四川省HIV-1的基因分型调查
作者：赵春红 苏玲 张永钢 邵一鸣 滕智平 季阳
单位：610081 成都，中国协和医科大学，中国医学科学院输血研究所[赵春红(现在厦门市中心血站，361004)、张永钢、季阳]；中国预防医学科学院病毒学研究所(苏玲、邵一鸣、滕智平)
关键词：人类获得性免疫缺陷病毒1型；基因亚型；前病毒DNA
中华传染病杂志/990207 摘要 目的 了解四川省HIV-1各亚型的流行情况。方法 采集四川省内检出的12例HIV-1感染者的全血标本，提取核酸后用套式-聚合酶链反应(Nested-PCR)技术扩增HIV-1 env基因区，用异源双链电泳泳动法进行HIV-1亚型的分析。结果 12份标本中有11份PCR扩增阳性，亚型分析证明11份标本均为B亚型。结论 HIV-1 B亚型可能是四川省流行的主要亚型。
Genetic subtyping of HIV-1 in Sichuan province
, 百拇医药
ZHAO Chunhong, SU Ling, ZHANG Yonggang, et al.
Institute of Blood Transfusion, Chinese Academy of Medical Science and
Beijing Union Medical College, Chengdu 610081
Abstract Objective To investigate the epidemiology of HIV-1 in Sichuan Province.Methods The nuclear acids were extracted from blood samples of 12 infected individuals. The 0.7kb segment of HIV-1 envgene was amplified by nested PCR and the HIV-1 genetic subtypes were then assayed by heteroduplex mobility method.Results Eleven of 12 samples were determined to be positive by PCR amplification and all the 11 samples were found to be of genetic subtype B. Conclusion HIV-1 subtype B may be dominant in Sichuan Province.
, 百拇医药
Key words HIV-1 Genetic subtype Proviral DNA
目前流行于世界各地的HIV1可根据env基因和相应氨基酸序列的变异程度分为M群和O群，M群占主导地位，又可分为A～I 9个亚型[1]。各亚型间env区的序列差异达30%，O群与M群各亚型env区的差异达45%以上[2,3]。监测HIV1亚型的流行情况可从分子水平揭示HIV1的流行病学特征及其动态变化，并可为制订预防措施，控制HIV传播提供信息。本研究采用目前广泛应用的异源双链泳动分析法对四川省12例HIV1感染者进行了基因亚型的分析。
材料和方法
一、研究对象
选择1995年6月至1996年5月间在四川省检出的HIV血清抗体阳性者12例，其中男9例，女3例，年龄26～42岁，均是农民，在成都附近血站采血浆时发现，7例曾去河南省打工。12例无明显不适，亦未见有临床体征。分别采取静脉血5ml，CPD抗凝，-20°C贮存。
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二、试剂
Taq酶、dNTP购自华美生物工程公司；引物及含HIV-1各亚型标准株env基因的质粒由中国预防医学科学院艾滋病检测中心提供，见表1。
表1 引物在env基因中的位置 引物
DNA序列(5′～3′)
位置
B1
ATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTGT
335
k
GCGCCCATAGTCCTTCCTGAGGCTGCTCC
, http://www.100md.com
1530
C2
TGTCAGCACAGTACATACACATGGAAT
710
g1
CTAGAATTCACTTCTCCAATTGTCC
1390
三、检测方法
(一) 核酸的提取 1ml全血中加入6ml灭菌水，裂解后，2 000r/min，离心5分钟，弃上清，洗涤2～3次，沉淀移入1.5ml离心管，离心，弃上清，加入500μl细胞裂解液(15mmol/L Tris HCl, pH8.0,0.15mmol/L EDTA, 15mmol/L NaCl)，5μl蛋白酶K(20mg/ml)，混匀 ，37°C过夜，用氯仿-酚法抽提，核酸溶于30μl灭菌水中，-20°C贮存。
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(二) 聚合酶链反应(PCR)扩增 第一次扩增体积23μl，含Taq酶1.5U，2mmol/L dNTP 3μl，引物env B1/k各0.6μl，模板DNA 3μl，反应条件：94°C 2分钟，53°C 1分钟，72°C 4分钟，1个循环；94°C 30秒，53°C 1分钟，72°C 4分钟，30个循环；72°C 10分钟。取5μl第一次扩增产物或2μl质粒(10ng/μl)，进行第二次扩增，反应体系50μl，内含Taq酶3U，dNTP5μl，25mmol/L氯化镁1μl，引物envC2/g1各1μl反应条件同前(前31个循环延伸时间改为2分钟)。取2μl在含溴化乙锭的1%的琼脂糖中电泳判断结果。
(三) 异源双链泳动分析(HMA) 取5μl样本PCR扩增产物与5μl灭菌水或各亚型标准株的扩增产物，1.1μl 10×异源双链杂交液(10×1mol/L NaCl,100mmol/L Tris.HCl, pH 7.8,20mmol/L EDTA, pH 8.0)混匀，沸水浴2分钟，快速移入冰浴中，置20分钟。分别加入3μl上样缓冲液，在5%的聚丙烯酰胺中，250V，电泳4小时，电泳缓冲液1×TBE。置于含0.5μg/ml溴化乙锭的1×TBE中染色1小时，在紫外透射仪下观察结果。结果
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一、PCR扩增结果
用套式-聚合酶链反应(Nested-PCR)扩增后，11份样品为阳性。
二、HMA分型结果
11份扩增阳性的样品分别与各亚型标准株杂交后，电泳结果相似，均是与B亚型标准株形成的异源双链泳动最快,因此,11份样品均判定为B亚型。其中，4号样品与标准株杂交后的带型较复杂，且在接近同源双链区有2条泳动较快的异源双链，提示该感染者体内有2种或2种以上变异株的存在(见图1、2、3)。
图1 各亚型标准株杂交结果
9. 标准分子量(λ DNA EcoR Ⅰ/Hind Ⅱ:5148,4937,4268,3530,2027,1904,1548,1375,947, 831);8. B亚型标准株TH14自身对照;1～7. 分别为B亚型TH14株与G亚型LBV21-7、F亚型BZ162、E亚型TH22、D亚型UG46、C亚型MA959、B亚型SF162、A亚型RW20株杂交结果;He：异源双链 Ho：同源双链
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图2 3号标本与各亚型标准株杂交结果
1. 自身对照;2～8. 与A、B、C、D、E、F、G各亚型标准株杂交结果；9. 标准分子量(λ DNA EcoR Ⅰ/Hind Ⅱ：5148，4937，4268，3530，2027，1904，1548，1375，947，831);He：异源双链;Ho：同源双链
图3 4号标本与各亚型标准株杂交结果
1. 标准分子量(λ DNA EcoR Ⅰ/Hind Ⅱ：5148，4937`，4268，3530，2027，1904，1548，1375，947，831);2～5. 与E、C、B、A亚型标准株杂交结果;6. 自身对照;He：异源双链 ISHe：自体变异株形成的异源双链 Ho：同源双链
, http://www.100md.com 讨论
用于HIV-1分型的方法很多，其中序列分析法准确可靠，为基因分型的经典方法，但技术设备条件要求高，操作繁琐，费用较高，不易普及；血清学分型、PCR gag区分型及RNA酶错配法准确性较差；近年来广泛应用的HMA法则准确性高，与测序法的一致率在94%以上[4]，有报道一致率达100%[5]，且操作简单，耗时短，费用也较低，适用于大规模HIV-1基因分型的研究中。
HIV1各亚型呈地区性分布，且随时间迁移发生变化[6]。不同亚型可能有不同的传播途径，感染率也有不同[7]。研究HIV-1各亚型在各地区及不同人群中的分布情况，对于分析HIV的传播途径，制订针对性强的预防措施有一定的指导意义。
HIV各亚型间抗原抗体的中和反应不同，如用一种亚型的抗原包被反应板，其它亚型的病毒在感染早期易漏检[8]；不同亚型的HIV1毒株介导细胞融合的能力不同，导致疾病的进展有一定差异[1]；各亚型毒株间可合并感染，并发生重组[9]，如仅研制针对某种亚型的疫苗，不能保护机体免受其它亚型HIV的感染。因此，研究HIV-1亚型的流行及变异情况，对于提高HIV诊断试剂的质量，判断疾病的进展有指导意义，还可为研制具有广泛适用性的基因疫苗提供重要信息。
, 百拇医药
陈钧等[10]发现，1993年云南省静脉药瘾注射者中流行单一的B亚型，1994年以后，有C亚型出现。LUO等[11]报道1995年自泰国回国的卖淫妇女中发现有E亚型流行。其它省市HIV1的流行情况未见报道。本次研究对象均为有偿献血者且以供血浆为主，考虑到前几年HCV的流行情况，认为有可能是因操作中消毒不严造成的HIV传播；研究对象虽否认吸毒史，但在有偿献血者中也发现有吸毒者，分析传播来源也可能与静脉药瘾注射有关。本次研究因条件所限样本量较小，HIV1基因亚型的流行病学调查有待进行更广泛更深入的研究。
参考文献
1 Delwart EL,Sheppard HW,Walker J,et al. WHO network for HIV isolation and characterization HIV type 1 variation in World Health Organization-sponsored vaccine evaluation sites: genetic screening, sequence analysis, and preliminary biology characterication of selected viral strains. AIDS Res Hum Retroviruses, 1994, 10:1327-1347.
, http://www.100md.com
2 Myers G. HIV Between past and future. AIDS Res Hum Retroviruses, 1994,10:1317-1324.
3 Delwart EL, Herring B, Rodrigo AG, et al. Genetic subtype of human immunodeficiency virus using a heteroduplex mobility assay. PCR Meth Appl, 1995,4:S202-206.
4 Novitsky U, Amold C, Clewley JP, et al. Heteroduplex mobility assay for subtyping HIV-1: improved methodology and comp arison with phylogenetic analysis of sequence data. J Virol Meth, 1995,59:61-67.
, http://www.100md.com
5 Herring B, Wasi C, Raktham S, et al. WHO network for HIV isolation and characterization: rapid genetic characterization of HIV-1 from World Health Organization-sponsoredvaccine evaluation sitesusing a heteroduplex mobility assay. AIDS Res Hum Retroviruses, 1994,10:1345-1353.
6 邵一鸣，苏玲，陈钧，等.1995年云南瑞丽HIV毒株的基因变异和分析.病毒学报，1996，12：9-17.
7 Cohen J. Differences in HIV strains may underlie disease patterns. Science, 1995,270:30-31.
, 百拇医药
8 Gurtler L. HIV 诊断的困难与对策.国外医学预防、诊断、治疗用生物制品分册，1997，20:65-67.
9 Artenstein AW, Vancott TC, Mascola JR, et al. Dual infection with human immunodeficiency virus type 1 of distinct envelope subtype in humans. J Infect Dis, 1995,171:805-810.
10 陈钧，管永军，邵一鸣，等.云南陇川县HIV-1流行毒株膜蛋白基因C2-V3区序列测定和分析.中华微生物学和免疫学杂志，1997，17：1-6.
11 LUO CC. HIV-1 subtype C in china. Lancet, 1995,345:1051-1052.
收稿：1997-11-03 修回：1998-09-25, 百拇医药
单位：610081 成都，中国协和医科大学，中国医学科学院输血研究所[赵春红(现在厦门市中心血站，361004)、张永钢、季阳]；中国预防医学科学院病毒学研究所(苏玲、邵一鸣、滕智平)
关键词：人类获得性免疫缺陷病毒1型；基因亚型；前病毒DNA
中华传染病杂志/990207 摘要 目的 了解四川省HIV-1各亚型的流行情况。方法 采集四川省内检出的12例HIV-1感染者的全血标本，提取核酸后用套式-聚合酶链反应(Nested-PCR)技术扩增HIV-1 env基因区，用异源双链电泳泳动法进行HIV-1亚型的分析。结果 12份标本中有11份PCR扩增阳性，亚型分析证明11份标本均为B亚型。结论 HIV-1 B亚型可能是四川省流行的主要亚型。
Genetic subtyping of HIV-1 in Sichuan province
, 百拇医药
ZHAO Chunhong, SU Ling, ZHANG Yonggang, et al.
Institute of Blood Transfusion, Chinese Academy of Medical Science and
Beijing Union Medical College, Chengdu 610081
Abstract Objective To investigate the epidemiology of HIV-1 in Sichuan Province.Methods The nuclear acids were extracted from blood samples of 12 infected individuals. The 0.7kb segment of HIV-1 envgene was amplified by nested PCR and the HIV-1 genetic subtypes were then assayed by heteroduplex mobility method.Results Eleven of 12 samples were determined to be positive by PCR amplification and all the 11 samples were found to be of genetic subtype B. Conclusion HIV-1 subtype B may be dominant in Sichuan Province.
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Key words HIV-1 Genetic subtype Proviral DNA
目前流行于世界各地的HIV1可根据env基因和相应氨基酸序列的变异程度分为M群和O群，M群占主导地位，又可分为A～I 9个亚型[1]。各亚型间env区的序列差异达30%，O群与M群各亚型env区的差异达45%以上[2,3]。监测HIV1亚型的流行情况可从分子水平揭示HIV1的流行病学特征及其动态变化，并可为制订预防措施，控制HIV传播提供信息。本研究采用目前广泛应用的异源双链泳动分析法对四川省12例HIV1感染者进行了基因亚型的分析。
材料和方法
一、研究对象
选择1995年6月至1996年5月间在四川省检出的HIV血清抗体阳性者12例，其中男9例，女3例，年龄26～42岁，均是农民，在成都附近血站采血浆时发现，7例曾去河南省打工。12例无明显不适，亦未见有临床体征。分别采取静脉血5ml，CPD抗凝，-20°C贮存。
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二、试剂
Taq酶、dNTP购自华美生物工程公司；引物及含HIV-1各亚型标准株env基因的质粒由中国预防医学科学院艾滋病检测中心提供，见表1。
表1 引物在env基因中的位置 引物
DNA序列(5′～3′)
位置
B1
ATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTGT
335
k
GCGCCCATAGTCCTTCCTGAGGCTGCTCC
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1530
C2
TGTCAGCACAGTACATACACATGGAAT
710
g1
CTAGAATTCACTTCTCCAATTGTCC
1390
三、检测方法
(一) 核酸的提取 1ml全血中加入6ml灭菌水，裂解后，2 000r/min，离心5分钟，弃上清，洗涤2～3次，沉淀移入1.5ml离心管，离心，弃上清，加入500μl细胞裂解液(15mmol/L Tris HCl, pH8.0,0.15mmol/L EDTA, 15mmol/L NaCl)，5μl蛋白酶K(20mg/ml)，混匀 ，37°C过夜，用氯仿-酚法抽提，核酸溶于30μl灭菌水中，-20°C贮存。
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(二) 聚合酶链反应(PCR)扩增 第一次扩增体积23μl，含Taq酶1.5U，2mmol/L dNTP 3μl，引物env B1/k各0.6μl，模板DNA 3μl，反应条件：94°C 2分钟，53°C 1分钟，72°C 4分钟，1个循环；94°C 30秒，53°C 1分钟，72°C 4分钟，30个循环；72°C 10分钟。取5μl第一次扩增产物或2μl质粒(10ng/μl)，进行第二次扩增，反应体系50μl，内含Taq酶3U，dNTP5μl，25mmol/L氯化镁1μl，引物envC2/g1各1μl反应条件同前(前31个循环延伸时间改为2分钟)。取2μl在含溴化乙锭的1%的琼脂糖中电泳判断结果。
(三) 异源双链泳动分析(HMA) 取5μl样本PCR扩增产物与5μl灭菌水或各亚型标准株的扩增产物，1.1μl 10×异源双链杂交液(10×1mol/L NaCl,100mmol/L Tris.HCl, pH 7.8,20mmol/L EDTA, pH 8.0)混匀，沸水浴2分钟，快速移入冰浴中，置20分钟。分别加入3μl上样缓冲液，在5%的聚丙烯酰胺中，250V，电泳4小时，电泳缓冲液1×TBE。置于含0.5μg/ml溴化乙锭的1×TBE中染色1小时，在紫外透射仪下观察结果。结果
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一、PCR扩增结果
用套式-聚合酶链反应(Nested-PCR)扩增后，11份样品为阳性。
二、HMA分型结果
11份扩增阳性的样品分别与各亚型标准株杂交后，电泳结果相似，均是与B亚型标准株形成的异源双链泳动最快,因此,11份样品均判定为B亚型。其中，4号样品与标准株杂交后的带型较复杂，且在接近同源双链区有2条泳动较快的异源双链，提示该感染者体内有2种或2种以上变异株的存在(见图1、2、3)。
图1 各亚型标准株杂交结果
9. 标准分子量(λ DNA EcoR Ⅰ/Hind Ⅱ:5148,4937,4268,3530,2027,1904,1548,1375,947, 831);8. B亚型标准株TH14自身对照;1～7. 分别为B亚型TH14株与G亚型LBV21-7、F亚型BZ162、E亚型TH22、D亚型UG46、C亚型MA959、B亚型SF162、A亚型RW20株杂交结果;He：异源双链 Ho：同源双链
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图2 3号标本与各亚型标准株杂交结果
1. 自身对照;2～8. 与A、B、C、D、E、F、G各亚型标准株杂交结果；9. 标准分子量(λ DNA EcoR Ⅰ/Hind Ⅱ：5148，4937，4268，3530，2027，1904，1548，1375，947，831);He：异源双链;Ho：同源双链
图3 4号标本与各亚型标准株杂交结果
1. 标准分子量(λ DNA EcoR Ⅰ/Hind Ⅱ：5148，4937`，4268，3530，2027，1904，1548，1375，947，831);2～5. 与E、C、B、A亚型标准株杂交结果;6. 自身对照;He：异源双链 ISHe：自体变异株形成的异源双链 Ho：同源双链
, http://www.100md.com 讨论
用于HIV-1分型的方法很多，其中序列分析法准确可靠，为基因分型的经典方法，但技术设备条件要求高，操作繁琐，费用较高，不易普及；血清学分型、PCR gag区分型及RNA酶错配法准确性较差；近年来广泛应用的HMA法则准确性高，与测序法的一致率在94%以上[4]，有报道一致率达100%[5]，且操作简单，耗时短，费用也较低，适用于大规模HIV-1基因分型的研究中。
HIV1各亚型呈地区性分布，且随时间迁移发生变化[6]。不同亚型可能有不同的传播途径，感染率也有不同[7]。研究HIV-1各亚型在各地区及不同人群中的分布情况，对于分析HIV的传播途径，制订针对性强的预防措施有一定的指导意义。
HIV各亚型间抗原抗体的中和反应不同，如用一种亚型的抗原包被反应板，其它亚型的病毒在感染早期易漏检[8]；不同亚型的HIV1毒株介导细胞融合的能力不同，导致疾病的进展有一定差异[1]；各亚型毒株间可合并感染，并发生重组[9]，如仅研制针对某种亚型的疫苗，不能保护机体免受其它亚型HIV的感染。因此，研究HIV-1亚型的流行及变异情况，对于提高HIV诊断试剂的质量，判断疾病的进展有指导意义，还可为研制具有广泛适用性的基因疫苗提供重要信息。
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陈钧等[10]发现，1993年云南省静脉药瘾注射者中流行单一的B亚型，1994年以后，有C亚型出现。LUO等[11]报道1995年自泰国回国的卖淫妇女中发现有E亚型流行。其它省市HIV1的流行情况未见报道。本次研究对象均为有偿献血者且以供血浆为主，考虑到前几年HCV的流行情况，认为有可能是因操作中消毒不严造成的HIV传播；研究对象虽否认吸毒史，但在有偿献血者中也发现有吸毒者，分析传播来源也可能与静脉药瘾注射有关。本次研究因条件所限样本量较小，HIV1基因亚型的流行病学调查有待进行更广泛更深入的研究。
参考文献
1 Delwart EL,Sheppard HW,Walker J,et al. WHO network for HIV isolation and characterization HIV type 1 variation in World Health Organization-sponsored vaccine evaluation sites: genetic screening, sequence analysis, and preliminary biology characterication of selected viral strains. AIDS Res Hum Retroviruses, 1994, 10:1327-1347.
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3 Delwart EL, Herring B, Rodrigo AG, et al. Genetic subtype of human immunodeficiency virus using a heteroduplex mobility assay. PCR Meth Appl, 1995,4:S202-206.
4 Novitsky U, Amold C, Clewley JP, et al. Heteroduplex mobility assay for subtyping HIV-1: improved methodology and comp arison with phylogenetic analysis of sequence data. J Virol Meth, 1995,59:61-67.
, http://www.100md.com
5 Herring B, Wasi C, Raktham S, et al. WHO network for HIV isolation and characterization: rapid genetic characterization of HIV-1 from World Health Organization-sponsoredvaccine evaluation sitesusing a heteroduplex mobility assay. AIDS Res Hum Retroviruses, 1994,10:1345-1353.
6 邵一鸣，苏玲，陈钧，等.1995年云南瑞丽HIV毒株的基因变异和分析.病毒学报，1996，12：9-17.
7 Cohen J. Differences in HIV strains may underlie disease patterns. Science, 1995,270:30-31.
, 百拇医药
8 Gurtler L. HIV 诊断的困难与对策.国外医学预防、诊断、治疗用生物制品分册，1997，20:65-67.
9 Artenstein AW, Vancott TC, Mascola JR, et al. Dual infection with human immunodeficiency virus type 1 of distinct envelope subtype in humans. J Infect Dis, 1995,171:805-810.
10 陈钧，管永军，邵一鸣，等.云南陇川县HIV-1流行毒株膜蛋白基因C2-V3区序列测定和分析.中华微生物学和免疫学杂志，1997，17：1-6.
11 LUO CC. HIV-1 subtype C in china. Lancet, 1995,345:1051-1052.
收稿：1997-11-03 修回：1998-09-25, 百拇医药