成多个结构蛋白(如E1和E2蛋白)[5，6]。文献报道原核系统表达的HGV重组蛋白对HGV阳性者的抗体反应性只达25%左右[7]，这可能是由于原核表达的蛋白多为线性抗原，缺乏依赖于多肽折叠或翻译后加工才能形成的抗原表位。真核表达系统也存在细胞培养烦琐、表达量不高等缺陷。因此我们首次选用最新的BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统，利用细菌转座子原理将转座载体上的表达盒定点转座到能够在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体上，通过细菌蓝白斑筛选后，直接小量提取阳性菌落质粒DNA，转染Sf9细胞所得到的子代病毒即为重组病毒，随后可用于感染新鲜昆虫Sf9细胞进行蛋白质的表达、纯化及分析。该表达系统操作简单、快速、表达量高，还能对蛋白进行表达后的修饰和加工，保持表达蛋白的生物活性。而且我们选用新的表达载体上带有6个组氨酸配体，易于用亲
, http://www.100md.com
和层析进行蛋白纯化。用纯化的E2蛋白进行ELISA检测结果表明，在丙肝和乙肝患者中存在部分HGV共感染者，血透病人构成了HGV感染的高危人群之一，更有意义的是抗E2抗体的产生和HGV病毒血症的出现呈现此消彼长的特点，表明抗E2抗体对体内病毒的清除具有十分重要的作用，因此深入研究HGV E2蛋白对确定HGV的中和抗原表位、致病机理、疫苗及诊断试剂的开发都具有重要意义。
致谢 研究过程中得到武汉大学病毒研究所齐义鹏教授及朱应博士的热情指导，深表谢忱!
* 本课题受国家自然科学基金(资助号 39770393)和军队杰出人才基金资助
参考文献
[1] Pilot-Matias T J, Carrick R J, Coleman P F et al. Expression of the GB virus C E2 glycoprotein using the Semliki Forest virus vector system and its utility as a serologic marker. Virology, 1996,225:282～292
, 百拇医药
[2] Luckow V A, Lee S C, Barry G F et al. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol, 1993, 67:4566～4579
[3] Shao L, Shinzawa H, Ishikawa K et al. Sequence of hepatitis G virus genome isolated from a Japanese patient with non-A-E-hepatitis: amplification and cloning by long reverse transcription-PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1996,228:785～791
, 百拇医药
[4] Pilot-Matias T J, Muernoff A S, Simons J N et al. Identification of antigenic regions in the GB hepatitis viruses GBV-A, GBV-B and GBV-C. J Med Virol, 1996, 48:329～338
[5] Leary T Y, Muerhoff A S, Simons J N et al. Sequence and genomic organization of GBV-C, a novel member of the flaviviride associated with human non-A-E-hepatitis. J Med Virol, 1996,48:60～67
[6] Dille B T, Surowy T K, Gutierrez R A et al. ELISA for the detection of antibodies to the E2 protein of GBV-C. J Infect Dis, 1997,175:458～461
[7] Dawson G J, Schlauder G G, Pilot-Matias T J et al. Prevalence studies of GB virus-C infection using reverse transcriptase polymerase chain reaction. J Med Virol, 1996,50:97～103
收稿日期：1998-05-04，修回日期：1998-09-11, 百拇医药
单位：第二军医大学微生物学教研室，上海200433
关键词：庚型肝炎病毒；包膜糖蛋白E2；昆虫细胞；基因表达
中国病毒学990208 摘 要 用PCR扩增出HGV E2全基因，克隆进杆状病毒表达载体pFASTBACHTa中，构建成重组转座载体pFASTBAC-E2，转化DH10BAC大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性菌落，抽提大分子质粒DNA，获得含HGV E2基因的重组杆状病毒穿梭载体，转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞，出现细胞病变后，收集含有重组病毒颗粒的培养上清，重新感染草地夜蛾Sf9单层细胞及甜菜夜蛾幼虫，分别收集Sf9细胞和甜菜夜蛾幼虫体内的血淋巴细胞，进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，可见表达的融合蛋白带，经亲和层析进行蛋白纯化，用ELISA方法检测各类血清标本，初步研究HGV E2糖蛋白的抗原性。
, 百拇医药
Expression of E2 Glycoprotein Gene of Hepatitis G Virus in Insect Cells
Zhu Shiying Pan Wei Qi Zhongtian
(Department of Microbiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433)
Abstract Hepatitis G virus E2 glycoprotein gene was amplified by polymerase chain reaction, and was inserted into baculovirus expression vector pFASTBACHTa, constructing a recombinant transposing vector pFASTBAC-E2. The plasmid pFASTBAC-E2 was transformed into DH10BAC competent E. coli cells. High molecular weight DNA was prepared from the overnight cultures from the selected E. coli colonies, which was recombinant baculovirus shuttle vector containing HGV E2 gene, named Bacmid-E2. The Bacmid-E2 was transfected into Spodoptera fragiperda (Sf9) cells to get the recombinant virus. Fresh insect Sf9 cells and larvae of Spodoptera exigua were infected with the recombinant virus to express the target protein. The E2 glycoprotein recovering from the Sf9 cells and hemolymph cells of larvae of Spodoptera exigua exhibited a molecular mass of approximataly 54000D. Purified HGV E2 glycoprotein using affinity chromatography was used to develop an ELISA for detection of HGV E2 antibodies in human sera.
, 百拇医药
Key words Hepatitis G virus, Envelope glycoprotein E2, Insect cells, Gene expression
近年来发现的庚型肝炎病毒(HGV)属黄病毒科成员之一，其包膜糖蛋白E2含有产生中和抗体的抗原表位，HGV感染者出现E2抗体往往伴随着病毒血症的消失，是疾病恢复的重要标志[1]。HGV E2抗体的检测可以动态地反映HGV感染者的病情发展及转归。所以获取高活性的HGV E2蛋白，在研究HGV抗原表位、致病机理以及研制完善的诊断试剂等方面具有重要意义。我们选用最新建立的BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统[2]，首次在昆虫细胞中表达了HGV E2糖蛋白。
1 材料与方法
1.1 BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统
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表达载体pFASTBACHTa、大肠杆菌DH10BAC、草地夜蛾Sf9细胞及甜菜夜蛾幼虫虫卵均由武汉大学病毒学研究所齐义鹏教授提供。Sf9细胞用含有10%胎牛血清的Grace's培养基(GIBCO/BRL公司产品)在28℃培养并传代保存。
1.2 HGV E2全基因
经过计算机分析并设计扩增HGV E2全基因的PCR引物，上游引物序列为5′GTCAGAATTCGCTCCCGCCTCTGTCTTG 3′，5′端加EcoRI酶切位点；下游引物序列为5′AGCAAAGCTTTCTAGAACTGCCAGCTGGTTCAC3′,5′端带HindⅢ酶切位点。以含有HGV E2全长cDNA的HGV-Iw质粒为模板[3]，按常规PCR程序扩增获得长度为1128bp的HGV E2全基因。
1.3 重组转座载体的构建
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用EcoRI和HindⅢ分别双酶切HGV E2全基因和转座载体pFASTBACHTa质粒，用琼脂糖凝胶电泳法回收、纯化，连接后转化受体菌DH5α，选出同时抗Amp和抗Gm的重组子，进行酶切鉴定，得到含HGV E2全基因的重组转座载体，命名为pFASTBAC-E2。
1.4 重组杆状病毒穿梭载体的获得
将pFASTBAC-E2转化DH10BAC大肠杆菌感受态细胞(其中含有一个杆状病毒穿梭载体，简称Bacmid，还有一个助手质粒)，37℃4h复苏后，稀释10-1、10-2、10-3倍，分别涂布含“三抗”(50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素、100μg/mL X-gal、20μg/mL IPTG)的LB平板，37℃培养24～48h后挑选白色菌落，接种LB培养基，37℃摇床过夜后提取高分子量质粒，获得插入HGV E2基因的重组杆状病毒穿梭载体，称为Bacmid-E2。
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1.5 Bacmid-E2转染Sf9细胞及E2蛋白的表达
每10mL细胞瓶接种1.5×106个Sf9细胞，使用Grace's培养基在28℃培养，待细胞贴壁后，用Lipofectin法将Bacmid-E2转染Sf9细胞，倒置显微镜下观察到Sf9细胞病变后，收集含有重组杆状病毒颗粒的培养上清，作为毒种重新感染Sf9单层细胞，2～3d后收集细胞，经煮沸裂解后进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.6 重组杆状病毒感染甜菜夜蛾幼虫及E2蛋白的表达
将甜菜夜蛾幼虫虫卵在25℃孵化成幼虫，分装于青霉素瓶内以人工饲料喂养4～6d后，每头幼虫注射上述毒种1～2μL，4～5d后感染的幼虫全身脓肿，消毒后剪幼虫倒数第二对腹足收集血淋巴液，离心后将细胞和上清液进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.7 E2糖蛋白的纯化及抗原性测定
, 百拇医药
将重组杆状病毒感染的Sf9细胞和甜菜夜蛾幼虫血淋巴细胞进行超声波破碎后，用Ni-NTA树脂对表达的带有6个组氨酸的E2融合蛋白进行亲和层析，具体步骤按试剂盒(GIBCO/BRL公司产品，Cat：No.10608-016)说明书操作。对纯化的蛋白进行1∶100稀释后包被条排孔，4℃过夜后用间接ELISA法检测各类血清标本。
2 结果
2.1 重组转座载体的构建及鉴定
具体构建过程如图1所示。用EcoRI和HindⅢ双酶切重组转座载体pFASTBAC-E2，所释放的片段大小与HGV E2基因相符(图2)。
图1 重组转座载体的构建
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Fig.1 Construction of recombinant transposing vector, pFASTBAC-E2
图2 重组转座载体的酶切鉴定
Fig.2 Restriction endonuclease digestion of recombinant transposing vector
1～4： pFASTBAC-E2/EcoRI+HindⅢ； 5:pFASTBACHTa；6:λDNA/EcoRI+HindⅢ marker.
2.2 重组杆状病毒穿梭载体的鉴定
, 百拇医药
pFASTBAC-E2转化DH10BAC大肠杆菌感受态细胞，筛选平皿上的白色菌落接种LB培养基，摇床过夜后提取质粒，紫外透射仪下见高分子量的DNA条带，将其稀释103倍后作为PCR模板，用上述引物进行PCR，能扩增出特异的HGV E2片段(图3)，证实Bacmid-E2为插入HGV E2基因的重组杆状病毒穿梭载体。
图3 Bacmid-E2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳
Fig.3 Electrophoresis of PCR product of Bacmid-E2 1：PCR products of Bacmid-E2； 2:Positive control；3～5: Negtive control； 6:λDNA/EcoRI+HindⅢ marker
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2.3 Bacmid-E2转染Sf9细胞
Bacmid-E2转染Sf9细胞4d后，倒置显微镜下可见转染Sf9细胞核膨大，细胞折光性减低，胞内颗粒增大直至破碎，与正常Sf9细胞差别明显(图4)，此时收集的培养上清，即含有大量的重组杆状病毒。
图4 Sf9细胞的显微镜观察
Fig.4 Observation of Sf9 cells under light microscope 1: Normal Sf9 cells； 2: Bacmid-E2 transfected Sf9 cells.
2.4 HGV E2糖蛋白在Sf9细胞及甜菜夜蛾幼虫体内的表达
, http://www.100md.com 所收集的重组杆状病毒感染的Sf9单层细胞以及甜菜夜蛾幼虫血淋巴细胞，裂解后进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考马斯亮兰R-250染色，均可见分子量约为54000D的融合蛋白带，表达蛋白的大小与HGV E2糖蛋白理论值相符，而对照Sf9细胞及甜菜夜蛾幼虫血淋巴液上清电泳未见此蛋白带(图5)。
图5 表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果
Fig.5 SDS-PAGE analysis of expressed protein 1:normal Sf9 cells；2: sf9 cells infected with recombinant virus； 3.Low molecular weight protein marker (97400,66200,4300,3100,2000,14400)；4～5: hemolymph cells from larvae of Spodoptera exigua infected with recombinant virus；6～7: hemolymph fluid from larvae of Spodoptera exigua infected with recombinant virus.
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*the arrow shows HGV E2 protein band,molecular weight is approximataly 54000.
2.5 HGV E2糖蛋白抗原的ELISA检测
5份经RT-PCR检测为HGV RNA阳性的血清标本，抗HGV E2抗体均呈阴性反应；16份肝炎患者(丙肝或乙肝)血清中，抗HGV E2抗体阳性者3份；在22例血透病人血清中抗HGV E2抗体阳性者6例；48例正常对照血清中测出抗HGV E2抗体阳性1份。
3 讨论
HGV为单股正链RNA病毒，基因组全长9.4kb左右，仅有一个开放阅读框架(ORF)，编码一个约2900个氨基酸的多聚蛋白前体[4]，其中结构区在宿主细胞蛋白酶的切割下，可加工成多个结构蛋白(如E1和E2蛋白)[5，6]。文献报道原核系统表达的HGV重组蛋白对HGV阳性者的抗体反应性只达25%左右[7]，这可能是由于原核表达的蛋白多为线性抗原，缺乏依赖于多肽折叠或翻译后加工才能形成的抗原表位。真核表达系统也存在细胞培养烦琐、表达量不高等缺陷。因此我们首次选用最新的BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统，利用细菌转座子原理将转座载体上的表达盒定点转座到能够在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体上，通过细菌蓝白斑筛选后，直接小量提取阳性菌落质粒DNA，转染Sf9细胞所得到的子代病毒即为重组病毒，随后可用于感染新鲜昆虫Sf9细胞进行蛋白质的表达、纯化及分析。该表达系统操作简单、快速、表达量高，还能对蛋白进行表达后的修饰和加工，保持表达蛋白的生物活性。而且我们选用新的表达载体上带有6个组氨酸配体，易于用亲
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和层析进行蛋白纯化。用纯化的E2蛋白进行ELISA检测结果表明，在丙肝和乙肝患者中存在部分HGV共感染者，血透病人构成了HGV感染的高危人群之一，更有意义的是抗E2抗体的产生和HGV病毒血症的出现呈现此消彼长的特点，表明抗E2抗体对体内病毒的清除具有十分重要的作用，因此深入研究HGV E2蛋白对确定HGV的中和抗原表位、致病机理、疫苗及诊断试剂的开发都具有重要意义。
致谢 研究过程中得到武汉大学病毒研究所齐义鹏教授及朱应博士的热情指导，深表谢忱!
* 本课题受国家自然科学基金(资助号 39770393)和军队杰出人才基金资助
参考文献
[1] Pilot-Matias T J, Carrick R J, Coleman P F et al. Expression of the GB virus C E2 glycoprotein using the Semliki Forest virus vector system and its utility as a serologic marker. Virology, 1996,225:282～292
, 百拇医药
[2] Luckow V A, Lee S C, Barry G F et al. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol, 1993, 67:4566～4579
[3] Shao L, Shinzawa H, Ishikawa K et al. Sequence of hepatitis G virus genome isolated from a Japanese patient with non-A-E-hepatitis: amplification and cloning by long reverse transcription-PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1996,228:785～791
, 百拇医药
[4] Pilot-Matias T J, Muernoff A S, Simons J N et al. Identification of antigenic regions in the GB hepatitis viruses GBV-A, GBV-B and GBV-C. J Med Virol, 1996, 48:329～338
[5] Leary T Y, Muerhoff A S, Simons J N et al. Sequence and genomic organization of GBV-C, a novel member of the flaviviride associated with human non-A-E-hepatitis. J Med Virol, 1996,48:60～67
[6] Dille B T, Surowy T K, Gutierrez R A et al. ELISA for the detection of antibodies to the E2 protein of GBV-C. J Infect Dis, 1997,175:458～461
[7] Dawson G J, Schlauder G G, Pilot-Matias T J et al. Prevalence studies of GB virus-C infection using reverse transcriptase polymerase chain reaction. J Med Virol, 1996,50:97～103
收稿日期：1998-05-04，修回日期：1998-09-11, 百拇医药