同一猴、兔眼角膜细胞成分原代培养的实验研究△
作者：钟一声 陈 王康孙 石海云
单位：作者单位：200025 上海第二医科大学附属瑞金医院眼科中心(钟一声，王康孙，石海云)；453000 河南省新乡市中心医院眼科(陈 )
关键词：角膜；内皮细胞；细胞培养；猴；兔
同一猴
摘要 目的 建立从同一角膜片上分离培养角膜上皮、基质和内皮细胞的方法，为研究角膜细胞间的相互作用机制奠定基础。方法 采用消化法分离培养猴眼角膜内皮细胞、上皮细胞和兔眼角膜上皮细胞，组织块培养法培养基质成纤维细胞和兔角膜内皮细胞。细胞接种于12孔培养板，并于培养不同时间行Wright染色检查细胞生长情况。结果 采用消化法和组织块培养法能成功地培养猴、兔角膜上皮、基质和内皮细胞。猴、兔角膜内皮细胞培养1wk后，均能形成内皮细胞单层，细胞类似天然的六角形态，且以猴内皮细胞明显；猴角膜上皮细胞培养3～4d生长旺盛，但难以形成细胞单层，兔上皮细胞生长旺盛，1wk后已达融合状态，细胞呈膜状伸出板层伪足；猴、兔基质成纤维细胞易培养，1wk后已融合成单层细胞，细胞排列整齐，类似纤维走行样外观。结论 从同一角膜材料中能分别培养出角膜3种细胞成份，消化法和组织块培养法相结合既能节省材料，又简单易行。
, 百拇医药
Laboratory study of the cornea cell primary culture from the same corneas of monkeys and rabbits
ZHONG Yi-Sheng ,CHEN Yu,WANG Kang-Sun , SHI Hai-Yun
Abstract Objective To establish the culture technique for corneal epithelial cells, keratocytes and endothelial cells from the same corneal material,and to lay a foundation for studying the interaction mechanism among cornea cells. Methods The corneal endothelial cells,epithelial cells for monkeys and corneal epithelial cells for rabbits were cultured by using digestion methods.The keratocytes and endothelial cells for rabbits were cultured by tissue culture methods. All cells and small tissues were planted in 12-well culture plate and the culture cells morphological characteristics were observed by Wright staining during the various time periods. Results The corneal epithelial cells,keratocytes and endothelial cells from the same cornea could all be cultured successfully. In one week after the culture, the endothelial cells for monkeys and rabbits formed an adherent and confluent monolayer, and the hexagon cells were the same as in vivo. The epithelial cells for monkeys grew very well at the 3rd or 4th day culture , but it did not form confluent monolayer. The epithelial cells for rabbits could form a confluent monolayer and the cells possessed a flattened lamellipodia. The keratocytes for monkeys and rabbits could be cultured easily and formed a monolayer and had a fibriform arrangement in one week after the culture. Conclusion Three kinds of cells from the same cornea can all be cultured successfully. The culture technique is practicable and simple
, http://www.100md.com
Key words cornea;endothelial cell;cell culture; monkey; rabbit
作者简介 钟一声，男，1968年1月生，湖北崇阳县人，汉族。1991年毕业于湖北医学院五官系。1991～1994年兰州医学院攻读眼科硕士学位研究生，导师李浒源教授和金婉容教授，获医学硕士学位；1994年～1997年在湖南医科大学攻读临床技能型眼科博士研究生，师从著名眼科学家蒋幼芹教授，获临床医学博士学位。1997年考入上海第二医科大学临床医学博士后流动站学习，师从著名眼科学家王康孙教授。现为上海瑞金医院眼科主治医师。先后从事白内障、青光眼和屈光性角膜手术的基础和临床研究。在《中国实用眼科杂志》、《眼科研究》、《眼科新进展》、《国外医学眼科学分册》、《美国医学会眼科杂志中文版》、《中国激光医学杂志》等期刊上发表论文、综述及译文近15篇。
, 百拇医药
角膜细胞成分培养为现代角膜病基础和临床研究的重要方法之一，尤以角膜内皮细胞培养更为重要。它已被广泛应用于角膜病理生理学、药理毒理学、免疫学、角膜内皮、上皮细胞移植以及分子生物学的研究[1～3]。以往角膜细胞培养方法均为在同一角膜片上仅获单一角膜细胞成分的培养，这不利于节省材料，也不便于研究同一个体角膜细胞成分间的相互作用。近年来，随着研究的深入，对角膜细胞成分的培养提出了更高要求。我们在进行角膜分子生物学研究过程中，探索了一种以同一角膜为材料分别培养角膜上皮、基质和内皮细胞的方法，现将其培养方法和细胞形态学观察结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 细胞培养液的制备
1.1.1 上皮细胞和内皮细胞培养液 采用DMEM/F12=1∶1的混合液(Gibco,USA)，内含10mmol.L-1HEPES、200mL.L-1胎牛血清(Gibco,USA)，100×103U.L-1青霉素、100mg.L-1链霉素、2.5mg.L-1二性霉素B，pH值7.2～7.4。
, 百拇医药
1.1.2 基质成纤维细胞培养液 采用DMEM(Gibco,USA)，内含100mL.L-1胎牛血清(Gibco,USA)、10mmol.L-1HEPES、100×103U.L-1青霉素、100mg.L-1链霉素、2.5mg.L-1二性霉素B，pH值7.2～7.4。
1.2 猴、兔角膜制备 3只体重约6～8kg的成年猴(雌雄不限，年龄8～11a)，共6眼，2只体重约2.5～3kg白色家兔(雌雄不限)，共4眼。猴采用肌注盐酸氯胺酮100mg.kg-1全身麻醉，兔采用戊巴比妥钠60mg.kg-1耳缘静脉麻醉。无菌下摘出眼球，生理盐水冲洗2～3次后，在超净工作台上沿角膜缘取下完整角膜(不含角巩膜缘)，放入含100×103U.L-1青霉素和100mg.L-1链霉素的D-PBS液漂洗2～3次，待用。
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1.3 角膜内皮细胞培养
1.3.1 猴角膜内皮细胞培养 在培养皿中滴2～3滴DMEM培养液(不含血清)，将角膜片内皮面朝上置于培养液上，加入1～2滴2.5g.L-1胰蛋白酶和2.5g.L-1EDTA混合液于角膜内皮杯中，注意不将液体溢出凹面，置37℃培养箱中5min，取出角膜片，加1滴胎牛血清终止消化。注射器抽取DMEM培养液，轻轻冲洗内皮面，将冲洗液离心5～6min(1000r.min-1)，弃上清，按每角膜4mL比例加入内皮细胞培养液，吹打混匀。血细胞计数板计数，制成150×106～200×106个.L-1细胞悬液，以每孔2mL将内皮细胞接种于12孔培养板中，置37℃、50mL.L-1CO2和950mL.L-1空气培养箱中培养，培养液1wk更换2～3次。
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1.3.2 兔角膜内皮细胞培养 在超净工作台内，体视显微镜下用显微无齿镊撕下内皮层和Descemet膜，每眼约7～8块。将每眼撕下的组织块内皮面朝上贴于12孔培养板的一孔中，置37℃培养箱干燥10～15min后，加入内皮细胞培养液，继续置37℃、50mL.L-1CO2和950mL.L-1空气培养箱中培养，培养液每1wk更换2～3次。
1.4 角膜上皮细胞培养 于培养皿中滴1.25g.L-1胰蛋白酶和1.25g.L-1EDTA混合液3～4滴，将上述处理过的猴、兔眼角膜上皮面朝下置于混合消化液上，置37℃培养箱中消化25～30min后，加1～2滴胎牛血清终止消化。翻转角膜片，注射器抽取DMEM培养液轻轻冲洗上皮面，将冲洗液离心5～6min(1000r.min-1)，弃上清，按每角膜4mL比例加入上皮细胞培养液，吹打混匀。血细胞计数板计数，制成150×106～200×106个L-1细胞悬液，以每孔2mL将上皮细胞接种于12孔培养板中，置37℃、50mL.L-1CO2和950mL.L-1空气培养箱中培养，培养液1wk更换2～3次。
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1.5 角膜成纤维细胞培养 将上述处理过的猴、兔眼角膜片置于培养皿中，用4号圆刀片分别刮除上皮面和内皮面，以去除未冲洗干净的上皮和内皮细胞，置D-PBS中漂洗2次。用眼科剪分别将角膜基质剪成大约1mm×2mm组织块，接种于12孔培养板，每孔接种10～12块，置37℃培养箱中干燥约45min后，轻轻加入基质细胞培养液每孔2mL。置37℃、50mL.L-1CO2和950mL.L-1空气培养箱中培养，培养液1wk更换2～3次。
1.6 观察方法 细胞接种后6、12、24h，以后每日用倒置显微镜观察活细胞生长情况，并在不同时间将部分培养细胞用40g.L-1多聚甲醛固定，Wright染色，光学显微镜下观察细胞形态特点，柯达彩色胶卷摄影记录。
2 结果
, 百拇医药
2.1 猴眼角膜细胞培养结果
2.1.1 上皮细胞培养 上皮细胞培养12h后，部分细胞开始贴壁生长，贴壁细胞呈圆形或不规则形，细胞核位于细胞中央，呈圆形或椭圆形，且相对透明。培养d3～d4，贴壁细胞增多且生长旺盛，细胞体积增大，胞浆丰富，呈膜状的多角形或不规则形生长，但细胞难以形成单层(见图1)。培养5～7d后，部分原来贴壁的细胞开始脱落死亡，细胞数目减少。如不再有继续贴壁的细胞，原贴壁细胞会逐渐脱落消失。
Figour1 Epithelial cells of monkey after 4 days in culture.The cells grews like momberanous(Wright 40x)培养4d猴角膜上皮细胞,细胞呈膜状生长.
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2.1.2 基质成纤维细胞培养 角膜基质组织块贴壁培养48h后，可见部分组织块边缘长出少量基质成纤维细胞，呈纺垂形且生长旺盛。尔后，从组织块长出的细胞越来越多，且原来贴壁的细胞分裂增殖向周围延伸。培养1wk时，细胞已达基本融合状态，适宜传代培养(见图2)。如继续原代培养，细胞生长可达密集状态，且排列整齐，培养14d后，已形成完整密集的单层细胞，细胞排列非常整齐，细胞间隙难以分清，低倍镜下呈纤维走行排列样外观。
Figour2 Keratocytes of monkey after 7 days in culture.The cells almost fomred
confuluent monolayer(Wright 20x)
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培养7d猴角膜基质呈纤维细胞,细胞已达基本融合状态长.
2.1.3 角膜内皮细胞培养 经消化法获得的内皮细胞培养24h后，细胞全部呈片状贴壁生长，刚贴壁的细胞呈多角形或梭形且相对透明，细胞生长非常旺盛，尤以周边的细胞最明显。培养1wk时，细胞形态逐渐转为类似天然的六角形，以中央最为明显，周边细胞仍呈圆形或不规则形，且细胞增殖分裂旺盛。继续培养时，细胞形态更似六角形，培养2wk后，细胞完全形成类似天然的六角形细胞单层(见图3)。
Figour3 Endothelial cells of monkey after 14 days in culture.The cells possessed
, 百拇医药 hexagon and showed mosaic arrangement (Wright 40x)
培养24d猴角膜内皮细胞,细胞呈六角形.嵌合成单层
2.2 兔眼角膜细胞培养结果
2.2.1 上皮细胞培养 兔角膜上皮细胞培养6h可见细胞贴壁生长，细胞呈圆形或多角形。上皮细胞分裂生长速度快，培养4d后，部分上皮细胞呈膜状生长，且伸出板层伪足，细胞核相对较小，呈圆形位于细胞周边。培养1wk时，上皮细胞分裂增殖旺盛，全部呈膜状生长，伸出板层伪足，且细胞已达基本融合状态，部分细胞伸出较长的、与邻近细胞相连的板层伪足(见图4)。此时适宜于传代培养。
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Figour4 Epithelial cells of rabbit after 7 days in culture.The cells possessed
axopodium and lamellipodia(Wright 20x)
培养7d兔角膜上皮细胞,细胞伸出膜状伪足.
2.2.2 基质成纤维细胞培养 兔角膜基质贴壁培养24h后，可见组织块边缘长出少量成纤维细胞，细胞呈纺锤形且相对透明。尔后，从组织块长出的细胞越来越多，且原来贴壁的细胞分裂增殖向周围延伸。培养1wk时，细胞已达基本融合状态，细胞呈梭形，排列较整齐(见图5)。此时适宜于传代培养，若继续原代培养，则形成形似纤维走行排列的细胞单层。
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Figour5 Keratocytes of rabbit after 7 days in culture.The cells almost fomred
confuluent monolayer(Wright 40x)
培养7d图角膜基质呈纤维细胞,细胞已达融合状态长.
2.2.3 内皮细胞培养 内皮组织块贴壁培养48h后，可见组织块边缘长出少数圆形或多角形内皮细胞，且相对透明。尔后，从组织块长出的细胞越来越多，且原来贴壁的细胞分裂增殖向周围延伸，细胞呈椭圆形或多角形，且互相嵌合。培养1wk后，可见内皮细胞互相嵌合成大片状，细胞仍呈椭圆形或多角形(见图6)。继续培养后，则形成密集的内皮细胞单层。
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Figour3 Endothelial cells of rabbir after 7 days in culture.The cells were ellipic
or polymorphous (Wright 20x)
培养7d兔角膜内皮细胞,细胞呈椭圆形.或多角形.
3 讨论
角膜细胞的培养技术在国内外早已有报告，且不断地改进培养方法[1～8]，但以往的培养技术存在从同一角膜中取材单一的问题，这不仅浪费角膜原材料，也不便于同一个体角膜细胞成分间相互作用的研究。因此寻求一种取材简单、经济实用的培养方法，对角膜病许多基础研究仍具有重要意义。我们通过对同一猴、兔眼分别进行角膜3种细胞的培养，得出如下体会。
3.1 同一角膜材料分离角膜细胞成分的有效顺序是获得单纯角膜细胞成分培养的前提和保障。由于角膜的解剖特点，我们认为依次分离角膜内皮细胞、上皮细胞和基质成纤维细胞是较理想的分离方法。角膜内皮凹陷杯易于加入消化液进行消化。对猴角膜内皮细胞的消化，以2.5g.L-1Trypsin和2.5g.L-1EDTA混合液消化5min效果最佳，它既可以使内皮细胞间及内皮细胞和Descemet膜间的连接松动，易于冲洗脱落成单个细胞，同时消化时间短，不影响上皮细胞和成纤维细胞的取材。另外在消化内皮细胞过程中，采用培养液浸泡角膜上皮面，更加保证了上皮细胞的活性。兔眼角膜片较软，放置时不易形成内皮杯，故我们没有选择消化获得内皮细胞的方法，但由于兔眼Descemet膜与基质连接较疏松，易于分离剥脱，采用内皮层和Descemet膜组织块培养亦易于获得单纯内皮细胞的培养。对角膜上皮细胞的消化，采用1.25g.L-1Trypsin和1.25g.L-1EDTA混合液消化25～30min效果较为理想。浓度太低，细胞不易冲洗脱落，浓度太高，易于损伤上皮细胞；同时消化时间不宜过长，以免影响基质细胞的活性。在基质块取材之前，采用刀片刮除上皮面和内皮面，去除残存的上皮、内皮细胞，保证了培养基质细胞的单纯性。
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3.2 采用消化法获得猴内皮细胞培养24h出现成片贴壁生长，从而缩短了达到生长密集状态的时间，同时也没有组织块培养所见组织块边缘细胞相对较密的现象，细胞培养1～2wk后，形成类似天然的六角细胞单层，更便于角膜内皮细胞的进一步研究。
3.3 采用消化法能获得大量的角膜上皮细胞，但本实验猴眼角膜上皮细胞培养难以达到生长密集状态，我们认为这与取材方法无关，因为同样的方法获得的兔角膜上皮细胞培养分裂增殖旺盛，呈典型的膜状上皮细胞生长。培养猴角膜上皮细胞生长较差，可能是由于物种不同，细胞贴壁生长的营养要求不同之故，如对培养物品进行处理或加入表皮生长因子和胰岛素等促进其生长[2,8,9]。
3.4 角膜基质细胞的培养不需消化，便易形成单层。采用锐利的剪刀剪切组织块，易于细胞长出，同时组织块干燥45min易于组织块较好地贴于培养板上，避免了因干燥时间过长而影响基质细胞的活性。
, 百拇医药 我们进行猴、兔角膜细胞的原代培养，目的是为了获得更多的角膜细胞，便于进行分子生物学研究，以了解临床上角膜伤口愈合过程中的分子生物学基础，为防治角膜术后并发症的研究奠定基础。
致谢：本研究得到本院皮肤科郑捷教授的支持，特此致谢!
△ 上海市科学技术发展基金项目(批准号：974119039)
Accepted for publication Apr 27,1998
From the Ophthalmic Center,Ruijin Hospital(ZHONG Yi-Sheng,WANG Kang-Sun,SHI Hai-Yun)，Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025,China;Xinxiang Central Hospital(CHEN Yu),Xinxiang 453000,Henan Province,China
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参考文献
1 谢立信，董晓光，张德茹，等.人角膜细胞的原代培养实验研究.中华眼科杂志1991；27∶13-15.
2 张泺，赵小抗.角膜上皮细胞体外培养中胶原基质的研究.中华眼科杂志1991；27∶16-18.
3 龚向明，林宁，谢全锦,等.庆大霉素对角膜内皮的影响-组织培养实验研究.眼科研究1989；7∶204-206.
4 Yue BY,Baum JL.Studies of corneas in vivo and in vitro.Vision Res 1981;21∶41.
5 Fabricant RN,Alpar AJ,Centifanto YA,et al.Epidermal growth factor receptors on corneal endothelium.Arch Ophthalmol 1981;99∶305-308.
, http://www.100md.com
6 Nakagawa S,Nishida T,Kodama Y,et al.Spreading of cultured corneal epithelial cells on fibronectin and other extracellular matrics.Cornea 1990;9∶125-130.
7 Hongo M,Itoi M,Yamaguchi N,et al.Distribution of epidermal growth factor(EGF)receptors in rabbit corneal epithelial cells,keratocytes and endothelial cells,and the changes induced by transforming growth factor-β1.Exp Eye Res 1992;54∶9-16.
8 潘志强，奚寿增，林月芳.人角膜上皮细胞体外培养的生长曲线及几种抗生素的影响.眼科研究1997；15∶149-151.
9 Li DQ,Tseng SCG.Three patterns of cytokine expression potentially involved in epithelial-fibroblast interaction of human ocular surface.J Cell Physiol 1995;163∶61-79.
收稿 1998-04-27 修回 1998-08-10, 百拇医药
单位：作者单位：200025 上海第二医科大学附属瑞金医院眼科中心(钟一声，王康孙，石海云)；453000 河南省新乡市中心医院眼科(陈 )
关键词：角膜；内皮细胞；细胞培养；猴；兔
同一猴
摘要 目的 建立从同一角膜片上分离培养角膜上皮、基质和内皮细胞的方法，为研究角膜细胞间的相互作用机制奠定基础。方法 采用消化法分离培养猴眼角膜内皮细胞、上皮细胞和兔眼角膜上皮细胞，组织块培养法培养基质成纤维细胞和兔角膜内皮细胞。细胞接种于12孔培养板，并于培养不同时间行Wright染色检查细胞生长情况。结果 采用消化法和组织块培养法能成功地培养猴、兔角膜上皮、基质和内皮细胞。猴、兔角膜内皮细胞培养1wk后，均能形成内皮细胞单层，细胞类似天然的六角形态，且以猴内皮细胞明显；猴角膜上皮细胞培养3～4d生长旺盛，但难以形成细胞单层，兔上皮细胞生长旺盛，1wk后已达融合状态，细胞呈膜状伸出板层伪足；猴、兔基质成纤维细胞易培养，1wk后已融合成单层细胞，细胞排列整齐，类似纤维走行样外观。结论 从同一角膜材料中能分别培养出角膜3种细胞成份，消化法和组织块培养法相结合既能节省材料，又简单易行。
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Laboratory study of the cornea cell primary culture from the same corneas of monkeys and rabbits
ZHONG Yi-Sheng ,CHEN Yu,WANG Kang-Sun , SHI Hai-Yun
Abstract Objective To establish the culture technique for corneal epithelial cells, keratocytes and endothelial cells from the same corneal material,and to lay a foundation for studying the interaction mechanism among cornea cells. Methods The corneal endothelial cells,epithelial cells for monkeys and corneal epithelial cells for rabbits were cultured by using digestion methods.The keratocytes and endothelial cells for rabbits were cultured by tissue culture methods. All cells and small tissues were planted in 12-well culture plate and the culture cells morphological characteristics were observed by Wright staining during the various time periods. Results The corneal epithelial cells,keratocytes and endothelial cells from the same cornea could all be cultured successfully. In one week after the culture, the endothelial cells for monkeys and rabbits formed an adherent and confluent monolayer, and the hexagon cells were the same as in vivo. The epithelial cells for monkeys grew very well at the 3rd or 4th day culture , but it did not form confluent monolayer. The epithelial cells for rabbits could form a confluent monolayer and the cells possessed a flattened lamellipodia. The keratocytes for monkeys and rabbits could be cultured easily and formed a monolayer and had a fibriform arrangement in one week after the culture. Conclusion Three kinds of cells from the same cornea can all be cultured successfully. The culture technique is practicable and simple
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Key words cornea;endothelial cell;cell culture; monkey; rabbit
作者简介 钟一声，男，1968年1月生，湖北崇阳县人，汉族。1991年毕业于湖北医学院五官系。1991～1994年兰州医学院攻读眼科硕士学位研究生，导师李浒源教授和金婉容教授，获医学硕士学位；1994年～1997年在湖南医科大学攻读临床技能型眼科博士研究生，师从著名眼科学家蒋幼芹教授，获临床医学博士学位。1997年考入上海第二医科大学临床医学博士后流动站学习，师从著名眼科学家王康孙教授。现为上海瑞金医院眼科主治医师。先后从事白内障、青光眼和屈光性角膜手术的基础和临床研究。在《中国实用眼科杂志》、《眼科研究》、《眼科新进展》、《国外医学眼科学分册》、《美国医学会眼科杂志中文版》、《中国激光医学杂志》等期刊上发表论文、综述及译文近15篇。
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角膜细胞成分培养为现代角膜病基础和临床研究的重要方法之一，尤以角膜内皮细胞培养更为重要。它已被广泛应用于角膜病理生理学、药理毒理学、免疫学、角膜内皮、上皮细胞移植以及分子生物学的研究[1～3]。以往角膜细胞培养方法均为在同一角膜片上仅获单一角膜细胞成分的培养，这不利于节省材料，也不便于研究同一个体角膜细胞成分间的相互作用。近年来，随着研究的深入，对角膜细胞成分的培养提出了更高要求。我们在进行角膜分子生物学研究过程中，探索了一种以同一角膜为材料分别培养角膜上皮、基质和内皮细胞的方法，现将其培养方法和细胞形态学观察结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 细胞培养液的制备
1.1.1 上皮细胞和内皮细胞培养液 采用DMEM/F12=1∶1的混合液(Gibco,USA)，内含10mmol.L-1HEPES、200mL.L-1胎牛血清(Gibco,USA)，100×103U.L-1青霉素、100mg.L-1链霉素、2.5mg.L-1二性霉素B，pH值7.2～7.4。
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1.1.2 基质成纤维细胞培养液 采用DMEM(Gibco,USA)，内含100mL.L-1胎牛血清(Gibco,USA)、10mmol.L-1HEPES、100×103U.L-1青霉素、100mg.L-1链霉素、2.5mg.L-1二性霉素B，pH值7.2～7.4。
1.2 猴、兔角膜制备 3只体重约6～8kg的成年猴(雌雄不限，年龄8～11a)，共6眼，2只体重约2.5～3kg白色家兔(雌雄不限)，共4眼。猴采用肌注盐酸氯胺酮100mg.kg-1全身麻醉，兔采用戊巴比妥钠60mg.kg-1耳缘静脉麻醉。无菌下摘出眼球，生理盐水冲洗2～3次后，在超净工作台上沿角膜缘取下完整角膜(不含角巩膜缘)，放入含100×103U.L-1青霉素和100mg.L-1链霉素的D-PBS液漂洗2～3次，待用。
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1.3 角膜内皮细胞培养
1.3.1 猴角膜内皮细胞培养 在培养皿中滴2～3滴DMEM培养液(不含血清)，将角膜片内皮面朝上置于培养液上，加入1～2滴2.5g.L-1胰蛋白酶和2.5g.L-1EDTA混合液于角膜内皮杯中，注意不将液体溢出凹面，置37℃培养箱中5min，取出角膜片，加1滴胎牛血清终止消化。注射器抽取DMEM培养液，轻轻冲洗内皮面，将冲洗液离心5～6min(1000r.min-1)，弃上清，按每角膜4mL比例加入内皮细胞培养液，吹打混匀。血细胞计数板计数，制成150×106～200×106个.L-1细胞悬液，以每孔2mL将内皮细胞接种于12孔培养板中，置37℃、50mL.L-1CO2和950mL.L-1空气培养箱中培养，培养液1wk更换2～3次。
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1.3.2 兔角膜内皮细胞培养 在超净工作台内，体视显微镜下用显微无齿镊撕下内皮层和Descemet膜，每眼约7～8块。将每眼撕下的组织块内皮面朝上贴于12孔培养板的一孔中，置37℃培养箱干燥10～15min后，加入内皮细胞培养液，继续置37℃、50mL.L-1CO2和950mL.L-1空气培养箱中培养，培养液每1wk更换2～3次。
1.4 角膜上皮细胞培养 于培养皿中滴1.25g.L-1胰蛋白酶和1.25g.L-1EDTA混合液3～4滴，将上述处理过的猴、兔眼角膜上皮面朝下置于混合消化液上，置37℃培养箱中消化25～30min后，加1～2滴胎牛血清终止消化。翻转角膜片，注射器抽取DMEM培养液轻轻冲洗上皮面，将冲洗液离心5～6min(1000r.min-1)，弃上清，按每角膜4mL比例加入上皮细胞培养液，吹打混匀。血细胞计数板计数，制成150×106～200×106个L-1细胞悬液，以每孔2mL将上皮细胞接种于12孔培养板中，置37℃、50mL.L-1CO2和950mL.L-1空气培养箱中培养，培养液1wk更换2～3次。
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1.5 角膜成纤维细胞培养 将上述处理过的猴、兔眼角膜片置于培养皿中，用4号圆刀片分别刮除上皮面和内皮面，以去除未冲洗干净的上皮和内皮细胞，置D-PBS中漂洗2次。用眼科剪分别将角膜基质剪成大约1mm×2mm组织块，接种于12孔培养板，每孔接种10～12块，置37℃培养箱中干燥约45min后，轻轻加入基质细胞培养液每孔2mL。置37℃、50mL.L-1CO2和950mL.L-1空气培养箱中培养，培养液1wk更换2～3次。
1.6 观察方法 细胞接种后6、12、24h，以后每日用倒置显微镜观察活细胞生长情况，并在不同时间将部分培养细胞用40g.L-1多聚甲醛固定，Wright染色，光学显微镜下观察细胞形态特点，柯达彩色胶卷摄影记录。
2 结果
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2.1 猴眼角膜细胞培养结果
2.1.1 上皮细胞培养 上皮细胞培养12h后，部分细胞开始贴壁生长，贴壁细胞呈圆形或不规则形，细胞核位于细胞中央，呈圆形或椭圆形，且相对透明。培养d3～d4，贴壁细胞增多且生长旺盛，细胞体积增大，胞浆丰富，呈膜状的多角形或不规则形生长，但细胞难以形成单层(见图1)。培养5～7d后，部分原来贴壁的细胞开始脱落死亡，细胞数目减少。如不再有继续贴壁的细胞，原贴壁细胞会逐渐脱落消失。
Figour1 Epithelial cells of monkey after 4 days in culture.The cells grews like momberanous(Wright 40x)培养4d猴角膜上皮细胞,细胞呈膜状生长.
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2.1.2 基质成纤维细胞培养 角膜基质组织块贴壁培养48h后，可见部分组织块边缘长出少量基质成纤维细胞，呈纺垂形且生长旺盛。尔后，从组织块长出的细胞越来越多，且原来贴壁的细胞分裂增殖向周围延伸。培养1wk时，细胞已达基本融合状态，适宜传代培养(见图2)。如继续原代培养，细胞生长可达密集状态，且排列整齐，培养14d后，已形成完整密集的单层细胞，细胞排列非常整齐，细胞间隙难以分清，低倍镜下呈纤维走行排列样外观。
Figour2 Keratocytes of monkey after 7 days in culture.The cells almost fomred
confuluent monolayer(Wright 20x)
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培养7d猴角膜基质呈纤维细胞,细胞已达基本融合状态长.
2.1.3 角膜内皮细胞培养 经消化法获得的内皮细胞培养24h后，细胞全部呈片状贴壁生长，刚贴壁的细胞呈多角形或梭形且相对透明，细胞生长非常旺盛，尤以周边的细胞最明显。培养1wk时，细胞形态逐渐转为类似天然的六角形，以中央最为明显，周边细胞仍呈圆形或不规则形，且细胞增殖分裂旺盛。继续培养时，细胞形态更似六角形，培养2wk后，细胞完全形成类似天然的六角形细胞单层(见图3)。
Figour3 Endothelial cells of monkey after 14 days in culture.The cells possessed
, 百拇医药 hexagon and showed mosaic arrangement (Wright 40x)
培养24d猴角膜内皮细胞,细胞呈六角形.嵌合成单层
2.2 兔眼角膜细胞培养结果
2.2.1 上皮细胞培养 兔角膜上皮细胞培养6h可见细胞贴壁生长，细胞呈圆形或多角形。上皮细胞分裂生长速度快，培养4d后，部分上皮细胞呈膜状生长，且伸出板层伪足，细胞核相对较小，呈圆形位于细胞周边。培养1wk时，上皮细胞分裂增殖旺盛，全部呈膜状生长，伸出板层伪足，且细胞已达基本融合状态，部分细胞伸出较长的、与邻近细胞相连的板层伪足(见图4)。此时适宜于传代培养。
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Figour4 Epithelial cells of rabbit after 7 days in culture.The cells possessed
axopodium and lamellipodia(Wright 20x)
培养7d兔角膜上皮细胞,细胞伸出膜状伪足.
2.2.2 基质成纤维细胞培养 兔角膜基质贴壁培养24h后，可见组织块边缘长出少量成纤维细胞，细胞呈纺锤形且相对透明。尔后，从组织块长出的细胞越来越多，且原来贴壁的细胞分裂增殖向周围延伸。培养1wk时，细胞已达基本融合状态，细胞呈梭形，排列较整齐(见图5)。此时适宜于传代培养，若继续原代培养，则形成形似纤维走行排列的细胞单层。
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Figour5 Keratocytes of rabbit after 7 days in culture.The cells almost fomred
confuluent monolayer(Wright 40x)
培养7d图角膜基质呈纤维细胞,细胞已达融合状态长.
2.2.3 内皮细胞培养 内皮组织块贴壁培养48h后，可见组织块边缘长出少数圆形或多角形内皮细胞，且相对透明。尔后，从组织块长出的细胞越来越多，且原来贴壁的细胞分裂增殖向周围延伸，细胞呈椭圆形或多角形，且互相嵌合。培养1wk后，可见内皮细胞互相嵌合成大片状，细胞仍呈椭圆形或多角形(见图6)。继续培养后，则形成密集的内皮细胞单层。
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Figour3 Endothelial cells of rabbir after 7 days in culture.The cells were ellipic
or polymorphous (Wright 20x)
培养7d兔角膜内皮细胞,细胞呈椭圆形.或多角形.
3 讨论
角膜细胞的培养技术在国内外早已有报告，且不断地改进培养方法[1～8]，但以往的培养技术存在从同一角膜中取材单一的问题，这不仅浪费角膜原材料，也不便于同一个体角膜细胞成分间相互作用的研究。因此寻求一种取材简单、经济实用的培养方法，对角膜病许多基础研究仍具有重要意义。我们通过对同一猴、兔眼分别进行角膜3种细胞的培养，得出如下体会。
3.1 同一角膜材料分离角膜细胞成分的有效顺序是获得单纯角膜细胞成分培养的前提和保障。由于角膜的解剖特点，我们认为依次分离角膜内皮细胞、上皮细胞和基质成纤维细胞是较理想的分离方法。角膜内皮凹陷杯易于加入消化液进行消化。对猴角膜内皮细胞的消化，以2.5g.L-1Trypsin和2.5g.L-1EDTA混合液消化5min效果最佳，它既可以使内皮细胞间及内皮细胞和Descemet膜间的连接松动，易于冲洗脱落成单个细胞，同时消化时间短，不影响上皮细胞和成纤维细胞的取材。另外在消化内皮细胞过程中，采用培养液浸泡角膜上皮面，更加保证了上皮细胞的活性。兔眼角膜片较软，放置时不易形成内皮杯，故我们没有选择消化获得内皮细胞的方法，但由于兔眼Descemet膜与基质连接较疏松，易于分离剥脱，采用内皮层和Descemet膜组织块培养亦易于获得单纯内皮细胞的培养。对角膜上皮细胞的消化，采用1.25g.L-1Trypsin和1.25g.L-1EDTA混合液消化25～30min效果较为理想。浓度太低，细胞不易冲洗脱落，浓度太高，易于损伤上皮细胞；同时消化时间不宜过长，以免影响基质细胞的活性。在基质块取材之前，采用刀片刮除上皮面和内皮面，去除残存的上皮、内皮细胞，保证了培养基质细胞的单纯性。
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3.2 采用消化法获得猴内皮细胞培养24h出现成片贴壁生长，从而缩短了达到生长密集状态的时间，同时也没有组织块培养所见组织块边缘细胞相对较密的现象，细胞培养1～2wk后，形成类似天然的六角细胞单层，更便于角膜内皮细胞的进一步研究。
3.3 采用消化法能获得大量的角膜上皮细胞，但本实验猴眼角膜上皮细胞培养难以达到生长密集状态，我们认为这与取材方法无关，因为同样的方法获得的兔角膜上皮细胞培养分裂增殖旺盛，呈典型的膜状上皮细胞生长。培养猴角膜上皮细胞生长较差，可能是由于物种不同，细胞贴壁生长的营养要求不同之故，如对培养物品进行处理或加入表皮生长因子和胰岛素等促进其生长[2,8,9]。
3.4 角膜基质细胞的培养不需消化，便易形成单层。采用锐利的剪刀剪切组织块，易于细胞长出，同时组织块干燥45min易于组织块较好地贴于培养板上，避免了因干燥时间过长而影响基质细胞的活性。
, 百拇医药 我们进行猴、兔角膜细胞的原代培养，目的是为了获得更多的角膜细胞，便于进行分子生物学研究，以了解临床上角膜伤口愈合过程中的分子生物学基础，为防治角膜术后并发症的研究奠定基础。
致谢：本研究得到本院皮肤科郑捷教授的支持，特此致谢!
△ 上海市科学技术发展基金项目(批准号：974119039)
Accepted for publication Apr 27,1998
From the Ophthalmic Center,Ruijin Hospital(ZHONG Yi-Sheng,WANG Kang-Sun,SHI Hai-Yun)，Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025,China;Xinxiang Central Hospital(CHEN Yu),Xinxiang 453000,Henan Province,China
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参考文献
1 谢立信，董晓光，张德茹，等.人角膜细胞的原代培养实验研究.中华眼科杂志1991；27∶13-15.
2 张泺，赵小抗.角膜上皮细胞体外培养中胶原基质的研究.中华眼科杂志1991；27∶16-18.
3 龚向明，林宁，谢全锦,等.庆大霉素对角膜内皮的影响-组织培养实验研究.眼科研究1989；7∶204-206.
4 Yue BY,Baum JL.Studies of corneas in vivo and in vitro.Vision Res 1981;21∶41.
5 Fabricant RN,Alpar AJ,Centifanto YA,et al.Epidermal growth factor receptors on corneal endothelium.Arch Ophthalmol 1981;99∶305-308.
, http://www.100md.com
6 Nakagawa S,Nishida T,Kodama Y,et al.Spreading of cultured corneal epithelial cells on fibronectin and other extracellular matrics.Cornea 1990;9∶125-130.
7 Hongo M,Itoi M,Yamaguchi N,et al.Distribution of epidermal growth factor(EGF)receptors in rabbit corneal epithelial cells,keratocytes and endothelial cells,and the changes induced by transforming growth factor-β1.Exp Eye Res 1992;54∶9-16.
8 潘志强，奚寿增，林月芳.人角膜上皮细胞体外培养的生长曲线及几种抗生素的影响.眼科研究1997；15∶149-151.
9 Li DQ,Tseng SCG.Three patterns of cytokine expression potentially involved in epithelial-fibroblast interaction of human ocular surface.J Cell Physiol 1995;163∶61-79.
收稿 1998-04-27 修回 1998-08-10, 百拇医药