人牙本质磷蛋白的提取与特性分析
作者：欧阳勇 李玉晶 宿颖
单位：100050 首都医科大学附属北京口腔医院(欧阳勇现在中山医科大学口腔医学院)
关键词：磷蛋白类；牙本质；细胞分离
中华口腔医学杂志990215 【摘要】 目的 建立人牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein , DPP)的提取方法并分析其特性。方法 将人牙本质粉用0.6 mol/L HCl脱矿后，用DEAE-Sepharose CL6B离子交换层析柱分离纯化DPP，取纯化的人DPP，用紫外分光光度计检测其吸光度值；用等离子发射光谱分析其磷含量；SDS-PAGE测量相对分子质量；并在水解后进行氨基酸含量分析。结果 用0.6 mol/L HCl脱矿，可以有效地提取人DPP。所提取的DPP是磷含量较高的蛋白质。相对分子质量分别为：141 000，124 000，108 000，氨基酸组成中天门冬氨酸和丝氨酸的含量较高，分别为23.8%和19.1%。结论 用0.6 mol/L HCl脱矿和离子交换层析等方法可以分离纯化人DPP；人DPP是牙本质中一组含磷量较高、相对分子质量较大(100 000～150 000)、富含丝氨酸和天门冬氨酸的阴离子蛋白质。
, http://www.100md.com
The isolation and characterization of dentin phosphoprotein from human dentine OUYANG Yong，LI Yujing，SU Ying. Beijing Stomatological Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050
【Abstract】 Objective To establish the method of isolation and characteriztion of dentin phosphoprotein(DPP) from human dentine. Methods Dentin powder was placed in dialysis tube after demineralized to completion with 0.6 mol/L HCl, then isolated DPP through DEAE-Sepharose CL6B anion exchange chromatography. Its protein composition,organic phosphorus content,molecular weight and amino acid were analyzed. Results DPP contained high organic phosphorus, 23.8% of aspartic residue and 19.1% serine residue; their molecular weight were 141 000,124 000,108 000 respectively. Conclusion DPP can be extracted from human dentine with 0.6 mol/L HCl demineralization.and DEAE-Sepharose CL6B anion exchangechromatography. It is a group of proteins which have a high content of organic phosphorus and is found to be rich in serine and aspartic acid residues.
, 百拇医药
【Key words】 Phosphoproteins Dentin Cell separation
牙本质磷蛋白(dentin phorsphoprotein or phosphophoryn，DPP)是非胶原蛋白的重要组成成分，约占50%。它是一种高度磷酸化的蛋白质，带有很强的负电荷，是目前所发现的酸性最强的蛋白质[1]，与Ca2+的结合能力很强[2]。尽管目前对它的功能还不很清楚，但大多数学者认为DPP可能在牙本质的形成，尤其是生物矿化过程中起着重要的作用[3-5]。近年来，为了对DPP进行深入研究，许多学者已成功地提取了鼠、牛、猪等动物牙齿内的DPP[6]，但对于人DPP的提取和鉴定还做得较少。本项研究的目的是分离纯化人DPP，并对所提取的DPP性质进行初步分析，为探讨人DPP在牙本质生长发育、生物矿化和修复功能中的作用奠定基础。
, 百拇医药 材料与方法
一、材料
1.健康人离体牙：北京口腔医院正畸中心及儿科提供的正畸减数健康恒牙，主要是双尖牙及少量的无龋阻生牙。
2.主要试剂：盐酸苯甲脒(benzamidine HCl)；N-乙基-顺丁烯二酰亚胺(N-ethyl maleimide)；α-氨基己酸(amino-n-caproic acid)；苯基甲磺酰氟(phenylmethylsulfonylfluorid，PMSF)；SDS(十二烷基硫酸钠)；DEAE-Sepharose CL6B；以上均为美国Sigma公司产品。截流相对分子质量为8 000的生物透析袋(华美公司)，低相对分子质量标准蛋白(上海丽珠东风生物技术有限公司)。
3.主要仪器：GL20A全自动高速冷冻离心机(湘西仪器仪表总厂机械仪器厂)；FD-1-840冷冻干燥机 (Leybold Vacuum Products INC)； HL-2型恒流泵、H-250梯度混合器、BS2-100自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂 )； FH8802-2 紫外检测仪(浙江省温州市分析仪器厂)； Yokogawa3075 记录仪(四川仪表器厂)；BDF-1600型双恒电泳仪(北京东方仪器厂)； ICAP-9000 美国FA电感耦合等离子发射光谱(美国ZA公司)；Beckman 121 MB型氨基酸自动分析仪(美国Beckman公司)
, 百拇医药
二、 DPP的提取
1. 牙本质粉末的制备与洗涤：健康正畸减数牙拔除后立即置于15%NaCl溶液中，内含蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor；PI)，包括2.5 mmol盐酸苯甲脒，50 mmol α-氨基己酸，0.5 mmol N-乙基-顺丁烯二酰亚胺，0.3 mmol PMSF，4℃保存。在数小时内刮除牙周软组织，去除牙冠及牙髓，磨除牙骨质，置于-70℃低温保存。收集足量后，粉碎成细小的粉末。取适量(50g左右)牙本质粉加入新配制的2.56 mol NaCl溶液(内含PI)约300 mL,于4℃搅拌过夜，低温离心(10 000rpm)10 min，其沉淀物经无水乙醇、2% SDS溶液(内含PI)在冰水中超声处理60 min，离心弃上清，再用双蒸水反复清洗3遍，离心后备用。
2. 脱矿：将经过充分洗涤的牙本质粉装入截流相对分子质量为8 000的生物透析袋中，加入适量0.6 mol/L HCl (约1 ml/g)，密封后置于2 000 mL 0.6 mol/L HCl脱矿溶液中透析，4℃下脱矿，每隔1天换脱矿液，并用原子吸收光谱测其Ca2+含量，直到Ca2+浓度测不出为止。再低温离心，取上清置于另一透析袋内用双蒸水透析约3～5天。用聚乙二醇将其浓缩，冷冻干燥即得到粗提的DPP样品。
, 百拇医药
3. 分离纯化：将冷冻干燥的粗提DPP溶于0.05 mol Tris-HCl(pH值为 8.2)中，在4℃下进行离子交换层析，选用DEAE-Sepharose CL6B离子交换层析凝胶(1.6 cm×15 cm ),用0～0.7 mol NaCl溶液梯度洗脱，调节层析速度至每分钟8滴。每10 min收集一个组份，共73个组份。在230 nm波长处记录其吸光值，并绘制吸光值曲线图。在每个所得组份中取适量样品，用等离子发射光谱仪测其磷含量，所得结果亦可绘出一条曲线。收集吸光值曲线与磷含量曲线峰值相对应的组份，再次用双蒸水透析，浓缩后冻干，即得纯化的DPP样品。
三 、DPP的特性分析
1. 蛋白含量分析：组份通过紫外检测仪，在230 nm波长下测得其吸光值，可以绘制一条洗脱曲线。由于吸光值与蛋白含量成正相关关系，故可以代表蛋白质的相对含量。
2. 磷含量分析：各个组份分别取0.5ml样品加入适量浓硝酸，140℃硝化4小时后，用等离子发射光谱仪测其磷含量。
, 百拇医药
3 .SDS-PAGE测DPP相对分子质量：取1mg DPP样品，用蛋白质样品溶解液配成1 g/L溶液；沸水浴2～3 min ，采用SDS不连续系统垂直平板电泳法，3%聚丙烯酰胺浓缩胶，9%聚丙烯酰胺分离胶，电泳液用SDS-Tris-甘氨酸系统。取10～15 μl DPP样品液和低分子标准蛋白同时电泳。甲醇、冰乙酸混合液固定，0.25%考马斯亮兰R-250水(Coomassie brilliant blue R-250)染色，酸甲醇水脱色。测量迁移距离及胶长，计算相对迁移率，求出DPP的相对分子质量。
4. DPP氨基酸分析:取冻干的DPP样品0.1mg，加0.4ml 5.7 mol/L HCl 置于硝化管中，抽真空，110℃水解24小时，取出干燥，加适量的缓冲液(0.2ml, pH值为2.0, 柠檬酸)，用氨基酸自动分析仪分析DPP的氨基酸组成。
结果
1 .蛋白含量分析：见图1。从图中可以看出有3个洗脱高峰。
, 百拇医药
图1 DPP洗脱曲线图
2 .磷含量分析： 以组份为横坐标，组份的磷含量为纵坐标，亦可得出一条磷含量曲线图(图2)，也有3个主峰。把蛋白质吸光值曲线和磷含量曲线绘于同一坐标内，可得到如下曲线图(图3)。
图2 DPP磷含量曲线
图3 DPP蛋白含量与磷含量曲线分析图
3. DPP相对分子质量测定:本实验得到的电泳图谱见图4，可以看出3条清楚的色带，根据相对分子质量与相对迁移率的关系，可以计算出它的相对分子质量分别为141 000，124 000，108 000。
, 百拇医药
图4 DPP电泳图谱
4 .DPP氨基酸分析：所提取DPP样品的氨基酸分析结果:每1 000个氨基酸残基中各种氨基酸的数目分别是：天门冬氨酸Asp 238.1,丝氨酸Ser 191.5,苏氨酸Thr 30.2,谷氨酸Glu 174.4, 脯氨酸Pro 41.2,甘氨酸Gly 103.0,丙氨酸Ala 36.9,颉氨酸Val 34.6，甲酰氨酸Met 8.1,异亮氨酸Iso 25.6,亮氨酸Leu 25.8,酪氨酸 Tyr 8.9,苯丙氨酸Phe 8.6, 赖氨酸Lys 36.4,组氨酸His 9.8,精氨酸Arg 26.9。
讨论
本研究采用0.6 mol/L HCl脱矿和离子交换层析方法分离纯化人DPP。实验时蛋白洗脱曲线产生的3个峰值与磷含量曲线产生的3个主峰相对应。所收集的DPP样品正是与这3个主峰相对应的组份，说明本实验所得DPP样品是磷含量较高的蛋白质，而这也正是DPP的重要特征之一，支持McCurdy等[7]得出的结论。从SDS-PAGE蛋白电泳所测出的相对分子质量来看，本实验DPP样品在电泳图谱中产生了3条清晰的色带，它们的相对分子质量分别是141 000，124 000，108 000，说明本实验所得产品是混合物，其相对分子质量不同。本实验结果与Chiego等[8]提出的在人牙本质中可能存在一个DPP家族的推论有吻合之处。Chang等[9]报道，人DPP的相对分子质量在140 000附近，与本实验结果非常接近。而其它学者报导鼠、牛DPP相对分子质量范围分别在鼠30～100 000，牛35～158 000之间。如此看来，人DPP相对分子质量比鼠、牛要大一些。
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从本研究DPP氨基酸分析结果可以看出，天门冬氨酸、丝氨酸含量较高，分别为23.81%和19.15%，和以往学者Linde[10]报道的40%有一定差别。作者以为本实验产品的DPP是一种混合物，这种混合物的构成比不同，亦可以产生不同的结果，但是DPP的主要氨基酸组成是一致的，富含天门冬氨酸和丝氨酸正是DPP的重要特征。
关于DPP的提取方法，本实验选用人牙根相关牙本质提取DPP，获得了令人满意的结果。笔者以为在提取DPP这种微量蛋白质时，有许多因素值得注意，如原料的取材与处理，实验过程中温度的设定，防止蛋白变性和降解的措施与方法，脱矿液的选择，以及分离纯化使用的方法等，其中0.6 mol/L HCl脱矿、离子交换层析以及蛋白酶抑制剂的使用是十分关键的。
DPP是造牙本质细胞分泌产生的，代表了造牙本质细胞的活性，参与并调节牙本质的生长发育与矿物形成，研究DPP将有助于了解和深入认识牙本质乃至整个牙齿的发育和修复过程，对预防和临床治疗龋病、牙髓病，尤其是在活髓保持方面都有十分重要的意义。本研究建立了提取人DPP的方法并对其特性进行了初步分析，为对DPP的功能进一步研究打下基础。然而，目前DPP的研究还处在初始阶段，在DPP的活性保存、进一步纯化以及特性、结构等方面还有待于进一步探讨。
, 百拇医药
北京市自然科学基金资助项目
参考文献
1 Linde A, Bhown M, Butler WT. Noncollagenous proteins of dentin.A reexamination of proteins from at incisor dentin utilizing techniques to avoid artifacts.J Biol Chem ,1980, 255:5931-42.
2 Mary E marsh. Binding of calcium and phosphate ions to dentin phosphophoryn. Biochemistry, 1989,28:346-352.
3 Butler WT,Ritchie H. The nature and functional significance of dentin extracellular matrix proteins. Int J Dev Biol ,1995,39:169-179.
, http://www.100md.com
4 Hunter GK,Hauschka PV,Poole AR,et al. Nucleation and inhibition of hydroxyapatite formation by mineralized tissue proteins. Biochem J, 1996,317(Pt 1):59-64.
5 Lussi A, Linde A. Mineral induction in vivo by dentine proteins. Caries Res, 1993,27:241-248.
6 Rahima M , Veis A.Two classes of dentin phosphophoryns,from a wide range of species,contain inmunologially cross-reactive epitope regions. Calcif Tissue Int,1988,42:104-112.
, http://www.100md.com
7 McCurdy SP,Clarkson BH , Speirs RL, et al.Phosphoprotein extraction from the dentine/cementum complex of human tooth roots. Arch Oral Biol, 1990,35 :347-357.
8 Chang SR, Chiego D Jr, Ruthford RB, et al. Extraction and identification of phosphoprotein from human dentin. J Dent Res,1995,74:119.
9 Chang SR, Chiego D Jr, Clarkson BH. Characterization and identification of a human dentin phosphophoryn. Calcif Tissue Int,1996,59:149-153.
10 Linde A. Differences between non-collagenous protein content of rat incisor and permanent bovine dentin. Scand J Dent Res, 1988,96:188-198.
(收稿:1998-07-16 修回:1998-11-24), 百拇医药
单位：100050 首都医科大学附属北京口腔医院(欧阳勇现在中山医科大学口腔医学院)
关键词：磷蛋白类；牙本质；细胞分离
中华口腔医学杂志990215 【摘要】 目的 建立人牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein , DPP)的提取方法并分析其特性。方法 将人牙本质粉用0.6 mol/L HCl脱矿后，用DEAE-Sepharose CL6B离子交换层析柱分离纯化DPP，取纯化的人DPP，用紫外分光光度计检测其吸光度值；用等离子发射光谱分析其磷含量；SDS-PAGE测量相对分子质量；并在水解后进行氨基酸含量分析。结果 用0.6 mol/L HCl脱矿，可以有效地提取人DPP。所提取的DPP是磷含量较高的蛋白质。相对分子质量分别为：141 000，124 000，108 000，氨基酸组成中天门冬氨酸和丝氨酸的含量较高，分别为23.8%和19.1%。结论 用0.6 mol/L HCl脱矿和离子交换层析等方法可以分离纯化人DPP；人DPP是牙本质中一组含磷量较高、相对分子质量较大(100 000～150 000)、富含丝氨酸和天门冬氨酸的阴离子蛋白质。
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The isolation and characterization of dentin phosphoprotein from human dentine OUYANG Yong，LI Yujing，SU Ying. Beijing Stomatological Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050
【Abstract】 Objective To establish the method of isolation and characteriztion of dentin phosphoprotein(DPP) from human dentine. Methods Dentin powder was placed in dialysis tube after demineralized to completion with 0.6 mol/L HCl, then isolated DPP through DEAE-Sepharose CL6B anion exchange chromatography. Its protein composition,organic phosphorus content,molecular weight and amino acid were analyzed. Results DPP contained high organic phosphorus, 23.8% of aspartic residue and 19.1% serine residue; their molecular weight were 141 000,124 000,108 000 respectively. Conclusion DPP can be extracted from human dentine with 0.6 mol/L HCl demineralization.and DEAE-Sepharose CL6B anion exchangechromatography. It is a group of proteins which have a high content of organic phosphorus and is found to be rich in serine and aspartic acid residues.
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【Key words】 Phosphoproteins Dentin Cell separation
牙本质磷蛋白(dentin phorsphoprotein or phosphophoryn，DPP)是非胶原蛋白的重要组成成分，约占50%。它是一种高度磷酸化的蛋白质，带有很强的负电荷，是目前所发现的酸性最强的蛋白质[1]，与Ca2+的结合能力很强[2]。尽管目前对它的功能还不很清楚，但大多数学者认为DPP可能在牙本质的形成，尤其是生物矿化过程中起着重要的作用[3-5]。近年来，为了对DPP进行深入研究，许多学者已成功地提取了鼠、牛、猪等动物牙齿内的DPP[6]，但对于人DPP的提取和鉴定还做得较少。本项研究的目的是分离纯化人DPP，并对所提取的DPP性质进行初步分析，为探讨人DPP在牙本质生长发育、生物矿化和修复功能中的作用奠定基础。
, 百拇医药 材料与方法
一、材料
1.健康人离体牙：北京口腔医院正畸中心及儿科提供的正畸减数健康恒牙，主要是双尖牙及少量的无龋阻生牙。
2.主要试剂：盐酸苯甲脒(benzamidine HCl)；N-乙基-顺丁烯二酰亚胺(N-ethyl maleimide)；α-氨基己酸(amino-n-caproic acid)；苯基甲磺酰氟(phenylmethylsulfonylfluorid，PMSF)；SDS(十二烷基硫酸钠)；DEAE-Sepharose CL6B；以上均为美国Sigma公司产品。截流相对分子质量为8 000的生物透析袋(华美公司)，低相对分子质量标准蛋白(上海丽珠东风生物技术有限公司)。
3.主要仪器：GL20A全自动高速冷冻离心机(湘西仪器仪表总厂机械仪器厂)；FD-1-840冷冻干燥机 (Leybold Vacuum Products INC)； HL-2型恒流泵、H-250梯度混合器、BS2-100自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂 )； FH8802-2 紫外检测仪(浙江省温州市分析仪器厂)； Yokogawa3075 记录仪(四川仪表器厂)；BDF-1600型双恒电泳仪(北京东方仪器厂)； ICAP-9000 美国FA电感耦合等离子发射光谱(美国ZA公司)；Beckman 121 MB型氨基酸自动分析仪(美国Beckman公司)
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二、 DPP的提取
1. 牙本质粉末的制备与洗涤：健康正畸减数牙拔除后立即置于15%NaCl溶液中，内含蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor；PI)，包括2.5 mmol盐酸苯甲脒，50 mmol α-氨基己酸，0.5 mmol N-乙基-顺丁烯二酰亚胺，0.3 mmol PMSF，4℃保存。在数小时内刮除牙周软组织，去除牙冠及牙髓，磨除牙骨质，置于-70℃低温保存。收集足量后，粉碎成细小的粉末。取适量(50g左右)牙本质粉加入新配制的2.56 mol NaCl溶液(内含PI)约300 mL,于4℃搅拌过夜，低温离心(10 000rpm)10 min，其沉淀物经无水乙醇、2% SDS溶液(内含PI)在冰水中超声处理60 min，离心弃上清，再用双蒸水反复清洗3遍，离心后备用。
2. 脱矿：将经过充分洗涤的牙本质粉装入截流相对分子质量为8 000的生物透析袋中，加入适量0.6 mol/L HCl (约1 ml/g)，密封后置于2 000 mL 0.6 mol/L HCl脱矿溶液中透析，4℃下脱矿，每隔1天换脱矿液，并用原子吸收光谱测其Ca2+含量，直到Ca2+浓度测不出为止。再低温离心，取上清置于另一透析袋内用双蒸水透析约3～5天。用聚乙二醇将其浓缩，冷冻干燥即得到粗提的DPP样品。
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3. 分离纯化：将冷冻干燥的粗提DPP溶于0.05 mol Tris-HCl(pH值为 8.2)中，在4℃下进行离子交换层析，选用DEAE-Sepharose CL6B离子交换层析凝胶(1.6 cm×15 cm ),用0～0.7 mol NaCl溶液梯度洗脱，调节层析速度至每分钟8滴。每10 min收集一个组份，共73个组份。在230 nm波长处记录其吸光值，并绘制吸光值曲线图。在每个所得组份中取适量样品，用等离子发射光谱仪测其磷含量，所得结果亦可绘出一条曲线。收集吸光值曲线与磷含量曲线峰值相对应的组份，再次用双蒸水透析，浓缩后冻干，即得纯化的DPP样品。
三 、DPP的特性分析
1. 蛋白含量分析：组份通过紫外检测仪，在230 nm波长下测得其吸光值，可以绘制一条洗脱曲线。由于吸光值与蛋白含量成正相关关系，故可以代表蛋白质的相对含量。
2. 磷含量分析：各个组份分别取0.5ml样品加入适量浓硝酸，140℃硝化4小时后，用等离子发射光谱仪测其磷含量。
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3 .SDS-PAGE测DPP相对分子质量：取1mg DPP样品，用蛋白质样品溶解液配成1 g/L溶液；沸水浴2～3 min ，采用SDS不连续系统垂直平板电泳法，3%聚丙烯酰胺浓缩胶，9%聚丙烯酰胺分离胶，电泳液用SDS-Tris-甘氨酸系统。取10～15 μl DPP样品液和低分子标准蛋白同时电泳。甲醇、冰乙酸混合液固定，0.25%考马斯亮兰R-250水(Coomassie brilliant blue R-250)染色，酸甲醇水脱色。测量迁移距离及胶长，计算相对迁移率，求出DPP的相对分子质量。
4. DPP氨基酸分析:取冻干的DPP样品0.1mg，加0.4ml 5.7 mol/L HCl 置于硝化管中，抽真空，110℃水解24小时，取出干燥，加适量的缓冲液(0.2ml, pH值为2.0, 柠檬酸)，用氨基酸自动分析仪分析DPP的氨基酸组成。
结果
1 .蛋白含量分析：见图1。从图中可以看出有3个洗脱高峰。
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图1 DPP洗脱曲线图
2 .磷含量分析： 以组份为横坐标，组份的磷含量为纵坐标，亦可得出一条磷含量曲线图(图2)，也有3个主峰。把蛋白质吸光值曲线和磷含量曲线绘于同一坐标内，可得到如下曲线图(图3)。
图2 DPP磷含量曲线
图3 DPP蛋白含量与磷含量曲线分析图
3. DPP相对分子质量测定:本实验得到的电泳图谱见图4，可以看出3条清楚的色带，根据相对分子质量与相对迁移率的关系，可以计算出它的相对分子质量分别为141 000，124 000，108 000。
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图4 DPP电泳图谱
4 .DPP氨基酸分析：所提取DPP样品的氨基酸分析结果:每1 000个氨基酸残基中各种氨基酸的数目分别是：天门冬氨酸Asp 238.1,丝氨酸Ser 191.5,苏氨酸Thr 30.2,谷氨酸Glu 174.4, 脯氨酸Pro 41.2,甘氨酸Gly 103.0,丙氨酸Ala 36.9,颉氨酸Val 34.6，甲酰氨酸Met 8.1,异亮氨酸Iso 25.6,亮氨酸Leu 25.8,酪氨酸 Tyr 8.9,苯丙氨酸Phe 8.6, 赖氨酸Lys 36.4,组氨酸His 9.8,精氨酸Arg 26.9。
讨论
本研究采用0.6 mol/L HCl脱矿和离子交换层析方法分离纯化人DPP。实验时蛋白洗脱曲线产生的3个峰值与磷含量曲线产生的3个主峰相对应。所收集的DPP样品正是与这3个主峰相对应的组份，说明本实验所得DPP样品是磷含量较高的蛋白质，而这也正是DPP的重要特征之一，支持McCurdy等[7]得出的结论。从SDS-PAGE蛋白电泳所测出的相对分子质量来看，本实验DPP样品在电泳图谱中产生了3条清晰的色带，它们的相对分子质量分别是141 000，124 000，108 000，说明本实验所得产品是混合物，其相对分子质量不同。本实验结果与Chiego等[8]提出的在人牙本质中可能存在一个DPP家族的推论有吻合之处。Chang等[9]报道，人DPP的相对分子质量在140 000附近，与本实验结果非常接近。而其它学者报导鼠、牛DPP相对分子质量范围分别在鼠30～100 000，牛35～158 000之间。如此看来，人DPP相对分子质量比鼠、牛要大一些。
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从本研究DPP氨基酸分析结果可以看出，天门冬氨酸、丝氨酸含量较高，分别为23.81%和19.15%，和以往学者Linde[10]报道的40%有一定差别。作者以为本实验产品的DPP是一种混合物，这种混合物的构成比不同，亦可以产生不同的结果，但是DPP的主要氨基酸组成是一致的，富含天门冬氨酸和丝氨酸正是DPP的重要特征。
关于DPP的提取方法，本实验选用人牙根相关牙本质提取DPP，获得了令人满意的结果。笔者以为在提取DPP这种微量蛋白质时，有许多因素值得注意，如原料的取材与处理，实验过程中温度的设定，防止蛋白变性和降解的措施与方法，脱矿液的选择，以及分离纯化使用的方法等，其中0.6 mol/L HCl脱矿、离子交换层析以及蛋白酶抑制剂的使用是十分关键的。
DPP是造牙本质细胞分泌产生的，代表了造牙本质细胞的活性，参与并调节牙本质的生长发育与矿物形成，研究DPP将有助于了解和深入认识牙本质乃至整个牙齿的发育和修复过程，对预防和临床治疗龋病、牙髓病，尤其是在活髓保持方面都有十分重要的意义。本研究建立了提取人DPP的方法并对其特性进行了初步分析，为对DPP的功能进一步研究打下基础。然而，目前DPP的研究还处在初始阶段，在DPP的活性保存、进一步纯化以及特性、结构等方面还有待于进一步探讨。
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北京市自然科学基金资助项目
参考文献
1 Linde A, Bhown M, Butler WT. Noncollagenous proteins of dentin.A reexamination of proteins from at incisor dentin utilizing techniques to avoid artifacts.J Biol Chem ,1980, 255:5931-42.
2 Mary E marsh. Binding of calcium and phosphate ions to dentin phosphophoryn. Biochemistry, 1989,28:346-352.
3 Butler WT,Ritchie H. The nature and functional significance of dentin extracellular matrix proteins. Int J Dev Biol ,1995,39:169-179.
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4 Hunter GK,Hauschka PV,Poole AR,et al. Nucleation and inhibition of hydroxyapatite formation by mineralized tissue proteins. Biochem J, 1996,317(Pt 1):59-64.
5 Lussi A, Linde A. Mineral induction in vivo by dentine proteins. Caries Res, 1993,27:241-248.
6 Rahima M , Veis A.Two classes of dentin phosphophoryns,from a wide range of species,contain inmunologially cross-reactive epitope regions. Calcif Tissue Int,1988,42:104-112.
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7 McCurdy SP,Clarkson BH , Speirs RL, et al.Phosphoprotein extraction from the dentine/cementum complex of human tooth roots. Arch Oral Biol, 1990,35 :347-357.
8 Chang SR, Chiego D Jr, Ruthford RB, et al. Extraction and identification of phosphoprotein from human dentin. J Dent Res,1995,74:119.
9 Chang SR, Chiego D Jr, Clarkson BH. Characterization and identification of a human dentin phosphophoryn. Calcif Tissue Int,1996,59:149-153.
10 Linde A. Differences between non-collagenous protein content of rat incisor and permanent bovine dentin. Scand J Dent Res, 1988,96:188-198.
(收稿:1998-07-16 修回:1998-11-24), 百拇医药