汉滩病毒感染人肾小球系膜细胞的实验研究
作者：朱翠云 孙志坚 黄湘虎 李显 章莉莉 刘光中
单位：南京医科大学一附院[朱翠云(现在上海市传染病医院，200083)、孙志坚、黄湘虎、章莉莉]；江苏省卫生防疫站(李显、刘光中)
关键词：汉滩病毒；肾小球系膜细胞；病毒唑；磷甲酸钠
中华传染病杂志/990212 摘要 目的 探讨汉滩病毒A9株(HTNV-A9)对肾实质细胞的致病作用。方法 采用免疫标记技术和电镜技术观察HTNV-A9株对人胚肾小球系膜细胞(MsC)的感染情况和病毒唑、磷甲酸钠对病毒感染的抑制作用。结果 HTNV-A9株能感染MsC并能在其中增殖，形成包涵体；病毒唑和磷甲酸钠能抑制HTNV-A9株对MsC的感染，且加药时间愈早，抑制作用愈强。结论 汉滩病毒感染是引起肾综合征出血热肾实质直接损伤的重要机制之一；为临床早期抗病毒药物治疗提供了实验依据。
, 百拇医药
Experimental study on hantaan virus infected mesangial cells
ZHU Cuiyun, SUN Zhijian, HUANG Xianghu, et al.The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,210029
Abstract Objective To study the pathogenesis of hantaan virus A9 strain(HTNV-A9)to human mesangial cells(MsC).Methods The virus titer in culture fluid was measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The HTNV-antigen in MsC was detected by indirected immunofluoresence assay(IFA) and enzyme immunoassay(EIA).The shape and ultrastructure of infected MsC were observed by light microscope(LM) and transmission electron microscopy(TEM) respectively.Results HTNV infection to MsC was demonstrated by IFA,ELA and ELISA.By TEM,virion-like grannules and viral inclusion bodies(IB) were observed to inhibit the replication of HTNV in MsC to some extent.The earlier the drugs like ribavirin and foscarnet used,the stronger the inhibitory effect was taken.Conclusion HTNV infection plays an important role in the pathogenesis of renal damage of Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome.
, 百拇医药
Key words Hantaan virus Mesangial cells Ribavirin Foscarnet
为阐明肾综合征出血热(HFRS)急性肾功能衰竭的发病机制，我们培养了人胚肾小球系膜细胞(MsC)；研究了汉滩病毒(HTNV)对MsC的致病作用，并观察了病毒唑和磷甲酸钠对病毒感染的抑制作用。
材料和方法
一、材料
人胚肾小球系膜细胞取自经水囊引产的4～5月龄胎儿肾。以RPMI1640为基础液，生长液和维持液中各含20%和5%小牛血清并均含辅助成分：转铁蛋白5μg/ml、胰岛素0.66u/ml、L-各氨酰胺300μg/ml、青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml。汉滩病毒A9株感染的VERO-E6细胞培养上清冻融液，由江苏省卫生防疫站提供，实验用滴度为100TCID50/0.5ml。病毒唑注射液：江苏省溧阳市制药厂产品，批号950615，每支100mg/ml;磷甲酸钠：无锡市第七制药厂产品，批号940222。以上药物于实验时均用三蒸水稀释至所需浓度。
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二、方法
(一)人胚肾小球系膜细胞的分离培养 无菌取出肾皮质，剪碎，置50目网筛上研磨，收集网下液，依次过100目、200目网筛，收集位于200目网筛上的肾小球细胞，用胶原酶(终浓度≥120胶原消化单位/ml，Sigma公司产品)37°C消化15～20分钟。离心，将消化后的肾小球细胞接种在含有生长液的培养瓶里，置37°C 5%CO2温箱中培养，待细胞长满瓶底后用0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA液消化，传代培养。
(二)人胚肾小球系膜细胞的鉴定 取传代后的MsC进行鉴定。采用光镜形态观察及用抗肌动蛋白抗体、抗Desmin抗体、抗Ⅷ因子抗体和抗角蛋白抗体(以上抗体均为Dako公司产品)进行间接免疫荧光染色综合鉴定。
(三)病毒接种与检测 将消化好的MsC转种到预先置有玻片的24孔培养板和培养瓶中，待细胞长满孔底/瓶底后，接种HTNV-A9株，滴度为100TCID50，每3天换维持液1次，每14天传代1次，换液和传代前均收取上清和贴附有染毒MsC玻片备检。同时设接种的HTNV-A9株的Vero-E6细胞为阳性对照。
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瑞氏(Wright，s)染色观察MsC染毒前后形态变化。酶联免疫吸附试验(ELISA)夹心法检测染毒MsC培养上清液中的HTNV抗原滴度(ELISA试剂盒由江苏省卫生防疫站提供)。间接免疫荧光法(IFA)和酶免疫染色法(EIA)检测染毒MsC中的HTNV抗原。IFA一抗为HTNV-McAb A25-1，由中国预防医学科学院病毒研究所提供。EIA一抗为HTNV-McAb A35，由安徽省医学科学研究所提供。荧光强度判断标准参照文献[1]。
收取培养细胞离心沉淀，常规制备电镜标本，H-600A型透射电镜观察。
(四)病毒唑、磷甲酸钠抑制试验 以保留原细胞数80%以上药物浓度作为试验药剂量的上限值。将HTNV-A9株接种MsC，吸附1小时后弃去病毒液，分别于0、24、48小时加入不同浓度的药物维持培养，设阳性对照(只接种病毒)和阴性对照(不接种病毒亦不加药物)，每日观察、记录细胞形态变化并定期取样检测培养上清液中的病毒抗原滴度和MsC中病毒抗原的表达强度，至第10天当阳性对照孔中出现阳性反应时，判定病毒唑组、磷甲酸钠组实验结果。
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结果
一、MsC鉴定
培养10～14于后MsC长满瓶底，MsC呈梭形、三角形或不规则星形，有伪足，中央有1～2个卵圆形核。IFA示抗角蛋白抗体、抗Ⅷ因子抗体均为阴性，抗Desmin抗体、抗肌动蛋白抗体均为阳性，证实所培养的细胞为MsC。
二、HTNV-A9株对MsC感染情况
(一)病毒抗原的表达与分布 接种HTNV-A9株7天后培养细胞中便有HTNV特异性抗原表达，免疫荧光强度为+，培养上清液中病毒抗原滴度为1∶8；10天后胞浆中病毒抗原表达强度和上清液中病毒抗原滴度均明显增加，分别为++、1∶16，传代后未见明显上升，而Vero E6细胞于接种HTNV-A9株3天后免疫荧光强度为+，7天后、10天后免疫荧光强度分别为+++、+++～++++。结果显示MsC中病毒感染强度均低于阳性对照组。ELISA结果见图1。EIA示胞浆中含有棕色颗粒，证明有HTNV存在。
, 百拇医药
图1 HTNV-A9株感染MsC和Vero-E6细胞后不同时间培养上清中病毒抗原滴度(ELISA结果)
(二)感染细胞形态学观察 MsC感染HTNV-A9株后光镜下未见明显细胞病理改变。染毒后的MsC经Wrigh，s染色也未见明显变化。透射电镜下HTNV-A9株感染第一代末MsC胞浆内见到病毒颗粒和病毒包涵体，粗面内质网和核糖体增多，传代后病变未见增加(见图2、3)。
图2 透射电镜下HTNV-A9株感染MsC后胞浆中见到病毒颗粒(TEM×70，000)
图3 透射电镜下HTNV-A9株感染MsC后胞浆中见到病毒包涵体(TEM×70，000)
, 百拇医药
三、病毒唑、磷甲酸钠抑制试验
见表1、2。病毒唑30～120μg/ml时对病毒增殖均有明显抑制作用；磷甲酸钠720～1440μg/ml时对病毒有明显的抑制作用；加药时间愈早，抑制作用愈强。ELISA法检测培养上清中病毒抗原滴度，IFA法检测病毒抗原在MsC中表达强度。
表1 病毒唑对MsC培养中HTNV-A9株感染增殖的抑制作用 病毒唑
浓度
(μg/ml)
(病毒抗原含量的变化)
0小时加药
24小时加药
48小时加药
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ELISA
IFA
ELISA
IFA
ELISA
IFA
120
-
-
-
-
-
-
, 百拇医药 60
-
-
-
-
1∶1
-
30
1∶1
±
1∶2
±
1∶4
+
, 百拇医药
15
1∶1
±
1∶2
+
1∶8
+
7.5
1∶4
+
1∶4
+
1∶8
+/++
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病毒对照
1∶16
++
1∶16
++
1∶8
++
表2 磷甲酸钠对MsC培养中HTNV-A9株感染增殖的抑制作用 磷甲酸
钠浓度
(μg/ml)
(病毒抗原含量的变化)
0小时加药
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24小时加药
48小时加药
ELISA
IFA
ELISA
IFA
ELISA
IFA
1440
1∶1
-
1∶2
±
, 百拇医药
1∶4
+
720
1∶1
-
1∶2
±
1∶4
+
360
1∶8
+
1∶8
+
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1∶8
+
180
1∶8
+
1∶8
+
1∶16
++
90
1∶16
++
1∶16
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1∶16
++
病毒对照
1∶16
++
1∶16
++
1∶16
++
讨论
肾脏损害是HFRS的主要表现之一，有学者[2，3]发现本病早期即有肾小球滤过率下降，至低血压、少尿期下降尤甚。肾小球系膜细胞(MsC)具有分泌和收缩等功能[4]，能控制肾小球毛细血管口径，影响肾小球滤过率。故研究HTNV-A9株对MsC的感染情况将有助于阐明HFRS肾脏实质损害乃至急性肾功能衰竭的发病机制。
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我们培养的MsC经抗Desmin抗体、抗Ⅷ因子抗体、抗肌动蛋白抗体的抗角蛋白抗体荧光染色鉴定排除了上皮细胞、内皮细胞污染，证明为人胚肾小球系膜细胞。实验中采用的HTNV-A9株为我国学者在国内首次从本地区分离，属汉坦病毒汉滩型，该病毒在Vero-E6细胞中生长良好，有较强的感染能力。
我们用HTNV-A9株攻击人胚MsC，7天后细胞内出现HTNV特异性荧光，酶免疫染色法也可检测到病毒抗原，ELISA测定培养上清液中病毒滴度为1∶8，至第10天以后，荧光强度和病毒滴度均明显增加，从而说明HTNV-A9株能感染MsC，并能在其中复制增殖。
HTNV-A9株感染的MsC在光镜下未见细胞形态结构的变化，但透射电镜下可见感染细胞胞浆内有病毒颗粒及病毒包涵体，细胞粗面内质网及核糖体有增多现象。杨守京等[5]认为包涵体主要是过剩的核蛋白堆积而成，是病毒不成熟的标志，也是一种致病征象。我们用A35单抗作酶免疫染色证明胞浆中有病毒核蛋白颗粒，在包涵体旁见到粗面内质网与核糖体增多，很可能是病毒及其包涵体刺激的结果。由此可见本病早期出现的肾小球滤过率下降与病毒对MsC的直接作用不无相关。
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本试验结果显示病毒唑和磷甲酸钠均有抑制病毒感染的作用，且加药时间愈早，抑制作用愈好。临床上应用病毒唑已显示了良好的治疗作用[6]，故早期抗病毒治疗十分重要。磷甲酸钠的临床疗效如何有待进一步研究。
本课题受江苏省科委科研基金资助(J91080)
参考文献
1 黄祯祥，主编.医学病毒学基础及实验技术.第1版.北京：科学出版社，1990.198.
2 Settergren B.Nephropathia epidemica(hemorrhagic fever with renal syndrome) in Scandinavia.Rev Infect Dis.1991,13:734-744.
3 孙志坚，黄湘虎，王明秀，等.流行性出血热若干体液因子和肾脏血液动力学的变化.江苏医药，1994，20：295-297.
4 Davies Malcolm.The mesangial cell:A tissue culture view.Kidney International,1994,45:320-327.
5 杨守京，刘彦仿，胡锡祺，等.肾综合征出血热肾组织中病毒感染及病毒抗原的来源和意义.第四军医大学学报.1995，16：401-408.
6 杨占秋，Huggins JW,高又新，等.病毒唑对流行性出血热患者病毒血症的影响.中华传染病杂志，1993，11：30-33.
收稿：1998-03-31 修回：1998-09-26, 百拇医药
单位：南京医科大学一附院[朱翠云(现在上海市传染病医院，200083)、孙志坚、黄湘虎、章莉莉]；江苏省卫生防疫站(李显、刘光中)
关键词：汉滩病毒；肾小球系膜细胞；病毒唑；磷甲酸钠
中华传染病杂志/990212 摘要 目的 探讨汉滩病毒A9株(HTNV-A9)对肾实质细胞的致病作用。方法 采用免疫标记技术和电镜技术观察HTNV-A9株对人胚肾小球系膜细胞(MsC)的感染情况和病毒唑、磷甲酸钠对病毒感染的抑制作用。结果 HTNV-A9株能感染MsC并能在其中增殖，形成包涵体；病毒唑和磷甲酸钠能抑制HTNV-A9株对MsC的感染，且加药时间愈早，抑制作用愈强。结论 汉滩病毒感染是引起肾综合征出血热肾实质直接损伤的重要机制之一；为临床早期抗病毒药物治疗提供了实验依据。
, 百拇医药
Experimental study on hantaan virus infected mesangial cells
ZHU Cuiyun, SUN Zhijian, HUANG Xianghu, et al.The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,210029
Abstract Objective To study the pathogenesis of hantaan virus A9 strain(HTNV-A9)to human mesangial cells(MsC).Methods The virus titer in culture fluid was measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The HTNV-antigen in MsC was detected by indirected immunofluoresence assay(IFA) and enzyme immunoassay(EIA).The shape and ultrastructure of infected MsC were observed by light microscope(LM) and transmission electron microscopy(TEM) respectively.Results HTNV infection to MsC was demonstrated by IFA,ELA and ELISA.By TEM,virion-like grannules and viral inclusion bodies(IB) were observed to inhibit the replication of HTNV in MsC to some extent.The earlier the drugs like ribavirin and foscarnet used,the stronger the inhibitory effect was taken.Conclusion HTNV infection plays an important role in the pathogenesis of renal damage of Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome.
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Key words Hantaan virus Mesangial cells Ribavirin Foscarnet
为阐明肾综合征出血热(HFRS)急性肾功能衰竭的发病机制，我们培养了人胚肾小球系膜细胞(MsC)；研究了汉滩病毒(HTNV)对MsC的致病作用，并观察了病毒唑和磷甲酸钠对病毒感染的抑制作用。
材料和方法
一、材料
人胚肾小球系膜细胞取自经水囊引产的4～5月龄胎儿肾。以RPMI1640为基础液，生长液和维持液中各含20%和5%小牛血清并均含辅助成分：转铁蛋白5μg/ml、胰岛素0.66u/ml、L-各氨酰胺300μg/ml、青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml。汉滩病毒A9株感染的VERO-E6细胞培养上清冻融液，由江苏省卫生防疫站提供，实验用滴度为100TCID50/0.5ml。病毒唑注射液：江苏省溧阳市制药厂产品，批号950615，每支100mg/ml;磷甲酸钠：无锡市第七制药厂产品，批号940222。以上药物于实验时均用三蒸水稀释至所需浓度。
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二、方法
(一)人胚肾小球系膜细胞的分离培养 无菌取出肾皮质，剪碎，置50目网筛上研磨，收集网下液，依次过100目、200目网筛，收集位于200目网筛上的肾小球细胞，用胶原酶(终浓度≥120胶原消化单位/ml，Sigma公司产品)37°C消化15～20分钟。离心，将消化后的肾小球细胞接种在含有生长液的培养瓶里，置37°C 5%CO2温箱中培养，待细胞长满瓶底后用0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA液消化，传代培养。
(二)人胚肾小球系膜细胞的鉴定 取传代后的MsC进行鉴定。采用光镜形态观察及用抗肌动蛋白抗体、抗Desmin抗体、抗Ⅷ因子抗体和抗角蛋白抗体(以上抗体均为Dako公司产品)进行间接免疫荧光染色综合鉴定。
(三)病毒接种与检测 将消化好的MsC转种到预先置有玻片的24孔培养板和培养瓶中，待细胞长满孔底/瓶底后，接种HTNV-A9株，滴度为100TCID50，每3天换维持液1次，每14天传代1次，换液和传代前均收取上清和贴附有染毒MsC玻片备检。同时设接种的HTNV-A9株的Vero-E6细胞为阳性对照。
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瑞氏(Wright，s)染色观察MsC染毒前后形态变化。酶联免疫吸附试验(ELISA)夹心法检测染毒MsC培养上清液中的HTNV抗原滴度(ELISA试剂盒由江苏省卫生防疫站提供)。间接免疫荧光法(IFA)和酶免疫染色法(EIA)检测染毒MsC中的HTNV抗原。IFA一抗为HTNV-McAb A25-1，由中国预防医学科学院病毒研究所提供。EIA一抗为HTNV-McAb A35，由安徽省医学科学研究所提供。荧光强度判断标准参照文献[1]。
收取培养细胞离心沉淀，常规制备电镜标本，H-600A型透射电镜观察。
(四)病毒唑、磷甲酸钠抑制试验 以保留原细胞数80%以上药物浓度作为试验药剂量的上限值。将HTNV-A9株接种MsC，吸附1小时后弃去病毒液，分别于0、24、48小时加入不同浓度的药物维持培养，设阳性对照(只接种病毒)和阴性对照(不接种病毒亦不加药物)，每日观察、记录细胞形态变化并定期取样检测培养上清液中的病毒抗原滴度和MsC中病毒抗原的表达强度，至第10天当阳性对照孔中出现阳性反应时，判定病毒唑组、磷甲酸钠组实验结果。
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结果
一、MsC鉴定
培养10～14于后MsC长满瓶底，MsC呈梭形、三角形或不规则星形，有伪足，中央有1～2个卵圆形核。IFA示抗角蛋白抗体、抗Ⅷ因子抗体均为阴性，抗Desmin抗体、抗肌动蛋白抗体均为阳性，证实所培养的细胞为MsC。
二、HTNV-A9株对MsC感染情况
(一)病毒抗原的表达与分布 接种HTNV-A9株7天后培养细胞中便有HTNV特异性抗原表达，免疫荧光强度为+，培养上清液中病毒抗原滴度为1∶8；10天后胞浆中病毒抗原表达强度和上清液中病毒抗原滴度均明显增加，分别为++、1∶16，传代后未见明显上升，而Vero E6细胞于接种HTNV-A9株3天后免疫荧光强度为+，7天后、10天后免疫荧光强度分别为+++、+++～++++。结果显示MsC中病毒感染强度均低于阳性对照组。ELISA结果见图1。EIA示胞浆中含有棕色颗粒，证明有HTNV存在。
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图1 HTNV-A9株感染MsC和Vero-E6细胞后不同时间培养上清中病毒抗原滴度(ELISA结果)
(二)感染细胞形态学观察 MsC感染HTNV-A9株后光镜下未见明显细胞病理改变。染毒后的MsC经Wrigh，s染色也未见明显变化。透射电镜下HTNV-A9株感染第一代末MsC胞浆内见到病毒颗粒和病毒包涵体，粗面内质网和核糖体增多，传代后病变未见增加(见图2、3)。
图2 透射电镜下HTNV-A9株感染MsC后胞浆中见到病毒颗粒(TEM×70，000)
图3 透射电镜下HTNV-A9株感染MsC后胞浆中见到病毒包涵体(TEM×70，000)
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三、病毒唑、磷甲酸钠抑制试验
见表1、2。病毒唑30～120μg/ml时对病毒增殖均有明显抑制作用；磷甲酸钠720～1440μg/ml时对病毒有明显的抑制作用；加药时间愈早，抑制作用愈强。ELISA法检测培养上清中病毒抗原滴度，IFA法检测病毒抗原在MsC中表达强度。
表1 病毒唑对MsC培养中HTNV-A9株感染增殖的抑制作用 病毒唑
浓度
(μg/ml)
(病毒抗原含量的变化)
0小时加药
24小时加药
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IFA
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病毒对照
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表2 磷甲酸钠对MsC培养中HTNV-A9株感染增殖的抑制作用 磷甲酸
钠浓度
(μg/ml)
(病毒抗原含量的变化)
0小时加药
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24小时加药
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讨论
肾脏损害是HFRS的主要表现之一，有学者[2，3]发现本病早期即有肾小球滤过率下降，至低血压、少尿期下降尤甚。肾小球系膜细胞(MsC)具有分泌和收缩等功能[4]，能控制肾小球毛细血管口径，影响肾小球滤过率。故研究HTNV-A9株对MsC的感染情况将有助于阐明HFRS肾脏实质损害乃至急性肾功能衰竭的发病机制。
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我们培养的MsC经抗Desmin抗体、抗Ⅷ因子抗体、抗肌动蛋白抗体的抗角蛋白抗体荧光染色鉴定排除了上皮细胞、内皮细胞污染，证明为人胚肾小球系膜细胞。实验中采用的HTNV-A9株为我国学者在国内首次从本地区分离，属汉坦病毒汉滩型，该病毒在Vero-E6细胞中生长良好，有较强的感染能力。
我们用HTNV-A9株攻击人胚MsC，7天后细胞内出现HTNV特异性荧光，酶免疫染色法也可检测到病毒抗原，ELISA测定培养上清液中病毒滴度为1∶8，至第10天以后，荧光强度和病毒滴度均明显增加，从而说明HTNV-A9株能感染MsC，并能在其中复制增殖。
HTNV-A9株感染的MsC在光镜下未见细胞形态结构的变化，但透射电镜下可见感染细胞胞浆内有病毒颗粒及病毒包涵体，细胞粗面内质网及核糖体有增多现象。杨守京等[5]认为包涵体主要是过剩的核蛋白堆积而成，是病毒不成熟的标志，也是一种致病征象。我们用A35单抗作酶免疫染色证明胞浆中有病毒核蛋白颗粒，在包涵体旁见到粗面内质网与核糖体增多，很可能是病毒及其包涵体刺激的结果。由此可见本病早期出现的肾小球滤过率下降与病毒对MsC的直接作用不无相关。
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本试验结果显示病毒唑和磷甲酸钠均有抑制病毒感染的作用，且加药时间愈早，抑制作用愈好。临床上应用病毒唑已显示了良好的治疗作用[6]，故早期抗病毒治疗十分重要。磷甲酸钠的临床疗效如何有待进一步研究。
本课题受江苏省科委科研基金资助(J91080)
参考文献
1 黄祯祥，主编.医学病毒学基础及实验技术.第1版.北京：科学出版社，1990.198.
2 Settergren B.Nephropathia epidemica(hemorrhagic fever with renal syndrome) in Scandinavia.Rev Infect Dis.1991,13:734-744.
3 孙志坚，黄湘虎，王明秀，等.流行性出血热若干体液因子和肾脏血液动力学的变化.江苏医药，1994，20：295-297.
4 Davies Malcolm.The mesangial cell:A tissue culture view.Kidney International,1994,45:320-327.
5 杨守京，刘彦仿，胡锡祺，等.肾综合征出血热肾组织中病毒感染及病毒抗原的来源和意义.第四军医大学学报.1995，16：401-408.
6 杨占秋，Huggins JW,高又新，等.病毒唑对流行性出血热患者病毒血症的影响.中华传染病杂志，1993，11：30-33.
收稿：1998-03-31 修回：1998-09-26, 百拇医药