改良角膜活检法对真菌性角膜溃疡的临床诊断
作者：谢立信 史伟云 刘敬 李绍伟 潘晓刚 褚建 姚瞻
单位：266071 山东省医学科学院眼科研究所
关键词：角膜溃疡；真菌感染；角膜活检
眼科新进展990205 摘要 目的 对角膜活检加178.2mmol.L-1(100g.L-1)氢氧化钾法诊断真菌性角膜溃疡的阳性率进行评价。 方法 对80例临床诊断真菌性角膜溃疡患者，在行穿透性角膜移植前，角膜刮片、角膜活检加178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片法和角膜移植术后组织病理学染色的结果进行比较。结果 角膜活检加178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片法诊断真菌性角膜溃疡阳性率为97.5%.结论 角膜活检加178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片法是一种快速、便捷、阳性率高的诊断真菌性角膜溃疡的方法。
, 百拇医药
An improved method for diagnosis of fungal corneal ulcer
XIE Li-Xin, SHI Wei-Yun,LIU Jing,LI Shao-Wei,PAN Xiao-Gang,CHU Jian,YAO Zhan
Abstract Objective To evaluate the feasibility of corneal biopsy combined with 178.2mmol.L-1 potassium hydroxide slide in diagnosis of fungal corneal ulcer. Methods Corneal scraping and corneal biopsy with 178.2mmol.L-1 potassium hydroxide slide were used to examine 80 cases of fungal corneal ulcer before penetrating keratoplasty.Postoperatively,the pathological samples were stained with histopathological methods.The three results were analyzed and compared. Results The positive rate of corneal biopsy combined with 178.2mmol.L-1 potassium hydroxide slide was 97.5%.Conclusion Corneal biopsy with 178.2mmol.L-1 potassium hydroxide slide is a rapid and simple method with high positive rate in diagnosis of fungal corneal ulcer.
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Key words corneal ulcer/diagnosis;fungal infection corneal biopsy
作者简介 谢立信，教授、研究员。男，1942年12月出生，汉族，中共党员，山东莱州人。1965年毕业于山东医学院医疗系。1987年～1988年在美国路易斯安那州立大学眼科中心从事角膜病博士后研究工作。现任山东省科协副主席、山东省医学科学院副院长、眼科研究所所长、眼科医院院长等职，是青岛大学医学院博士生导师、北京医科大学兼职教授、博士生导师。兼任国家自然科学基金会学科评审委员、亚太地区角膜病学会理事、《中华眼科杂志》等国内8种眼科杂志编委等职。谢立信教授在角膜病应用基础研究、眼库技术和眼前节显微手术方面做了大量工作，取得了突出成就，在国内外眼科界具有较大影响。首先提出了供体角膜内皮细胞活性密度的新概念，改进了国际上供体角膜移植术后植片内皮细胞功能失代偿的标准，获国家科技进步二等奖。是我国开展现代小切口超声乳化白内障手术的先导；对儿童白内障手术有独到之处；在我国率先开展了MLK手术，随后又开展了PRK和LASIK手术。是我国眼库的创始人之一，现任中华眼库协会会长。联系电话：0532-5885195，5876380；传真：0532-5881212；
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E-mail:lixinxie@public.qd.sd.cn 对真菌性角膜溃疡的诊断，仅靠病史和临床表现是不够的，只有在病变角膜内检出真菌才能确诊[1]。以往常用角膜刮片加氢氧化钾湿片法，但阳性率不高[2]。角膜真菌培养需要时间较长。因此，目前对真菌性角膜溃疡的诊断缺少一种快速、准确的检查方法，常使患者延误治疗，有的甚至丧失眼球。我们对1995年6月～1996年12月临床诊断真菌性角膜溃疡患者，行病灶角膜活检、178.2mmol.L-1氢氧化钾湿化法检菌，取得良好结果，现报告如下。
1 对象与方法
1.1 对象 根据病史和临床表现诊断为真菌性角膜溃疡患者80例，其中农民72例，工人8例，其它2例。男50例，女30例，年龄21～71a，平均40.5a。病史3d～3mo不等。有明显植物和泥土外伤史者30例，单疱病毒性角膜炎长期使用皮质类固醇后病情恶化者10例，穿透性角膜移植术后不明原因植片溃疡者2例，其余患者无特殊诱因。90%患者在当地医院经抗菌、抗病毒等药物治疗无效转入我院。
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1.2 方法
1.2.1 本组病例门诊常规角膜刮片，178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片检菌。
1.2.2 入院后，为统计角膜活检加178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片检菌的阳性率，所有患者行眼表面麻醉，在手术显微镜下，刮去角膜表面坏死组织后，用眼科显微手术刀切取病变明显处的少许角膜组织，立刻放在载玻片上，滴100g.L-1氢氧化钾1～2滴，盖上盖玻片，在10×40倍双目显微镜下观察。
1.2.3 角膜溃疡大、深、濒于穿孔者，为避免角膜活检时造成角膜穿孔，对这些患者我们则把角膜活检改在手术台上，即行穿透性角膜移植术时，切取病变角膜组织，立刻在手术台旁用178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片检菌，并以检菌结果来确定手术方式和术中用药。
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1.2.4 本组所有病人均行穿透性角膜移植术，术后病变角膜常规行组织病理学检查、PAS和HE染色。
2 结果
80例患者角膜组织中均找到真菌，实验室确诊为真菌性角膜溃疡。其中，门诊常规角膜刮片加178.2mmol*L-1氢氧化钾法，仅15例为真菌阳性，阳性率为18.5%.手术显微镜下角膜活检加178.2mmol*L-1氢氧化钾湿片法，78例找到真菌(其中手术台上角膜活检者13例)，阳性率为97.5%.77例患者组织病理检查、PAS染色找到真菌，占96%.有3例患者为角膜活检时找到真菌，而组织病理则为阴性。另有2例则是组织病理片上找到真菌，而活检为阴性。
3 讨论
真菌性角膜溃疡是一种致盲率很高的感染性角膜病，近年来由于抗生素和皮质类固醇药物的广泛应用，发病率明显提高。我院1995年6月～1996年12月对186例感染性角膜溃疡行穿透性角膜移植术，其中80例为真菌性角膜溃疡，占感染性角膜病的48%，是我院历年来真菌检出率最高的。这些患者绝大部分是已辗转多个医院治疗，病因不肯定，病情逐渐恶化者。虽然在我院行角膜活检后找到了真菌，得到正确的诊断，但却丧失了药物治疗的机会。有报道，对真菌性角膜炎的早期诊断、早期治疗，药物治愈率高达94%[6]。而因误诊、漏诊或诊断不及时，常可导致不同程度视力减退、失明，甚至丧失眼球。本组的80例真菌性角膜溃疡患者无1例被药物控制病情，全部行穿透性角膜移植术后炎症才被控制。真菌性角膜溃疡的早期诊断中，有一点要特别注意，对已确认为单疱病毒性角膜炎的患者，在用抗病毒药物联合皮质类固醇治疗期间，病情恶化者，要想到有真菌混合感染的存在，应及时做角膜活检加178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片检菌，以免延误治疗。真菌性角膜溃疡的早期准确诊断，与病人的预后有直接关系，而确认则必须在病变角膜及坏死组织中找到真菌。常用的方法有角膜刮片、角膜培养和角膜活检[1]。角膜刮片最为简便，阳性率为33%[3]，而本组仅为18.5%，角膜培养的阳性率较高，但需要较长的时间，且有假阳性。角膜活检，以往用作组织病理学检查，需要特殊染色，操作较复杂，检菌的阳性率与组织切片的位置有关，本组有3例角膜活检已找到真菌，而组织病理片上却是真菌阴性，这是因为角膜感染灶较小，经组织包埋后，未能切到病变组织，这3例我们又要求对剩下的角膜组织片继续连续切片，最后又重找到真菌。故寻找一种方便、快捷且阳性率高的诊断真菌性角膜溃疡的方法，实为临床所必需。角膜刮片阳性率低，主要原因为表浅角膜常为坏死组织覆盖，并无真菌[4]。因为真菌喜在角膜板层间生长，故取标本要注意真菌的生长特点，才易得到阳性结果[5]。我们的经验是在手术显微镜下，用钝性器械轻轻刮去角膜表面坏死组织，在角膜病变明显处用显微手术刀切取标本，这样避免了组织病理切除时的盲目性，在显微镜下操作可把对角膜的损伤减轻到最小程度，并获得高的阳性检菌率。
, 百拇医药
178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片法，是利用氢氧化钾溶解角膜或分泌物中的非真菌杂质，而显示菌丝，有报道同时加入亮绿或甲绿能增加对比度，缺点为易出现假阳性或假阴性。还有报道，356.4mmol.L-1氢氧化钾与400g.L-1二甲基亚砜(DM80)的混合液效果更佳，特别适用于角膜刮片中上皮细胞多而影响观察菌丝的情况[6]。本组病例全部采用178.2mmol.L-1氢氧化钾未加任何染色剂，角膜活检后立即镜检，因时间长，氢氧化钾易出现小的结晶，影响观察结果。如角膜片子较厚可在酒精灯上微微加热，促进杂质的融化，更易见菌。一般显微镜的光源要略暗些，增加背景与菌丝孢子的对比度。对于存在混合感染(单疱病毒或细菌感染)者，有时菌丝较少，在显微镜下要认真寻找，有条件可用高对比度的显微镜，本组2例在普通光学显微镜下未找到真菌，而在偏振光显微镜下，却找到少量的菌丝。对高度怀疑真菌患者，不要以一次湿片阴性而否定真菌感染。我们遇到5例患者，虽然角膜刮片、常规角膜活检湿片均未找到真菌，而在手术台上对角膜感染最严重处取材活检，找到了真菌。这说明取材是提高真菌性角膜溃疡诊断率的重要步骤。为提高镜检阳性率，我们在做角膜活检时均2人在场，并分别观察镜检结果。
, 百拇医药
从本组结果分析，角膜活检加178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片法，能对真菌性角膜溃疡做到快速、正确的诊断，且方法简便，不需特殊设备。对真菌性角膜溃疡的诊断，不仅为临床上早期选择用药提供依据，而且为指导选择手术方式、术中用药(对真菌性角膜溃疡前房积脓，在行穿透性角膜移植时，常用0.2g.L-1达扶康液冲洗)，术后治疗赢得了可贵的时间。但氢氧化钾湿片法最大的缺点是难以对真菌作出分类，影响了对抗真菌药物的选择。
Accepted for publication Jun 8,1998
From the Institute of Ophthalmology,Shandong Academy of Medical Science, Qingdao 266071, Shandong Province,China
, 百拇医药 参考文献
1 周祖嫌.霉菌性角膜炎.国外医学眼科学分册1991；15(1)∶23-27.
2 张月琴，丁行振，王丽娅，等.板层角膜移植治疗真菌性角膜溃疡适应症的探讨.眼科研究 1995；13(2)∶107-109.
3 孙秉基，徐锦堂主编.角膜病的理论基础与临床.北京：科学技术文献出版社 1994∶167.
4 O'Day DM，Ray WA,Robinson RD. Suspetibility of candida keratitis topical polyenes. Invest Ophthalmol Vis Sci 1998;28∶874-876.
5 张泺，赵长松，邱良秀，等.真菌性角膜炎的病理组织学实验研究.眼科研究 1985；3(2)∶95-97.
6 易先金.角膜真菌症的临床与实验研究.国外医学眼科学分册 1989；13(5)∶265-269.
收稿 1998-06-08 修回 1998-11-23, 百拇医药
单位：266071 山东省医学科学院眼科研究所
关键词：角膜溃疡；真菌感染；角膜活检
眼科新进展990205 摘要 目的 对角膜活检加178.2mmol.L-1(100g.L-1)氢氧化钾法诊断真菌性角膜溃疡的阳性率进行评价。 方法 对80例临床诊断真菌性角膜溃疡患者，在行穿透性角膜移植前，角膜刮片、角膜活检加178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片法和角膜移植术后组织病理学染色的结果进行比较。结果 角膜活检加178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片法诊断真菌性角膜溃疡阳性率为97.5%.结论 角膜活检加178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片法是一种快速、便捷、阳性率高的诊断真菌性角膜溃疡的方法。
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An improved method for diagnosis of fungal corneal ulcer
XIE Li-Xin, SHI Wei-Yun,LIU Jing,LI Shao-Wei,PAN Xiao-Gang,CHU Jian,YAO Zhan
Abstract Objective To evaluate the feasibility of corneal biopsy combined with 178.2mmol.L-1 potassium hydroxide slide in diagnosis of fungal corneal ulcer. Methods Corneal scraping and corneal biopsy with 178.2mmol.L-1 potassium hydroxide slide were used to examine 80 cases of fungal corneal ulcer before penetrating keratoplasty.Postoperatively,the pathological samples were stained with histopathological methods.The three results were analyzed and compared. Results The positive rate of corneal biopsy combined with 178.2mmol.L-1 potassium hydroxide slide was 97.5%.Conclusion Corneal biopsy with 178.2mmol.L-1 potassium hydroxide slide is a rapid and simple method with high positive rate in diagnosis of fungal corneal ulcer.
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Key words corneal ulcer/diagnosis;fungal infection corneal biopsy
作者简介 谢立信，教授、研究员。男，1942年12月出生，汉族，中共党员，山东莱州人。1965年毕业于山东医学院医疗系。1987年～1988年在美国路易斯安那州立大学眼科中心从事角膜病博士后研究工作。现任山东省科协副主席、山东省医学科学院副院长、眼科研究所所长、眼科医院院长等职，是青岛大学医学院博士生导师、北京医科大学兼职教授、博士生导师。兼任国家自然科学基金会学科评审委员、亚太地区角膜病学会理事、《中华眼科杂志》等国内8种眼科杂志编委等职。谢立信教授在角膜病应用基础研究、眼库技术和眼前节显微手术方面做了大量工作，取得了突出成就，在国内外眼科界具有较大影响。首先提出了供体角膜内皮细胞活性密度的新概念，改进了国际上供体角膜移植术后植片内皮细胞功能失代偿的标准，获国家科技进步二等奖。是我国开展现代小切口超声乳化白内障手术的先导；对儿童白内障手术有独到之处；在我国率先开展了MLK手术，随后又开展了PRK和LASIK手术。是我国眼库的创始人之一，现任中华眼库协会会长。联系电话：0532-5885195，5876380；传真：0532-5881212；
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E-mail:lixinxie@public.qd.sd.cn 对真菌性角膜溃疡的诊断，仅靠病史和临床表现是不够的，只有在病变角膜内检出真菌才能确诊[1]。以往常用角膜刮片加氢氧化钾湿片法，但阳性率不高[2]。角膜真菌培养需要时间较长。因此，目前对真菌性角膜溃疡的诊断缺少一种快速、准确的检查方法，常使患者延误治疗，有的甚至丧失眼球。我们对1995年6月～1996年12月临床诊断真菌性角膜溃疡患者，行病灶角膜活检、178.2mmol.L-1氢氧化钾湿化法检菌，取得良好结果，现报告如下。
1 对象与方法
1.1 对象 根据病史和临床表现诊断为真菌性角膜溃疡患者80例，其中农民72例，工人8例，其它2例。男50例，女30例，年龄21～71a，平均40.5a。病史3d～3mo不等。有明显植物和泥土外伤史者30例，单疱病毒性角膜炎长期使用皮质类固醇后病情恶化者10例，穿透性角膜移植术后不明原因植片溃疡者2例，其余患者无特殊诱因。90%患者在当地医院经抗菌、抗病毒等药物治疗无效转入我院。
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1.2 方法
1.2.1 本组病例门诊常规角膜刮片，178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片检菌。
1.2.2 入院后，为统计角膜活检加178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片检菌的阳性率，所有患者行眼表面麻醉，在手术显微镜下，刮去角膜表面坏死组织后，用眼科显微手术刀切取病变明显处的少许角膜组织，立刻放在载玻片上，滴100g.L-1氢氧化钾1～2滴，盖上盖玻片，在10×40倍双目显微镜下观察。
1.2.3 角膜溃疡大、深、濒于穿孔者，为避免角膜活检时造成角膜穿孔，对这些患者我们则把角膜活检改在手术台上，即行穿透性角膜移植术时，切取病变角膜组织，立刻在手术台旁用178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片检菌，并以检菌结果来确定手术方式和术中用药。
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1.2.4 本组所有病人均行穿透性角膜移植术，术后病变角膜常规行组织病理学检查、PAS和HE染色。
2 结果
80例患者角膜组织中均找到真菌，实验室确诊为真菌性角膜溃疡。其中，门诊常规角膜刮片加178.2mmol*L-1氢氧化钾法，仅15例为真菌阳性，阳性率为18.5%.手术显微镜下角膜活检加178.2mmol*L-1氢氧化钾湿片法，78例找到真菌(其中手术台上角膜活检者13例)，阳性率为97.5%.77例患者组织病理检查、PAS染色找到真菌，占96%.有3例患者为角膜活检时找到真菌，而组织病理则为阴性。另有2例则是组织病理片上找到真菌，而活检为阴性。
3 讨论
真菌性角膜溃疡是一种致盲率很高的感染性角膜病，近年来由于抗生素和皮质类固醇药物的广泛应用，发病率明显提高。我院1995年6月～1996年12月对186例感染性角膜溃疡行穿透性角膜移植术，其中80例为真菌性角膜溃疡，占感染性角膜病的48%，是我院历年来真菌检出率最高的。这些患者绝大部分是已辗转多个医院治疗，病因不肯定，病情逐渐恶化者。虽然在我院行角膜活检后找到了真菌，得到正确的诊断，但却丧失了药物治疗的机会。有报道，对真菌性角膜炎的早期诊断、早期治疗，药物治愈率高达94%[6]。而因误诊、漏诊或诊断不及时，常可导致不同程度视力减退、失明，甚至丧失眼球。本组的80例真菌性角膜溃疡患者无1例被药物控制病情，全部行穿透性角膜移植术后炎症才被控制。真菌性角膜溃疡的早期诊断中，有一点要特别注意，对已确认为单疱病毒性角膜炎的患者，在用抗病毒药物联合皮质类固醇治疗期间，病情恶化者，要想到有真菌混合感染的存在，应及时做角膜活检加178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片检菌，以免延误治疗。真菌性角膜溃疡的早期准确诊断，与病人的预后有直接关系，而确认则必须在病变角膜及坏死组织中找到真菌。常用的方法有角膜刮片、角膜培养和角膜活检[1]。角膜刮片最为简便，阳性率为33%[3]，而本组仅为18.5%，角膜培养的阳性率较高，但需要较长的时间，且有假阳性。角膜活检，以往用作组织病理学检查，需要特殊染色，操作较复杂，检菌的阳性率与组织切片的位置有关，本组有3例角膜活检已找到真菌，而组织病理片上却是真菌阴性，这是因为角膜感染灶较小，经组织包埋后，未能切到病变组织，这3例我们又要求对剩下的角膜组织片继续连续切片，最后又重找到真菌。故寻找一种方便、快捷且阳性率高的诊断真菌性角膜溃疡的方法，实为临床所必需。角膜刮片阳性率低，主要原因为表浅角膜常为坏死组织覆盖，并无真菌[4]。因为真菌喜在角膜板层间生长，故取标本要注意真菌的生长特点，才易得到阳性结果[5]。我们的经验是在手术显微镜下，用钝性器械轻轻刮去角膜表面坏死组织，在角膜病变明显处用显微手术刀切取标本，这样避免了组织病理切除时的盲目性，在显微镜下操作可把对角膜的损伤减轻到最小程度，并获得高的阳性检菌率。
, 百拇医药
178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片法，是利用氢氧化钾溶解角膜或分泌物中的非真菌杂质，而显示菌丝，有报道同时加入亮绿或甲绿能增加对比度，缺点为易出现假阳性或假阴性。还有报道，356.4mmol.L-1氢氧化钾与400g.L-1二甲基亚砜(DM80)的混合液效果更佳，特别适用于角膜刮片中上皮细胞多而影响观察菌丝的情况[6]。本组病例全部采用178.2mmol.L-1氢氧化钾未加任何染色剂，角膜活检后立即镜检，因时间长，氢氧化钾易出现小的结晶，影响观察结果。如角膜片子较厚可在酒精灯上微微加热，促进杂质的融化，更易见菌。一般显微镜的光源要略暗些，增加背景与菌丝孢子的对比度。对于存在混合感染(单疱病毒或细菌感染)者，有时菌丝较少，在显微镜下要认真寻找，有条件可用高对比度的显微镜，本组2例在普通光学显微镜下未找到真菌，而在偏振光显微镜下，却找到少量的菌丝。对高度怀疑真菌患者，不要以一次湿片阴性而否定真菌感染。我们遇到5例患者，虽然角膜刮片、常规角膜活检湿片均未找到真菌，而在手术台上对角膜感染最严重处取材活检，找到了真菌。这说明取材是提高真菌性角膜溃疡诊断率的重要步骤。为提高镜检阳性率，我们在做角膜活检时均2人在场，并分别观察镜检结果。
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从本组结果分析，角膜活检加178.2mmol.L-1氢氧化钾湿片法，能对真菌性角膜溃疡做到快速、正确的诊断，且方法简便，不需特殊设备。对真菌性角膜溃疡的诊断，不仅为临床上早期选择用药提供依据，而且为指导选择手术方式、术中用药(对真菌性角膜溃疡前房积脓，在行穿透性角膜移植时，常用0.2g.L-1达扶康液冲洗)，术后治疗赢得了可贵的时间。但氢氧化钾湿片法最大的缺点是难以对真菌作出分类，影响了对抗真菌药物的选择。
Accepted for publication Jun 8,1998
From the Institute of Ophthalmology,Shandong Academy of Medical Science, Qingdao 266071, Shandong Province,China
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1 周祖嫌.霉菌性角膜炎.国外医学眼科学分册1991；15(1)∶23-27.
2 张月琴，丁行振，王丽娅，等.板层角膜移植治疗真菌性角膜溃疡适应症的探讨.眼科研究 1995；13(2)∶107-109.
3 孙秉基，徐锦堂主编.角膜病的理论基础与临床.北京：科学技术文献出版社 1994∶167.
4 O'Day DM，Ray WA,Robinson RD. Suspetibility of candida keratitis topical polyenes. Invest Ophthalmol Vis Sci 1998;28∶874-876.
5 张泺，赵长松，邱良秀，等.真菌性角膜炎的病理组织学实验研究.眼科研究 1985；3(2)∶95-97.
6 易先金.角膜真菌症的临床与实验研究.国外医学眼科学分册 1989；13(5)∶265-269.
收稿 1998-06-08 修回 1998-11-23, 百拇医药