重型乙型肝炎病毒C基因启动子变异
作者：郭亚兵 戴炜 卢桥生 侯金林 冯筱榕 骆抗先
单位：510515 广州，第一军医大学南方医院(郭亚兵、卢桥生、侯金林、冯筱榕、骆抗先)；深圳市东湖医院(戴炜)
关键词：肝炎病毒，乙型；启动子；变异
中华传染病杂志/990211 摘要 目的 了解我国重型肝炎C基因调节序列变异特点。方法 克隆及聚合酶链反应(PCR)产物直接测序方法对，检测7例重型乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)C基因调节序列变异。结果 4例存在T1762A1764变异；但在T1762A1764以外位点也存有诸多变异，其中1例在nt1776-1777之间有11bp的插入变异。结论 重型肝炎HBV C基因启动子区存在较多的变异位点，推测这些变异对C启动子的调节活性影响可能是综合性的。
, 百拇医药
Hepatitis B virus precore/core promoter
mutantion in fulminant hepatitis
GUO Yabing,DAI Wei,LU Qiaosheng,et al.Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou,510515
Abstract Objective To characterize mutations in core regulatory sequences of hepatitis B virus in Chinese patients with fulminant hepatitis.Methods Seven patients with fulminant hepatitis were investigated for mutations in core gene regulatory sequences of hepatitis B virus using PCR products and cloning sequencing methods.Results Four in the seven patients had T1762A1764 mutation.Furthermore,there were a lot of variants at other sites in this promoter region,induding one case with a 11bp insert between nt 1776—1777.Conclusion It indicated that there were quite a few mutation sites in the region of core promoter，in the patients with fulmiannt hepatitis and those mutations may effect the activity of core promoter synthetically.
, http://www.100md.com
Key words Hepatitis B virus Promoter regions Mutation
乙型肝炎病毒(HBV)C基因调节序列替代(nt1762A→T,nt1764G→A,T1762A1764)联合变异在慢性HBV感染者血清及肝硬化、肝癌癌组织中检出率较高[1-3]，是变异的热点。但在中国的重型肝炎中存在的型式，该变异点之外是否还存在其它变异以及这些变异与T1762A1764变异一起存在的型式如何，本研究试图对以上亟待解决的问题进行探讨。
材料与方法
一、研究对象
7例亚急性重型乙型肝炎(乙肝)患者为我科1993～1996年间收治的住院患者。诊断符合1995年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的肝炎诊断标准。酶联免疫法检测HBV血清标志，1例HBV血清标志均为阴性；余6例HBsAg(+)、抗-HBc(+),其中1例HBeAg(+),余抗-HBe(+)。
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二、方法
(一)聚合酶链反应(PCR)扩增 常规方法提取血清DNA，用套式PCR(Nested-PCR)扩增HBV前C/C基因调节序列。外引物对为Pol-6a与2C，内引物对为Reg1和Reg2′。PCR及测序用引物见表1。所有标本均重复2次PCR，结果不一致的标本未采用。
(二)PCR产物克隆 应用TA克隆试剂盒(Invitrogen,美国)直接将PCR产物克隆入pCRⅡ质粒。参照产品说明书方法进行联接反应，然后转化大肠杆菌JM109株。在含X-gal平板上挑选白色透明菌落，微量抽提质粒DNA后，用EcoRI酶切筛检含所需插入片段的克隆。
(三)DNA序列分析 用PCR产物直接测序试剂盒(Sequenase Version2,USB,美国)，按产品说明书方法对PCR产物进行直接测序。pCRII重组质粒插入片段测序应用Sequenase Version2 测序试剂盒(USB，美国)，按其产品说明方法进行。同位素(α)35S-dATP(Amersham,美国)。测序结果用DNASIS软件分析处理。
, 百拇医药
表1 PCR和序列分析引物序列 引物
位置
核苷酸序列
Pol-6a
nt781～797
5′-GTGAGTCCCTTTATACC
2C
nt2308～2291
5′-TTGGTGGTCTATAGGCTG
Reg1
nt942～960
, 百拇医药 5′-CTC
TGC-TTTAGAAAACTTCCT
Reg2′
nt1876～1859
5′-AGA
AACTT-
GGAGGCTTGAACAGT
X1
nt1298～1319
5′-GCTCGCAGCAGGTCTGGAGCA
Pol-3
, http://www.100md.com
nt1409～1395
5′-AAGGATCCAGTTGGC
Po3′a
nt1676～1662
5′-GGAGTCCCAAGAGTCC
M3
nt1781～1791
5′-CTGGGAGGAGTTGGGGGA
Pol-9
nt1628～1642
5′-GCCCCATCAGATCCCTG为SacI识别位点，为HindIII识别位点结果
, 百拇医药
一、T1762A1764变异株与野株DNA测序
见图1。
图1 HBV C基因启动子区核酸序列测定
二、重型乙肝血清HBV C区调节序列比较
7例重型乙肝中有4例为T1762A1764变异株，均为联合变异，未见单一T1762或A1764变异。在其它位点上亦有散在或集束变异，有40个位点发生替代变异。1例在nt 1776～1777间有11bp插入变异(TTAATAATTAA)。
讨论
, 百拇医药
HBV前C和C调节序列可分为基本C区启动子(BCP)和其上游调节序列(CURS)、负调节子(NRE)[4]，它们调节前C mRNA和C mRNA(前基因组mRNA)的转录。BCP区无TATA盒(TATA box),但含有4个TA富含区(TA1—TA4)，分别位于nt 1752～1755，nt 1758～1762,nt1771～1775,nt 1778～1795。第4个TA含富区(TA4)决定前C mRNA及前基因组mRNA的精确转录起始[5]。T1762A1764位于TA2区。日本学者研究表明，该变异使前C mRNA转录下调，而使前基因组m RNA转录上调[6]；但临床研究显示，该变异不仅伴血清HBeAg阴性或低下，而且DNA多聚酶水平亦低下[7]。显然，这是一矛盾结果。
由于实际存在的HBV变异并非为单一位点发生的，而是多位点同时存在的。BCP区的变异同样如此，如G1752、G1753位于TA1区。以上矛盾结果是否因实际存在的HBV变异株在T1762A1764以外同时存有其位点的变异所致有等进一步研究。
, 百拇医药
由于慢性HBV感染个体中的HBV毒株可能为野毒株和变异株的多株混合感染。PCR产物测序因混合株的存在往往使某一位点核苷酸不能清楚读出，而结合随机挑取的多个克隆测序则可清晰读出以上位点。为进一步核实变异株是否为混合毒株中的优势株，同时对血清PCR产物及克隆两种方法进行测序。本结果显示的均为优势毒株。
T1762A1764变异未在急性肝炎患者中检出而主要发生在HBV慢性感染过程中，可能是宿主免疫筛选结果。本研究及其它报道显示，T1762A1764变异既大量存在于无症状携带者(无活动肝病理损伤)、慢性肝炎、肝硬化患者中，又存在于重型肝炎患者中；推测该变异株的致病性主要决定于宿主因素。
另一值得注意的现象是T1762与A1764变异多是以联合型式出现。研究表明[6，8]，T1762替代变异可使前C和C mRNA 3′二级结构改变及BCP活性改变。其多以联合变异存在的原因可能因位置重迭于X基因区的T1762A1764变异同时对HBV X基因产生影响所致。该联合变异究竟对HBV X蛋白反式调节活性有多大影响，尚待进一步研究。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学九五重点课题基金资助(39630280)
参考文献
1 Takahashi K,Aoyama K,Ohno N，et al.The precore/core promoter mutant (T1762A1764) of hepatitis B virus:clinical significance and an easy method for detection.J General Virology,1995,76:3159-3164.
2 CHU CH,HAO Y,Tabor E.Hot-spot mutation in hepatitis B virus X gene in hepatocellular carcinoma.The Lancet,1996,348:625-626.
3 Sato S,Suzuki K,Akahane Y,et al.Hepatitis B virus strains with muatations in the core promoter in patients with fulminant hepatitis.Annals of Internal Medicine,1995,122:241-248.
, 百拇医药
4 LO WY,TING LP.Repression of enhancer II activity by a negative regulatory element in the hepatitis B virus genome.Journal of Virology,1994,68:1758-1764.
5 CHEN IH,HUANG CJ,Ting LP.Overlapping initiator and TATA box functions in the basal core promoter of hepatitis B virus.Journal of Virology,1995,69:3647-3657.
6 Moriyama K,Okamoto H,Tsuda F,et al.Reduced precore transcription and enhanced core-pregenome transcription of hepatitis B virus DNA after replacement of the precore-core promoter with sequences associated with e antigen-seronegative persistent infections.Virology,1996,226:269-280.
, 百拇医药
7 Kurosaki M,Enomoto N,Asahina Y,et al.Mutation in the core promoter region of hepatitis B virus in patients with chronic hepatitis B.J Med Virol,1996,49:115-123.
8 Alistair HK,Karin KL.A revised secondary structure model for the 3′-end of hepatitis B virus pregenomic RNA.Nucleic Acids Research,1996,24:3295-3301.
收稿：1998-02-12 修回：1998-09-08, http://www.100md.com
单位：510515 广州，第一军医大学南方医院(郭亚兵、卢桥生、侯金林、冯筱榕、骆抗先)；深圳市东湖医院(戴炜)
关键词：肝炎病毒，乙型；启动子；变异
中华传染病杂志/990211 摘要 目的 了解我国重型肝炎C基因调节序列变异特点。方法 克隆及聚合酶链反应(PCR)产物直接测序方法对，检测7例重型乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)C基因调节序列变异。结果 4例存在T1762A1764变异；但在T1762A1764以外位点也存有诸多变异，其中1例在nt1776-1777之间有11bp的插入变异。结论 重型肝炎HBV C基因启动子区存在较多的变异位点，推测这些变异对C启动子的调节活性影响可能是综合性的。
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Hepatitis B virus precore/core promoter
mutantion in fulminant hepatitis
GUO Yabing,DAI Wei,LU Qiaosheng,et al.Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou,510515
Abstract Objective To characterize mutations in core regulatory sequences of hepatitis B virus in Chinese patients with fulminant hepatitis.Methods Seven patients with fulminant hepatitis were investigated for mutations in core gene regulatory sequences of hepatitis B virus using PCR products and cloning sequencing methods.Results Four in the seven patients had T1762A1764 mutation.Furthermore,there were a lot of variants at other sites in this promoter region,induding one case with a 11bp insert between nt 1776—1777.Conclusion It indicated that there were quite a few mutation sites in the region of core promoter，in the patients with fulmiannt hepatitis and those mutations may effect the activity of core promoter synthetically.
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Key words Hepatitis B virus Promoter regions Mutation
乙型肝炎病毒(HBV)C基因调节序列替代(nt1762A→T,nt1764G→A,T1762A1764)联合变异在慢性HBV感染者血清及肝硬化、肝癌癌组织中检出率较高[1-3]，是变异的热点。但在中国的重型肝炎中存在的型式，该变异点之外是否还存在其它变异以及这些变异与T1762A1764变异一起存在的型式如何，本研究试图对以上亟待解决的问题进行探讨。
材料与方法
一、研究对象
7例亚急性重型乙型肝炎(乙肝)患者为我科1993～1996年间收治的住院患者。诊断符合1995年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的肝炎诊断标准。酶联免疫法检测HBV血清标志，1例HBV血清标志均为阴性；余6例HBsAg(+)、抗-HBc(+),其中1例HBeAg(+),余抗-HBe(+)。
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二、方法
(一)聚合酶链反应(PCR)扩增 常规方法提取血清DNA，用套式PCR(Nested-PCR)扩增HBV前C/C基因调节序列。外引物对为Pol-6a与2C，内引物对为Reg1和Reg2′。PCR及测序用引物见表1。所有标本均重复2次PCR，结果不一致的标本未采用。
(二)PCR产物克隆 应用TA克隆试剂盒(Invitrogen,美国)直接将PCR产物克隆入pCRⅡ质粒。参照产品说明书方法进行联接反应，然后转化大肠杆菌JM109株。在含X-gal平板上挑选白色透明菌落，微量抽提质粒DNA后，用EcoRI酶切筛检含所需插入片段的克隆。
(三)DNA序列分析 用PCR产物直接测序试剂盒(Sequenase Version2,USB,美国)，按产品说明书方法对PCR产物进行直接测序。pCRII重组质粒插入片段测序应用Sequenase Version2 测序试剂盒(USB，美国)，按其产品说明方法进行。同位素(α)35S-dATP(Amersham,美国)。测序结果用DNASIS软件分析处理。
, 百拇医药
表1 PCR和序列分析引物序列 引物
位置
核苷酸序列
Pol-6a
nt781～797
5′-GTGAGTCCCTTTATACC
2C
nt2308～2291
5′-TTGGTGGTCTATAGGCTG
Reg1
nt942～960
, 百拇医药 5′-CTC
TGC-TTTAGAAAACTTCCTReg2′
nt1876～1859
5′-AGA
AACTT-GGAGGCTTGAACAGT
X1
nt1298～1319
5′-GCTCGCAGCAGGTCTGGAGCA
Pol-3
, http://www.100md.com
nt1409～1395
5′-AAGGATCCAGTTGGC
Po3′a
nt1676～1662
5′-GGAGTCCCAAGAGTCC
M3
nt1781～1791
5′-CTGGGAGGAGTTGGGGGA
Pol-9
nt1628～1642
5′-GCCCCATCAGATCCCTG
为SacI识别位点，为HindIII识别位点结果, 百拇医药
一、T1762A1764变异株与野株DNA测序
见图1。
图1 HBV C基因启动子区核酸序列测定
二、重型乙肝血清HBV C区调节序列比较
7例重型乙肝中有4例为T1762A1764变异株，均为联合变异，未见单一T1762或A1764变异。在其它位点上亦有散在或集束变异，有40个位点发生替代变异。1例在nt 1776～1777间有11bp插入变异(TTAATAATTAA)。
讨论
, 百拇医药
HBV前C和C调节序列可分为基本C区启动子(BCP)和其上游调节序列(CURS)、负调节子(NRE)[4]，它们调节前C mRNA和C mRNA(前基因组mRNA)的转录。BCP区无TATA盒(TATA box),但含有4个TA富含区(TA1—TA4)，分别位于nt 1752～1755，nt 1758～1762,nt1771～1775,nt 1778～1795。第4个TA含富区(TA4)决定前C mRNA及前基因组mRNA的精确转录起始[5]。T1762A1764位于TA2区。日本学者研究表明，该变异使前C mRNA转录下调，而使前基因组m RNA转录上调[6]；但临床研究显示，该变异不仅伴血清HBeAg阴性或低下，而且DNA多聚酶水平亦低下[7]。显然，这是一矛盾结果。
由于实际存在的HBV变异并非为单一位点发生的，而是多位点同时存在的。BCP区的变异同样如此，如G1752、G1753位于TA1区。以上矛盾结果是否因实际存在的HBV变异株在T1762A1764以外同时存有其位点的变异所致有等进一步研究。
, 百拇医药
由于慢性HBV感染个体中的HBV毒株可能为野毒株和变异株的多株混合感染。PCR产物测序因混合株的存在往往使某一位点核苷酸不能清楚读出，而结合随机挑取的多个克隆测序则可清晰读出以上位点。为进一步核实变异株是否为混合毒株中的优势株，同时对血清PCR产物及克隆两种方法进行测序。本结果显示的均为优势毒株。
T1762A1764变异未在急性肝炎患者中检出而主要发生在HBV慢性感染过程中，可能是宿主免疫筛选结果。本研究及其它报道显示，T1762A1764变异既大量存在于无症状携带者(无活动肝病理损伤)、慢性肝炎、肝硬化患者中，又存在于重型肝炎患者中；推测该变异株的致病性主要决定于宿主因素。
另一值得注意的现象是T1762与A1764变异多是以联合型式出现。研究表明[6，8]，T1762替代变异可使前C和C mRNA 3′二级结构改变及BCP活性改变。其多以联合变异存在的原因可能因位置重迭于X基因区的T1762A1764变异同时对HBV X基因产生影响所致。该联合变异究竟对HBV X蛋白反式调节活性有多大影响，尚待进一步研究。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学九五重点课题基金资助(39630280)
参考文献
1 Takahashi K,Aoyama K,Ohno N，et al.The precore/core promoter mutant (T1762A1764) of hepatitis B virus:clinical significance and an easy method for detection.J General Virology,1995,76:3159-3164.
2 CHU CH,HAO Y,Tabor E.Hot-spot mutation in hepatitis B virus X gene in hepatocellular carcinoma.The Lancet,1996,348:625-626.
3 Sato S,Suzuki K,Akahane Y,et al.Hepatitis B virus strains with muatations in the core promoter in patients with fulminant hepatitis.Annals of Internal Medicine,1995,122:241-248.
, 百拇医药
4 LO WY,TING LP.Repression of enhancer II activity by a negative regulatory element in the hepatitis B virus genome.Journal of Virology,1994,68:1758-1764.
5 CHEN IH,HUANG CJ,Ting LP.Overlapping initiator and TATA box functions in the basal core promoter of hepatitis B virus.Journal of Virology,1995,69:3647-3657.
6 Moriyama K,Okamoto H,Tsuda F,et al.Reduced precore transcription and enhanced core-pregenome transcription of hepatitis B virus DNA after replacement of the precore-core promoter with sequences associated with e antigen-seronegative persistent infections.Virology,1996,226:269-280.
, 百拇医药
7 Kurosaki M,Enomoto N,Asahina Y,et al.Mutation in the core promoter region of hepatitis B virus in patients with chronic hepatitis B.J Med Virol,1996,49:115-123.
8 Alistair HK,Karin KL.A revised secondary structure model for the 3′-end of hepatitis B virus pregenomic RNA.Nucleic Acids Research,1996,24:3295-3301.
收稿：1998-02-12 修回：1998-09-08, http://www.100md.com