葛根素滴眼液降眼压作用及其在眼房水中的药物浓度
作者：严汉英 朱延勤 吴正红 陈广忻
单位：210009 南京市，江苏省药物研究所眼科药理研究中心(严汉英，朱延勤)中国药科大学(吴正红，陈广忻)
关键词：葛根素；眼压；房水；眼内药代动力学
眼科新进展990201 摘要 目的 观察葛根素滴眼液对家兔高眼压模型的作用和测定房水中葛根素药物浓度。方法 兔眼球结膜注射地塞米松形成慢性高眼压模型，兔耳缘静脉注射葡萄糖形成急性高眼压模型，先后滴用10g.L-1葛根素滴眼液，观察其降低或抑制高眼压作用；兔眼滴用葛根素滴眼液后，定时抽取房水，用反相高效液相色谱法测定房水中药物浓度。结果 10g.L-1葛根素滴眼液能降低慢性高眼压兔的眼压；能抑制急性眼压升高；药物滴入兔眼后，能被眼组织吸收进入房水，其高峰浓度(Cmax)为0.963mg.L-1，高峰时间(tmax)为2.0h，半衰期(t1/2β)为8.32h。结论 10g.L-1葛根素滴眼液通过滴眼用药，能降低地噻米松引起兔眼高压，并能抑制由快速注射葡萄糖引起的眼压升高；药物能被吸收进入房水中，半衰期为8.32h，为该药临床应用提供了依据。
, 百拇医药
Puerarin eyedrops:action of reducing intraocular pressure and the concentration in aqueous humor
YAN Han-Ying,ZHU Yan-Qin,WU Zheng-Hong,CHENguang-Xin
Abstract Objective To test wether puerarin eyedrops could lower intraocular pressure (IOP)in animal models and evaluate the level of puerarin in aqueous humor after administration of its topical eyedrops in different times.Methods Chronic ocular hypertension was described previously by dexamethasone (0.5mg every other day for 3 weeks)injection into the bulbar subconjunctiva of superior corneal margin of rabbit eye; Acute ocular hypertension was induced by rapid intravenous injection of 50g.L-1glucose 15mg.kg-1.RP-HPLC-UV method was used in determination of the level of puerarin in aqueous humor. Results The potency of IOP hypertension in 10g.L-1pueraringroup was nearly to that of 5g.L-1 timolol,but the effective time maintained for 10g.L-1 puerarin was longer than that for timolol;The IOP lowering ability of 10g.L-1puerarin on acute ocular hypertension rabbit was nearly the same as with 5g.L-1 timolol; The pharmackinetic parameters were as following:α=1.0h-1,β=0.083h-1,t1/2α=0.69h; t1/2β=8.32h, Ka=5.06h-1,Cmax=0.963mg.L-1;AUC=5.16mg.h-1.L-1;tmax=2.0h.Conclusion The 10g.L-1puerarin eyedrops can decrease IOP hypertention induced by rapidly intravenous injection ofglucose and topical dexamethasone.RP-HPLC-UV method is simple and sensitive in the determination of puerarin in aqueous humor.
, 百拇医药
Key words puerarin;intraocular pressure;aqueous humor;ocular pharmackinetics
作者简介 严汉英，男，1936年生，江苏靖江人，中共党员。1959年毕业于南京药学院药学系。现任江苏省药物研究所研究员，眼科药理研究中心主任，江苏省药品评审委员会委员，江苏省药理学会常委，中西医结合研究会微循环专业委员会委员，是有突出贡献、享受中华人民共和国国务院特殊津贴的科学家。60至80年代初主要参与抗血吸虫和疟原虫药物研究。没食子酸锑钠获1978年全国科学大会奖。吡喹酮获1985年国家科技进步二等奖。负责研制的吡喹酮缓释片为1993年国家科委和卫生部新技术、新成果推荐项目，获国家新药证书。负责的疟原虫红外期体外培养研究获江苏省科技进步二等奖。1985年～1986年留美期间，通过实验发现有些抗青光眼药物虽然能降低眼内压，但同时减少了眼血流供应，使主要视觉器官营养不良。论文发表后，引起国际上对已知抗青光眼药物的再评价。回国后建立了江苏省药物研究所眼科药理研究中心，参与研制成诺氟沙星滴眼液，获江苏省科技进步三等奖。环丙沙星滴眼液获无锡市科技进步二等奖。负责“八五”国家重点科技攻关项目，抗白内障新药-苄达赖氨酸的研制，1997年取得国家新药证书和试生产批文。至1997年底，在国内外刊物上发表学术论文80余篇，编写专著3本。现正在主编《眼科药理学和药物治疗》。Tel:025-3373325(H):025-6636347(O) 葛根素(puerarin)为常用中药野葛pueraria labata (willd.) Ohwi (P.thunbergeriana S.et Z.) Benth.P.pseudohirsuta Tang et Wang和甘葛藤(粉葛) pueraria homsonii Benth 根中分离出来的有效成份[1]，其化学名为4，7-二羟基-8-β-D葡萄糖基异黄酮。鉴于葛根素有β-受体阻断作用和多种药理活性，故将其配制成滴眼液，用家兔高眼压模型，研究其降眼压作用，并测定了局部滴药后不同时相房水中的药物浓度，为开发新药和临床用药提供依据。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 试剂 5g.L-1和10g.L-1葛根素滴眼液(江苏省药物研究所眼科药理研究中心配制)；5g.L-1噻吗洛尔滴眼液(天津市胜利制药厂生产)；9g.L-1生理盐水(南京小营制药厂生产)，50g.L-1葡萄糖注射液(江苏省宜兴市制药厂生产)；葛根素对照品(中国药品生物制品鉴定所提供)；甲醇(AR，淮阴塑料制品厂精细化工所生产)，磷酸二氢钠和磷酸氢二钠均为南京化学试剂厂生产。
1.1.2 动物 健康成年新西兰白兔，体重2～3kg，雌雄均用，为江苏省药物研究所实验动物室提供，实验前均检查双外眼，测量眼压和观察眼底正常者采用并连续测定眼压3d，稳定者选用。
, http://www.100md.com
1.1.3 仪器 Schiotz眼压计(苏州医疗器械厂生产)，日本岛津LC-6A高效液相色谱仪，SPD-6AV紫外检测器 ，USA7125样品进样阀(定量管为20μL)，TGLC-18B冷冻高速离心机(江苏省太仓医疗器械厂生产)，AST486计算机。
1.2 实验方法
1.2.1 慢性高眼压模型的实验方法[2] 在已选用的兔眼角膜缘上方球结膜下注射地噻米松0.5mg，隔日1次，连续3wk，可形成慢性高眼压模型。然后，随机分成4组：第一组为9g.L-1生理盐水；第二组为5g.L-1噻吗洛尔滴眼液；第三组为5g.L-1葛根素滴眼液；第四组为10g.L-1葛根素滴眼液。在麻醉条件下(200g.L-1乌拉坦，1.0g.kg-1,iv)测量眼压，于滴药前和滴药后1、2、3、4、6、10、24h各测眼压1次，某小时内的降眼压值用△IOP表示；△IOP=(IOP)t-(IOP)0,式中(△IOP)t为t时间内的眼压下降值，(IOP)t为t时间内的眼压实测值，(IOP)0为滴眼前的眼压实测值。
, 百拇医药
1.2.2 急性高眼压模型的实验方法[3] 在已选用的兔耳缘静脉快速注射50g.L-1葡萄糖(15mg.kg-1)可形成急性高眼压模型。动物随机分为5组：第一组为5g.L-1葛根素滴眼液；第二组为10g.L-1葛根素滴眼液；第三组为5g.L-1噻吗洛尔滴眼液；第四组为溶媒体对照组；第五组为50g.L-1葡萄糖组。在麻醉条件下(200g.L-1乌拉坦，1.0g.kg-1,iv)测量眼压，先测正常值，再滴药。1h后，各组均注射50g.L-1葡萄糖，于注射后5、10、20、40min再各测眼压1次。
1.2.3 房水中药物浓度的测定
, http://www.100md.com
1.2.3.1 给药及样品采集方法[4] 取44只家兔，随机分成0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、16、24h等11个时间组，每一时间组是4只家兔(共8只眼)。给药时，将家兔固定在兔箱内，轻轻拉开下眼睑使与眼球成袋状。滴入10g.L-1葛根素滴眼液50μL，再轻轻放开下眼睑，使药物不会很快溢出。给药后，全麻家兔(iv 1.0g.kg-1,200g.L-1乌拉坦)，分别从每眼抽取0.2mL房水，立即置于-10℃冰箱中冷冻保存。
1.2.3.2 色谱条件 色谱柱为Supersorb ODS C18 (4.6mm×250mm,5μm)；检测波长249nm;流速0.7mL.min-1;柱温40℃；流动相为甲醇∶水∶磷酸缓冲液(0.1mol.L-1,pH7.40)=11∶79∶10；走纸速度1mm.min-1。图谱见图1。
, http://www.100md.com
Figure 1 High performance liquid chromatogram of puerarin 葛根素高效液相色谱图
a：Mobil phase 流动相；b：Puerarin(RS)dissolved with mobil phase 流动相溶解葛根素(对照)；c：Black aqueous humor 空白房水；d：Puerarin (RS)dissolved with blank aqueous humor 空白房水溶解葛根素 (对照)；e：Aqueous humor sample 房水样品；f：Aqueous humor sample and puerarin (RS) 房水样品和葛根素 (对照)
1.2.3.3 样品测定 先按上述色谱条件进行方法学研究，证明最低检测限是在2倍噪音以上，精密度试验的日内变异和日间变异在2RSD以内，回收率在80%以上，重现性良好。再制备标准曲线，即精密称取葛根素对照品10mg，置于100mL的容量瓶内，用适量甲醇冲洗烧杯，合并洗液，加甲醇至刻度，摇匀，制成葛根素标准品(100mg.L-1)。再取适量的葛根素标准液，分别用空白房水或流动相配成2种浓度均为2.00、1.00、0.50、0.25、0.125、0.0625mg.L-1的溶液，即分别为葛根素房水标准液和葛根素流动相标准液，再分别进行HPLC测定。得到二根标准曲线的回归方程：(1)房水+标准品：AUC=1413.95C+159.34,r=0.9996;(2)流动相+标准品：AUC=48311.61C+54.49,r=0.9992;线性范围在0.0625～2.0mg.L-1之间。
, http://www.100md.com
1.2.4 数据处理 统计处理组间比较用t检验，药代动力学参数计算采用南京医科大学数学教研组罗建平等编写的CAPP软件包。
2 结果
2.1 葛根素滴眼液对家兔慢性高眼压模型的降眼压作用 实验结果表明：在所测眼压的各时间点上，眼压下降的绝对值△IOP，10g.L-1葛根素组与生理盐水组相比较有非常显著差异(P<0.01或0.05)，说明10g.L-1葛根素滴眼液具有良好的降眼压作用。5g.L-1葛根素滴眼液在1～3h内与生理盐水组相比有显著差异，以后差异不显著(P>0.05)。说明葛根素滴眼液对家兔的降眼压强度与药物浓度有相关性。10g.L-1葛根素滴眼液与5g.L-1噻吗洛尔相比，降眼压的趋势相似，但在维持低眼压强度方面，在6h时间点上后者优于前者(P<0.05)；而在24h时间点上前者优于后者(P<0.05)，说明10g.L-1葛根素滴眼液在快速降眼压作用方面弱于5g.L-1噻吗洛尔滴眼液，在维持较长时间低眼压作用方面优于5g.L-1噻吗洛尔滴眼液，详细结果见表1，图2。
, 百拇医药
表1 葛根素滴眼液对家兔慢性高眼压模型的降眼压作用
Table 1 The reducing IOP effection of puerarin eyedrops on the rabbit model of chronic IOP elevation p/kPa
Time(h)
5g.L-1 Puerarin
eyedrops
10g.L-1 Puerarin}
eyedrops
5g.L-1 Timolol
, http://www.100md.com
eyedrops
9g.L-1 Saline
eyedrops
0
0
0
0
0
1
-0.29±0.19b
-0.44±0.21c
-0.27±0.15c
, http://www.100md.com
0.08±0.09
2
-0.56±0.31b
-0.80±0.18c
-0.71±0.15c
-0.04±0.19
3
-0.59±0.29b
-0.92±0.18c
-0.92±0.17c
, http://www.100md.com
-0.06±0.18
4
-0.19±0.16a
-1.00±0.34c
-1.07±0.22c
-0.04±0.17
6
-0.16±0.21a
-0.59±0.10c
-1.07±0.16cd
, 百拇医药
-0.08±0.19
10
-0.12±0.13a
-0.56±0.14c
-0.53±0.15b
-0.08±0.16
24
-0.08±0.09a
-0.30±0.12c
-0.04±0.13ad
, http://www.100md.com
-0.04±0.17
Compared with saline 与生理盐水比较：aP>0.05，bP<0.05,cP<0.01；Compared with timolol 与噻吗洛尔比较：dP<0.05
Figure 2 The reducing IOP effection of peurarin on the rabbit
model of chronic IOP elevation
葛根素对家兔慢性高眼压模型的降压作用
●5g.L-1 Pueraringroup 5g.L-1葛根素组；
, 百拇医药
■10g.L-1 Pueraringroup 10g.L-1葛根素组；
□5g.L-1 Timololgroup 5g.L-1噻吗洛尔组；
○ 9g.L-1 Saline controlgroup 9g.L-1生理盐水组
2.2 葛根素滴眼液对家兔急性高眼压模型抑制眼压升高的作用 在葛根素对急性高眼压抑制作用的5组实验中，眼压用实测值表示，5g.L-1和10g.L-1葛根素滴眼液及5g.L-1噻吗洛尔滴眼液3个用药组，分别与溶媒对照组和模型对照组比较均有显著差异(P<0.05)；说明都有抑制快速注射20g.L-1葡萄糖溶液而引起的眼压升高作用；其中10g.L-1葛根素滴眼液与5g.-1噻吗洛尔滴眼液相比抑制眼压升高作用无显著差异(P>0.05)。结果详见表2，图3。表2 葛根素滴眼液对家兔急性高眼压模型的抑制眼压的升高作用
, 百拇医药
Table 2 The IOP depressive effect of puerarin eyedrops on the rabbit model of acute IOP elevation p/kPa Time(h)
5g.L-1 Puerarin
10g.L-1 Puerarin
5g.L-1 Timolol
Solvent
50g.L-1 Glucose
eyedrops
, http://www.100md.com
eyedrops
eyedrops
Control
0
2.59±0.12a
2.36±0.09b
2.34±0.28b
2.87±0.09
2.89±0.14
5
3.02±0.22b
, 百拇医药
2.59±0.11b
2.57±0.43b
3.71±0.41
3.92±0.24
10
3.30±0.23b
2.91±0.21c
3.15±0.51c
4.19±0.30
4.24±0.32
, 百拇医药 20
2.95±0.14c
2.71±0.25c
2.75±0.35c
3.97±0.40
3.60±0.34
30
2.80±0.09a
2.79±0.12b
2.59±0.25b
, 百拇医药 3.47±0.36
3.34±0.27
40
2.70±0.05b
2.65±0.07b
2.65±0.35b
2.92±0.13
3.01±0.15
Compared with solvent 与溶媒比较：aP>0.05，bP<0.05,cP<0.01；
, 百拇医药
Figure 3 The IOP depressive of peurarin on the rabbit model of acute IOP elevation
葛根素对家兔急性高眼压模型的作用
○Solvant control group 溶媒组；
●50g.L-1 glucose control group 50g.L-1葡萄糖对照组；
□5g.L-1 puerarin group 5g.L-1葛根素组；
10g.L-1 puerarin group 10g.-1葛根素组；
, 百拇医药
5g.L-1 tinmolol group 5g.L-1噻吗尔组
2.3 10g.L-1 葛根素滴眼液一次滴眼后，药物在家兔眼房水中的浓度用HPLC测定的不同时间点的房水中药物浓度结果见表3，图4。采用CAPP软件包，用药物浓度(C)对时间(t)的数据进行曲线拟合和计算。结果表明：葛根素滴眼液在兔眼内的药代动力学可用二室开放模型描述，其拟合动力学方程为：
C(t)=2.13×exp(-1.00×t)+0.23×exp(-0.083×t)-2.36×exp(-5.06×t)。表3 家兔滴用葛根素滴眼液后不同时间葛根素在房水中的浓度
Table 3 Concentration of puerarin in the aqueous humor of rabbgits after administration of puerarin eyedrops Time(h)
, http://www.100md.com
0.5
1.0
2.0
3.0
4.0
6.0
8.0
10.0
16.0
24.0
±s
0.118
0.284
, 百拇医药
0.963
0.481
0.278
0.188
0.117
0.108
0.067
0.040
(mg.L-1)
±0.028
±0.099
±0.221
, 百拇医药
±0.144
±0.050
±0.045
±0.038
±0.030
±0.015
±0.014
Figure 4 Concentration of puerarin in aqueous humor of rabbits after
administration of puerarin eyedrops
, 百拇医药
家兔眼用葛根素滴眼液后房水中药物浓度
计算得药代动力学参数为：A=2.13mg.L-1；B=0.23mg.L-1；α=1.00h-1；β=0.083h-1;t1/2α=0.69h;t1/2β=8.32h；Ka=5.06h-1;K21=0.19h-1；K10=0.43h-1;K12=0.046h-1，Cmax=0.963μg.mL-1;tmax=2.00h;AUC=5.16μg.h-1.L-1。
, 百拇医药
3 讨论
本文首次报告了葛根素滴眼液对家兔高眼压模型的降眼压作用，这一结果与临床报告相符[5]。由快速注射50g*L-1葡萄糖引起的高眼压，主要用于观察葛根素是否具有抑制眼压升高的作用。该模型对评价影响房水生成和排出的抗青光眼药物较灵敏。地塞米松引起高眼压，可能是由于该药使眼组织小梁网粘多糖积聚，小梁网间隙变窄，发生房水流出障碍。也可能是由于抑制了小梁内皮细胞的吞噬功能，使房水中存在的碎片在小梁内沉着，影响房水流出，而致IOP升高。葛根素滴眼液对2种高眼压模型均有作用，其降压机理有待探讨。但有文献报告：葛根素既有改善微循环作用[6]，又有β受体阻断作用[7，8]，这是该药有降低IOP作用的基础。葛根素滴眼液可能是通过扩张巩膜静脉窦周围的小血管和收缩睫状肌，使滤帘结构发生改变，增加了房水的排出，从而使眼压下降；也可能是直接阻断了儿茶酚胺对分泌细胞的刺激作用，减少了房水的生成，而使眼压下降。葛根素有降低眼压和改善眼微循环的双重作用，无疑对治疗青光眼是很有利的，可避免有些抗青光眼药物虽能降低眼压，但同时也减少了眼血流和营养供应，使视力继续丧失。近期有研究[9]表明：葛根素有对抗谷氨酸引起神经细胞兴奋毒的作用，说明该药对治疗青光眼引起的视神经损伤也许是有用的。本文报告中药有效成份中异黄酮结构的化合物有降低眼压作用，为寻找新的抗青光眼药物指出了新方向，有重大意义。眼内药代动力学研究表明：葛根素配制成滴眼液，通过滴眼这一局部用药途径，能够很好的被眼组织吸收，发挥药效作用。药物的高峰浓度出现在2h，眼压下降的最低点在4h，说明药效有滞后现象。药物在房水中消除半衰期(t1/2β)为8.32h，结合观察到一次滴药后24h仍能维持较低眼压，故每日2次滴药，是相对合理的。综合上述研究结果说明：葛根素滴眼液可能将成为一种优良的抗青光眼药物。
, 百拇医药
△ 国家自然科学基金和江苏省科委(No.39570881)资助课题，且部分内容于1998年7月在德国慕尼黑第13届世界药理学大会上交流。
Accepted for publication Aug 25,1998
From the Research Center of Ocular Pharmacology,Jiangsu Provincial Institute of Materia Media,Nanjing 210009,China (YAN Han-Ying,ZHU Yan-Qin)；China Pharmaceutical University (WU Zheng-Hong CHENguang-Xin)
参考文献
1 宋振玉主编.中草药现代研究(第1卷).北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社 1995∶258.
, http://www.100md.com
2 蔡丰英，孙文驷.透明质酸酶对类固醇性高眼压作用的探讨.眼科新进展 1991；11(3)∶10-12.
3 Bonomi L,Tomazzol L,Jaria D.An improved model of experimentally induced ocular hypertension in the rabbit.Inv Ophthalmol 1976;15(19)∶781-783.
4 Chentoni L,Mariotii B. Ocular mini-tablets for controlled release of timolol,evaluation in rabbits.J Ocular Pharmacol 1996;12(3)∶245-248.
5 康汝秀，张善云，王 荣.葛根素降眼压的研究.中华眼科杂志 1993；29(6)∶336-339.
, 百拇医药
6 姜秀莲，徐理纳.葛根素对小鼠实验性微循环障碍的改善作用.药学学报 1989；24(4)∶251-254.
7 赖祥林，唐 冰.葛根素的实验研究与临床应用新进展.中国中药杂志 1989；14(5)∶309-312.
8 王磊一，赵爱平，柴象枢.葛根素对猫离体平滑肌的作用.中国药理学报 1994；15(2)∶180-182.
9 董丽萍，王天佑.葛根素抗谷氨酸对小鼠神经细胞兴奋毒的作用.中国药理学报 1998；19(4)∶339-342.
收稿 1998-08-25 修回 1998-11-06, 百拇医药
单位：210009 南京市，江苏省药物研究所眼科药理研究中心(严汉英，朱延勤)中国药科大学(吴正红，陈广忻)
关键词：葛根素；眼压；房水；眼内药代动力学
眼科新进展990201 摘要 目的 观察葛根素滴眼液对家兔高眼压模型的作用和测定房水中葛根素药物浓度。方法 兔眼球结膜注射地塞米松形成慢性高眼压模型，兔耳缘静脉注射葡萄糖形成急性高眼压模型，先后滴用10g.L-1葛根素滴眼液，观察其降低或抑制高眼压作用；兔眼滴用葛根素滴眼液后，定时抽取房水，用反相高效液相色谱法测定房水中药物浓度。结果 10g.L-1葛根素滴眼液能降低慢性高眼压兔的眼压；能抑制急性眼压升高；药物滴入兔眼后，能被眼组织吸收进入房水，其高峰浓度(Cmax)为0.963mg.L-1，高峰时间(tmax)为2.0h，半衰期(t1/2β)为8.32h。结论 10g.L-1葛根素滴眼液通过滴眼用药，能降低地噻米松引起兔眼高压，并能抑制由快速注射葡萄糖引起的眼压升高；药物能被吸收进入房水中，半衰期为8.32h，为该药临床应用提供了依据。
, 百拇医药
Puerarin eyedrops:action of reducing intraocular pressure and the concentration in aqueous humor
YAN Han-Ying,ZHU Yan-Qin,WU Zheng-Hong,CHENguang-Xin
Abstract Objective To test wether puerarin eyedrops could lower intraocular pressure (IOP)in animal models and evaluate the level of puerarin in aqueous humor after administration of its topical eyedrops in different times.Methods Chronic ocular hypertension was described previously by dexamethasone (0.5mg every other day for 3 weeks)injection into the bulbar subconjunctiva of superior corneal margin of rabbit eye; Acute ocular hypertension was induced by rapid intravenous injection of 50g.L-1glucose 15mg.kg-1.RP-HPLC-UV method was used in determination of the level of puerarin in aqueous humor. Results The potency of IOP hypertension in 10g.L-1pueraringroup was nearly to that of 5g.L-1 timolol,but the effective time maintained for 10g.L-1 puerarin was longer than that for timolol;The IOP lowering ability of 10g.L-1puerarin on acute ocular hypertension rabbit was nearly the same as with 5g.L-1 timolol; The pharmackinetic parameters were as following:α=1.0h-1,β=0.083h-1,t1/2α=0.69h; t1/2β=8.32h, Ka=5.06h-1,Cmax=0.963mg.L-1;AUC=5.16mg.h-1.L-1;tmax=2.0h.Conclusion The 10g.L-1puerarin eyedrops can decrease IOP hypertention induced by rapidly intravenous injection ofglucose and topical dexamethasone.RP-HPLC-UV method is simple and sensitive in the determination of puerarin in aqueous humor.
, 百拇医药
Key words puerarin;intraocular pressure;aqueous humor;ocular pharmackinetics
作者简介 严汉英，男，1936年生，江苏靖江人，中共党员。1959年毕业于南京药学院药学系。现任江苏省药物研究所研究员，眼科药理研究中心主任，江苏省药品评审委员会委员，江苏省药理学会常委，中西医结合研究会微循环专业委员会委员，是有突出贡献、享受中华人民共和国国务院特殊津贴的科学家。60至80年代初主要参与抗血吸虫和疟原虫药物研究。没食子酸锑钠获1978年全国科学大会奖。吡喹酮获1985年国家科技进步二等奖。负责研制的吡喹酮缓释片为1993年国家科委和卫生部新技术、新成果推荐项目，获国家新药证书。负责的疟原虫红外期体外培养研究获江苏省科技进步二等奖。1985年～1986年留美期间，通过实验发现有些抗青光眼药物虽然能降低眼内压，但同时减少了眼血流供应，使主要视觉器官营养不良。论文发表后，引起国际上对已知抗青光眼药物的再评价。回国后建立了江苏省药物研究所眼科药理研究中心，参与研制成诺氟沙星滴眼液，获江苏省科技进步三等奖。环丙沙星滴眼液获无锡市科技进步二等奖。负责“八五”国家重点科技攻关项目，抗白内障新药-苄达赖氨酸的研制，1997年取得国家新药证书和试生产批文。至1997年底，在国内外刊物上发表学术论文80余篇，编写专著3本。现正在主编《眼科药理学和药物治疗》。Tel:025-3373325(H):025-6636347(O) 葛根素(puerarin)为常用中药野葛pueraria labata (willd.) Ohwi (P.thunbergeriana S.et Z.) Benth.P.pseudohirsuta Tang et Wang和甘葛藤(粉葛) pueraria homsonii Benth 根中分离出来的有效成份[1]，其化学名为4，7-二羟基-8-β-D葡萄糖基异黄酮。鉴于葛根素有β-受体阻断作用和多种药理活性，故将其配制成滴眼液，用家兔高眼压模型，研究其降眼压作用，并测定了局部滴药后不同时相房水中的药物浓度，为开发新药和临床用药提供依据。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 试剂 5g.L-1和10g.L-1葛根素滴眼液(江苏省药物研究所眼科药理研究中心配制)；5g.L-1噻吗洛尔滴眼液(天津市胜利制药厂生产)；9g.L-1生理盐水(南京小营制药厂生产)，50g.L-1葡萄糖注射液(江苏省宜兴市制药厂生产)；葛根素对照品(中国药品生物制品鉴定所提供)；甲醇(AR，淮阴塑料制品厂精细化工所生产)，磷酸二氢钠和磷酸氢二钠均为南京化学试剂厂生产。
1.1.2 动物 健康成年新西兰白兔，体重2～3kg，雌雄均用，为江苏省药物研究所实验动物室提供，实验前均检查双外眼，测量眼压和观察眼底正常者采用并连续测定眼压3d，稳定者选用。
, http://www.100md.com
1.1.3 仪器 Schiotz眼压计(苏州医疗器械厂生产)，日本岛津LC-6A高效液相色谱仪，SPD-6AV紫外检测器 ，USA7125样品进样阀(定量管为20μL)，TGLC-18B冷冻高速离心机(江苏省太仓医疗器械厂生产)，AST486计算机。
1.2 实验方法
1.2.1 慢性高眼压模型的实验方法[2] 在已选用的兔眼角膜缘上方球结膜下注射地噻米松0.5mg，隔日1次，连续3wk，可形成慢性高眼压模型。然后，随机分成4组：第一组为9g.L-1生理盐水；第二组为5g.L-1噻吗洛尔滴眼液；第三组为5g.L-1葛根素滴眼液；第四组为10g.L-1葛根素滴眼液。在麻醉条件下(200g.L-1乌拉坦，1.0g.kg-1,iv)测量眼压，于滴药前和滴药后1、2、3、4、6、10、24h各测眼压1次，某小时内的降眼压值用△IOP表示；△IOP=(IOP)t-(IOP)0,式中(△IOP)t为t时间内的眼压下降值，(IOP)t为t时间内的眼压实测值，(IOP)0为滴眼前的眼压实测值。
, 百拇医药
1.2.2 急性高眼压模型的实验方法[3] 在已选用的兔耳缘静脉快速注射50g.L-1葡萄糖(15mg.kg-1)可形成急性高眼压模型。动物随机分为5组：第一组为5g.L-1葛根素滴眼液；第二组为10g.L-1葛根素滴眼液；第三组为5g.L-1噻吗洛尔滴眼液；第四组为溶媒体对照组；第五组为50g.L-1葡萄糖组。在麻醉条件下(200g.L-1乌拉坦，1.0g.kg-1,iv)测量眼压，先测正常值，再滴药。1h后，各组均注射50g.L-1葡萄糖，于注射后5、10、20、40min再各测眼压1次。
1.2.3 房水中药物浓度的测定
, http://www.100md.com
1.2.3.1 给药及样品采集方法[4] 取44只家兔，随机分成0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、16、24h等11个时间组，每一时间组是4只家兔(共8只眼)。给药时，将家兔固定在兔箱内，轻轻拉开下眼睑使与眼球成袋状。滴入10g.L-1葛根素滴眼液50μL，再轻轻放开下眼睑，使药物不会很快溢出。给药后，全麻家兔(iv 1.0g.kg-1,200g.L-1乌拉坦)，分别从每眼抽取0.2mL房水，立即置于-10℃冰箱中冷冻保存。
1.2.3.2 色谱条件 色谱柱为Supersorb ODS C18 (4.6mm×250mm,5μm)；检测波长249nm;流速0.7mL.min-1;柱温40℃；流动相为甲醇∶水∶磷酸缓冲液(0.1mol.L-1,pH7.40)=11∶79∶10；走纸速度1mm.min-1。图谱见图1。
, http://www.100md.com
Figure 1 High performance liquid chromatogram of puerarin 葛根素高效液相色谱图
a：Mobil phase 流动相；b：Puerarin(RS)dissolved with mobil phase 流动相溶解葛根素(对照)；c：Black aqueous humor 空白房水；d：Puerarin (RS)dissolved with blank aqueous humor 空白房水溶解葛根素 (对照)；e：Aqueous humor sample 房水样品；f：Aqueous humor sample and puerarin (RS) 房水样品和葛根素 (对照)
1.2.3.3 样品测定 先按上述色谱条件进行方法学研究，证明最低检测限是在2倍噪音以上，精密度试验的日内变异和日间变异在2RSD以内，回收率在80%以上，重现性良好。再制备标准曲线，即精密称取葛根素对照品10mg，置于100mL的容量瓶内，用适量甲醇冲洗烧杯，合并洗液，加甲醇至刻度，摇匀，制成葛根素标准品(100mg.L-1)。再取适量的葛根素标准液，分别用空白房水或流动相配成2种浓度均为2.00、1.00、0.50、0.25、0.125、0.0625mg.L-1的溶液，即分别为葛根素房水标准液和葛根素流动相标准液，再分别进行HPLC测定。得到二根标准曲线的回归方程：(1)房水+标准品：AUC=1413.95C+159.34,r=0.9996;(2)流动相+标准品：AUC=48311.61C+54.49,r=0.9992;线性范围在0.0625～2.0mg.L-1之间。
, http://www.100md.com
1.2.4 数据处理 统计处理组间比较用t检验，药代动力学参数计算采用南京医科大学数学教研组罗建平等编写的CAPP软件包。
2 结果
2.1 葛根素滴眼液对家兔慢性高眼压模型的降眼压作用 实验结果表明：在所测眼压的各时间点上，眼压下降的绝对值△IOP，10g.L-1葛根素组与生理盐水组相比较有非常显著差异(P<0.01或0.05)，说明10g.L-1葛根素滴眼液具有良好的降眼压作用。5g.L-1葛根素滴眼液在1～3h内与生理盐水组相比有显著差异，以后差异不显著(P>0.05)。说明葛根素滴眼液对家兔的降眼压强度与药物浓度有相关性。10g.L-1葛根素滴眼液与5g.L-1噻吗洛尔相比，降眼压的趋势相似，但在维持低眼压强度方面，在6h时间点上后者优于前者(P<0.05)；而在24h时间点上前者优于后者(P<0.05)，说明10g.L-1葛根素滴眼液在快速降眼压作用方面弱于5g.L-1噻吗洛尔滴眼液，在维持较长时间低眼压作用方面优于5g.L-1噻吗洛尔滴眼液，详细结果见表1，图2。
, 百拇医药
表1 葛根素滴眼液对家兔慢性高眼压模型的降眼压作用
Table 1 The reducing IOP effection of puerarin eyedrops on the rabbit model of chronic IOP elevation p/kPa
Time(h)
5g.L-1 Puerarin
eyedrops
10g.L-1 Puerarin}
eyedrops
5g.L-1 Timolol
, http://www.100md.com
eyedrops
9g.L-1 Saline
eyedrops
0
0
0
0
0
1
-0.29±0.19b
-0.44±0.21c
-0.27±0.15c
, http://www.100md.com
0.08±0.09
2
-0.56±0.31b
-0.80±0.18c
-0.71±0.15c
-0.04±0.19
3
-0.59±0.29b
-0.92±0.18c
-0.92±0.17c
, http://www.100md.com
-0.06±0.18
4
-0.19±0.16a
-1.00±0.34c
-1.07±0.22c
-0.04±0.17
6
-0.16±0.21a
-0.59±0.10c
-1.07±0.16cd
, 百拇医药
-0.08±0.19
10
-0.12±0.13a
-0.56±0.14c
-0.53±0.15b
-0.08±0.16
24
-0.08±0.09a
-0.30±0.12c
-0.04±0.13ad
, http://www.100md.com
-0.04±0.17
Compared with saline 与生理盐水比较：aP>0.05，bP<0.05,cP<0.01；Compared with timolol 与噻吗洛尔比较：dP<0.05
Figure 2 The reducing IOP effection of peurarin on the rabbit
model of chronic IOP elevation
葛根素对家兔慢性高眼压模型的降压作用
●5g.L-1 Pueraringroup 5g.L-1葛根素组；
, 百拇医药
■10g.L-1 Pueraringroup 10g.L-1葛根素组；
□5g.L-1 Timololgroup 5g.L-1噻吗洛尔组；
○ 9g.L-1 Saline controlgroup 9g.L-1生理盐水组
2.2 葛根素滴眼液对家兔急性高眼压模型抑制眼压升高的作用 在葛根素对急性高眼压抑制作用的5组实验中，眼压用实测值表示，5g.L-1和10g.L-1葛根素滴眼液及5g.L-1噻吗洛尔滴眼液3个用药组，分别与溶媒对照组和模型对照组比较均有显著差异(P<0.05)；说明都有抑制快速注射20g.L-1葡萄糖溶液而引起的眼压升高作用；其中10g.L-1葛根素滴眼液与5g.-1噻吗洛尔滴眼液相比抑制眼压升高作用无显著差异(P>0.05)。结果详见表2，图3。表2 葛根素滴眼液对家兔急性高眼压模型的抑制眼压的升高作用
, 百拇医药
Table 2 The IOP depressive effect of puerarin eyedrops on the rabbit model of acute IOP elevation p/kPa Time(h)
5g.L-1 Puerarin
10g.L-1 Puerarin
5g.L-1 Timolol
Solvent
50g.L-1 Glucose
eyedrops
, http://www.100md.com
eyedrops
eyedrops
Control
0
2.59±0.12a
2.36±0.09b
2.34±0.28b
2.87±0.09
2.89±0.14
5
3.02±0.22b
, 百拇医药
2.59±0.11b
2.57±0.43b
3.71±0.41
3.92±0.24
10
3.30±0.23b
2.91±0.21c
3.15±0.51c
4.19±0.30
4.24±0.32
, 百拇医药 20
2.95±0.14c
2.71±0.25c
2.75±0.35c
3.97±0.40
3.60±0.34
30
2.80±0.09a
2.79±0.12b
2.59±0.25b
, 百拇医药 3.47±0.36
3.34±0.27
40
2.70±0.05b
2.65±0.07b
2.65±0.35b
2.92±0.13
3.01±0.15
Compared with solvent 与溶媒比较：aP>0.05，bP<0.05,cP<0.01；
, 百拇医药
Figure 3 The IOP depressive of peurarin on the rabbit model of acute IOP elevation
葛根素对家兔急性高眼压模型的作用
○Solvant control group 溶媒组；
●50g.L-1 glucose control group 50g.L-1葡萄糖对照组；
□5g.L-1 puerarin group 5g.L-1葛根素组；
10g.L-1 puerarin group 10g.-1葛根素组；
, 百拇医药
5g.L-1 tinmolol group 5g.L-1噻吗尔组
2.3 10g.L-1 葛根素滴眼液一次滴眼后，药物在家兔眼房水中的浓度用HPLC测定的不同时间点的房水中药物浓度结果见表3，图4。采用CAPP软件包，用药物浓度(C)对时间(t)的数据进行曲线拟合和计算。结果表明：葛根素滴眼液在兔眼内的药代动力学可用二室开放模型描述，其拟合动力学方程为：
C(t)=2.13×exp(-1.00×t)+0.23×exp(-0.083×t)-2.36×exp(-5.06×t)。表3 家兔滴用葛根素滴眼液后不同时间葛根素在房水中的浓度
Table 3 Concentration of puerarin in the aqueous humor of rabbgits after administration of puerarin eyedrops Time(h)
, http://www.100md.com
0.5
1.0
2.0
3.0
4.0
6.0
8.0
10.0
16.0
24.0
±s0.118
0.284
, 百拇医药
0.963
0.481
0.278
0.188
0.117
0.108
0.067
0.040
(mg.L-1)
±0.028
±0.099
±0.221
, 百拇医药
±0.144
±0.050
±0.045
±0.038
±0.030
±0.015
±0.014
Figure 4 Concentration of puerarin in aqueous humor of rabbits after
administration of puerarin eyedrops
, 百拇医药
家兔眼用葛根素滴眼液后房水中药物浓度
计算得药代动力学参数为：A=2.13mg.L-1；B=0.23mg.L-1；α=1.00h-1；β=0.083h-1;t1/2α=0.69h;t1/2β=8.32h；Ka=5.06h-1;K21=0.19h-1；K10=0.43h-1;K12=0.046h-1，Cmax=0.963μg.mL-1;tmax=2.00h;AUC=5.16μg.h-1.L-1。
, 百拇医药
3 讨论
本文首次报告了葛根素滴眼液对家兔高眼压模型的降眼压作用，这一结果与临床报告相符[5]。由快速注射50g*L-1葡萄糖引起的高眼压，主要用于观察葛根素是否具有抑制眼压升高的作用。该模型对评价影响房水生成和排出的抗青光眼药物较灵敏。地塞米松引起高眼压，可能是由于该药使眼组织小梁网粘多糖积聚，小梁网间隙变窄，发生房水流出障碍。也可能是由于抑制了小梁内皮细胞的吞噬功能，使房水中存在的碎片在小梁内沉着，影响房水流出，而致IOP升高。葛根素滴眼液对2种高眼压模型均有作用，其降压机理有待探讨。但有文献报告：葛根素既有改善微循环作用[6]，又有β受体阻断作用[7，8]，这是该药有降低IOP作用的基础。葛根素滴眼液可能是通过扩张巩膜静脉窦周围的小血管和收缩睫状肌，使滤帘结构发生改变，增加了房水的排出，从而使眼压下降；也可能是直接阻断了儿茶酚胺对分泌细胞的刺激作用，减少了房水的生成，而使眼压下降。葛根素有降低眼压和改善眼微循环的双重作用，无疑对治疗青光眼是很有利的，可避免有些抗青光眼药物虽能降低眼压，但同时也减少了眼血流和营养供应，使视力继续丧失。近期有研究[9]表明：葛根素有对抗谷氨酸引起神经细胞兴奋毒的作用，说明该药对治疗青光眼引起的视神经损伤也许是有用的。本文报告中药有效成份中异黄酮结构的化合物有降低眼压作用，为寻找新的抗青光眼药物指出了新方向，有重大意义。眼内药代动力学研究表明：葛根素配制成滴眼液，通过滴眼这一局部用药途径，能够很好的被眼组织吸收，发挥药效作用。药物的高峰浓度出现在2h，眼压下降的最低点在4h，说明药效有滞后现象。药物在房水中消除半衰期(t1/2β)为8.32h，结合观察到一次滴药后24h仍能维持较低眼压，故每日2次滴药，是相对合理的。综合上述研究结果说明：葛根素滴眼液可能将成为一种优良的抗青光眼药物。
, 百拇医药
△ 国家自然科学基金和江苏省科委(No.39570881)资助课题，且部分内容于1998年7月在德国慕尼黑第13届世界药理学大会上交流。
Accepted for publication Aug 25,1998
From the Research Center of Ocular Pharmacology,Jiangsu Provincial Institute of Materia Media,Nanjing 210009,China (YAN Han-Ying,ZHU Yan-Qin)；China Pharmaceutical University (WU Zheng-Hong CHENguang-Xin)
参考文献
1 宋振玉主编.中草药现代研究(第1卷).北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社 1995∶258.
, http://www.100md.com
2 蔡丰英，孙文驷.透明质酸酶对类固醇性高眼压作用的探讨.眼科新进展 1991；11(3)∶10-12.
3 Bonomi L,Tomazzol L,Jaria D.An improved model of experimentally induced ocular hypertension in the rabbit.Inv Ophthalmol 1976;15(19)∶781-783.
4 Chentoni L,Mariotii B. Ocular mini-tablets for controlled release of timolol,evaluation in rabbits.J Ocular Pharmacol 1996;12(3)∶245-248.
5 康汝秀，张善云，王 荣.葛根素降眼压的研究.中华眼科杂志 1993；29(6)∶336-339.
, 百拇医药
6 姜秀莲，徐理纳.葛根素对小鼠实验性微循环障碍的改善作用.药学学报 1989；24(4)∶251-254.
7 赖祥林，唐 冰.葛根素的实验研究与临床应用新进展.中国中药杂志 1989；14(5)∶309-312.
8 王磊一，赵爱平，柴象枢.葛根素对猫离体平滑肌的作用.中国药理学报 1994；15(2)∶180-182.
9 董丽萍，王天佑.葛根素抗谷氨酸对小鼠神经细胞兴奋毒的作用.中国药理学报 1998；19(4)∶339-342.
收稿 1998-08-25 修回 1998-11-06, 百拇医药