阿尔茨海默病血清和脑脊液β-淀粉样蛋白的测定☆
作者：王 磊 袁锦楣 郝洪军 李 静 李海峰 金弘敏 冀成君
单位：袁锦楣 郝洪军 李 静：北京医科大学第一临床学院神经病学研究中心免疫室 (100034)；王 磊 李海峰：研究生；金弘敏 冀成君：北京回龙观医院老年科
关键词：Alzheimer病；β-淀粉样蛋白；血清；脑脊液；酶联免疫吸附试验
中国神经精神疾病杂志990215 【摘要】 目的 寻找阿尔茨海默病(AD)实验室特异性诊断指标。方法 运用灵敏的酶联免疫吸附试验(ELISA)，测定21例AD患者，14例多发性脑梗死性痴呆(MID)患者，32例对照组(NC)血清和脑脊液β-淀粉样蛋白(β-AP)的含量。结果 脑脊液中β-AP的含量存在有AD>MID>NC的趋势，而AD和MID比较无明显差异，二者和NC组比较均有统计学意义，β-AP含量与患者年龄在AD组有相关关系；血清中β-AP含量有AD>NC>MID的趋势，3组测定值间重叠较大，无法明确区分AD组与NC组，且β-AP含量与年龄、病程均无相关关系。结论 β-AP含量在AD患者脑脊液中明显增高，但在MID组亦增高，故单纯测定β-AP可为痴呆提供诊断依据，而作为AD的特异性诊断指标尚待进一步探讨。
, 百拇医药
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年智能障碍最常见的原因，目前无特异的实验诊断指标。研究发现，AD病人的非神经组织和血管内可检测出β-淀粉样蛋白(β-Amyloid Protein, β-AP)，且能通过血脑屏障导致脑血管和脑实质β-AP的沉积[1，2]。我们采用灵敏的ELISA法测定了血清和脑脊液中β-AP的含量，探讨其对AD的诊断意义。
1 对象与方法
1.1 研究对象
1.1.1 AD组：根据美国国立神经病及语言障碍和卒中研究所(NINCDS)和Alzheimer病及相关疾病协会(ADRDS)推荐的临床可能AD诊断标准，结合中国精神疾病分类方案与诊断标准第二版(CCMD-Ⅱ)，用简易精神状态检查和Hachinski缺血量表评分[3，4],经临床和CT证实，除外其它原因所致痴呆后诊断。共21例，男12例，女9例，年龄40～84岁，平均65.5岁。
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1.1.2 多发性脑梗死性痴呆组(Multi-infarct dementia, MID)：根据病史及结合上述评分并参照诊断标准[3]进行诊断。共14例，男12例，女2例，年龄58～83，平均69.5岁。
1.1.3 对照组(NC)：为本院非神经系统疾病、非免疫系统疾病的腰麻手术者，无卒中史及痴呆家族史。共32例，男22例，女10例，年龄42～78岁，平均60.5岁。
1.2 方法
鼠单抗β-AP用0.05mol/L,pH9.6的碳酸盐稀释成1∶50并包被，100 μL/孔，4℃过夜，次日用1%牛血清白蛋白封闭，200μL/孔，37℃温育1小时，然后加入标准β-AP和待测样本，血清稀释成与脑脊液总蛋白相当水平，空白对照用含0.1%的牛血清白蛋白0.02 mol/L,pH7.4的磷酸盐缓冲液，同上述条件温育，如下步骤亦如此，依次加入1∶600稀释的的兔多抗β-AP，1∶600稀释的生物素化羊抗兔IgG，1∶1200稀释的链霉素化辣根过氧化酶标记物，每步骤均37℃温育1小时，用洗板液洗板3～4次，最后加入底物液，10分钟后用2 mol/L的硫酸50 μL终止显色反应，SIGMA960型酶标仪490nm读取OD值，以标准β-AP浓度100～1 600 pg/100 μL范围制作标准曲线得到回归方程，换算样本中β-AP的含量。
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1.3 统计方法
组间均值差异显著性用t检验，组间率差异显著性用χ2检验。
2 结果
2.1 对照组血清、脑脊液β-AP含量
血清β-AP(μg/L)：平均值为2128±1971，取95%的个体范围上限为5371，大于者为阳性。脑脊液β-AP(μg/L)：平均值为7.484±4.211，取95%的个体范围上限为14.41，大于者为阳性。
2.2 结果分析
3组样本β-AP测定结果均值分析用t检验，见表1。阳性率分析用四格表χ2检验，见表2。
表1 3组β-AP测定结果的均值 分组
, http://www.100md.com
例数
β-AP均值
血清(μg/L)
脑脊液(μg/L)
NC
32
2128±3242
7.844±6.928
MID
14
1452±1184
16.588±16.2271)
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AD
21
3174±8494
16.625±33.7351)
1) 与对照组比较，P<0.01
表2 3组β-AP阳性率分析 分组
例数
β-AP阳性率
血清(%)
脑脊液(%)
NC
32
, 百拇医药
2(6.3)
2(6.3)
MID
14
0(0)
8(57.1)1)
AD
21
4(19.1)
8(38.1)1)
1) 与对照组比较，P<0.01
2.3 直线相关分析
, 百拇医药
血清中β-AP与年龄在3组间均无相关关系(P>0.05)，β-AP与病程在MID和AD组也无相关关系(P>0.05)；脑脊液中β-AP与年龄在NC和MID组无相关关系(P>0.05)，而在AD组与年龄有相关关系(r=0.543,P<0.01)，即随着年龄的增长β-AP浓度相应增高，β-AP与病程在MID和AD组均无相关关系(P>0.05)。
3 讨论
β-AP是由其前体蛋白APP衍化而来，目前研究指出大量的β-AP是加速淀粉沉积的必要条件，淀粉斑的结构依赖于β-AP的产生和清除，脑脊液淀粉样蛋白的水平可部分反映β-AP的产生和清除的平衡关系[5]。在以往的研究中发现，脑脊液和血清中均可测到β-AP，只是含量有所不同，在AD的改变，报告也不一致[5～9]。
我们的结果显示，血清中β-AP有AD>NC>MID的趋势，三组测定值存在较大的重叠，三组阳性率比较无显著性差异(P>0.05)，并且β-AP与年龄和病程均无相关关系，提示单独测定血清中β-AP难以明确区分痴呆患者和正常对照；脑脊液β-AP有AD>MID>NC的趋势，AD和MID的测定值明显高于对照组，三组测定的阳性率AD组和MID与NC组的差别具有统计学意义(P<0.05)，而AD和MID组比较无明显差异(P>0.05)，在AD组β-AP与年龄呈正相关，与病程无相关关系，其它二组与年龄和病程均无相关关系。与部分文献报道AD组β-AP浓度随痴呆程度加重相应降低的结果不同[7～9]，而与Cools等人的报道相一致[5，6]。在他们的报道中脑脊液β-AP浓度是血清3倍，而我们的结果显示血清β-AP的浓度较高。在他们的方法中使用的均是单克隆抗体，并且已将脑脊液进行了浓缩，血清和脑脊液中的总蛋白含量是不同的，而我们的方法中第二抗体为兔多抗β-AP，并且没有将脑脊液浓缩。从实验技术及理论上讲，测定血清和脑脊液中β-AP应在同样的条件下进行，血清和脑脊液中蛋白含量差值达数百倍，过高的蛋白必然会影响酶联反应，因而我们采用了将血清总蛋白稀释成与脑脊液总蛋白相同水平后再进行β-AP测定，受到的干扰会更少些，可比性会更强些，同时我们又将稀释血清中测定的值，按稀释倍数换算成原血清β-AP含量，这可能是导致我们测得血清中β-AP含量高于脑脊液中的原因。总之，我们认为，将血清稀释到与脑脊液总蛋白相当水平，再进行二者的β-AP测定显得更加合理些。由于同时测定血清和脑脊液β-AP的报道相对较少，究竟血清和脑脊液中β-AP处于怎样的水平有待确定，而单纯测定脑脊液中β-AP可为痴呆提供诊断依据，但作为AD的特异性诊断指标尚待进一步探讨。
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卫生部课题资助基金(批准号：94-1-246)
参考文献
1 Joachim CL, Mori H, Selkoe DJ.Amyloid β-protein depostion in tissues other than brain in Alzheimer's disease. Nature, 1989, 341(9):226
2 Mecocci P, Parnetti L, Reboldi GP, et al. Blood-brain-barrier in a geriatic population:barrer function indegenaration and vascular dementias. Acta Neurol Scand, 1991, 84(3):210
3 Mckhann G, Drachman D,Folstein M, et al. Clinical diagnosis of Alzhemer's disease:Report of the NINCDS-ADRDA work group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's disease. Neurology, 1984, 34(7):939
, 百拇医药
4 高素荣.阿尔茨海默病性痴呆.见：高素荣，袁锦楣，主编.痴呆诊疗学.北京：北京科学技术出版社，1998.33～78
5 Nakaumra T, Shoji M, Harigaya Y, et al. β-Amyloid protein levels in cerebrospinal fluid are elevated in early-onset Alzheimer's disease. Ann Neurol, 1994, 36(6):903
6 Van Gool WA, Schenk DB, Bolhuis PA. Concentrations of β-Amyloid protein in cerebrospinal fluid increase with age in patients free from neurodegeneration disease. Neurosci lett, 1994, 172(3):122
, 百拇医药
7 Pirttila P, Kim KS, Mehta PD, et al. Soluble amyloid β-protein in the cerebrospinal fluid from patients with Alzheimer's disease, vascular dementia and controls. J Neurol Sci, 1994, 127(7):90
8 Motter R, Vigo-Pelfrey C, Kholodenko D, et al. Reduction of β-amyloid peptide42 in the cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer's disease. Ann Neurol,1995, 38(4):643
9 Nitsh RM, Rebeck W, Deng M, et al. Cerebrospinal fluid levels of amyloid protein in Alzheimer's disease:Inverse correlation with severity of dementia and effect of Apolipoprotein E genotype. Ann Neurol, 1995, 37(4):512
(1998-04-06收稿), http://www.100md.com
单位：袁锦楣 郝洪军 李 静：北京医科大学第一临床学院神经病学研究中心免疫室 (100034)；王 磊 李海峰：研究生；金弘敏 冀成君：北京回龙观医院老年科
关键词：Alzheimer病；β-淀粉样蛋白；血清；脑脊液；酶联免疫吸附试验
中国神经精神疾病杂志990215 【摘要】 目的 寻找阿尔茨海默病(AD)实验室特异性诊断指标。方法 运用灵敏的酶联免疫吸附试验(ELISA)，测定21例AD患者，14例多发性脑梗死性痴呆(MID)患者，32例对照组(NC)血清和脑脊液β-淀粉样蛋白(β-AP)的含量。结果 脑脊液中β-AP的含量存在有AD>MID>NC的趋势，而AD和MID比较无明显差异，二者和NC组比较均有统计学意义，β-AP含量与患者年龄在AD组有相关关系；血清中β-AP含量有AD>NC>MID的趋势，3组测定值间重叠较大，无法明确区分AD组与NC组，且β-AP含量与年龄、病程均无相关关系。结论 β-AP含量在AD患者脑脊液中明显增高，但在MID组亦增高，故单纯测定β-AP可为痴呆提供诊断依据，而作为AD的特异性诊断指标尚待进一步探讨。
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阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年智能障碍最常见的原因，目前无特异的实验诊断指标。研究发现，AD病人的非神经组织和血管内可检测出β-淀粉样蛋白(β-Amyloid Protein, β-AP)，且能通过血脑屏障导致脑血管和脑实质β-AP的沉积[1，2]。我们采用灵敏的ELISA法测定了血清和脑脊液中β-AP的含量，探讨其对AD的诊断意义。
1 对象与方法
1.1 研究对象
1.1.1 AD组：根据美国国立神经病及语言障碍和卒中研究所(NINCDS)和Alzheimer病及相关疾病协会(ADRDS)推荐的临床可能AD诊断标准，结合中国精神疾病分类方案与诊断标准第二版(CCMD-Ⅱ)，用简易精神状态检查和Hachinski缺血量表评分[3，4],经临床和CT证实，除外其它原因所致痴呆后诊断。共21例，男12例，女9例，年龄40～84岁，平均65.5岁。
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1.1.2 多发性脑梗死性痴呆组(Multi-infarct dementia, MID)：根据病史及结合上述评分并参照诊断标准[3]进行诊断。共14例，男12例，女2例，年龄58～83，平均69.5岁。
1.1.3 对照组(NC)：为本院非神经系统疾病、非免疫系统疾病的腰麻手术者，无卒中史及痴呆家族史。共32例，男22例，女10例，年龄42～78岁，平均60.5岁。
1.2 方法
鼠单抗β-AP用0.05mol/L,pH9.6的碳酸盐稀释成1∶50并包被，100 μL/孔，4℃过夜，次日用1%牛血清白蛋白封闭，200μL/孔，37℃温育1小时，然后加入标准β-AP和待测样本，血清稀释成与脑脊液总蛋白相当水平，空白对照用含0.1%的牛血清白蛋白0.02 mol/L,pH7.4的磷酸盐缓冲液，同上述条件温育，如下步骤亦如此，依次加入1∶600稀释的的兔多抗β-AP，1∶600稀释的生物素化羊抗兔IgG，1∶1200稀释的链霉素化辣根过氧化酶标记物，每步骤均37℃温育1小时，用洗板液洗板3～4次，最后加入底物液，10分钟后用2 mol/L的硫酸50 μL终止显色反应，SIGMA960型酶标仪490nm读取OD值，以标准β-AP浓度100～1 600 pg/100 μL范围制作标准曲线得到回归方程，换算样本中β-AP的含量。
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1.3 统计方法
组间均值差异显著性用t检验，组间率差异显著性用χ2检验。
2 结果
2.1 对照组血清、脑脊液β-AP含量
血清β-AP(μg/L)：平均值为2128±1971，取95%的个体范围上限为5371，大于者为阳性。脑脊液β-AP(μg/L)：平均值为7.484±4.211，取95%的个体范围上限为14.41，大于者为阳性。
2.2 结果分析
3组样本β-AP测定结果均值分析用t检验，见表1。阳性率分析用四格表χ2检验，见表2。
表1 3组β-AP测定结果的均值 分组
, http://www.100md.com
例数
β-AP均值
血清(μg/L)
脑脊液(μg/L)
NC
32
2128±3242
7.844±6.928
MID
14
1452±1184
16.588±16.2271)
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AD
21
3174±8494
16.625±33.7351)
1) 与对照组比较，P<0.01
表2 3组β-AP阳性率分析 分组
例数
β-AP阳性率
血清(%)
脑脊液(%)
NC
32
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2(6.3)
2(6.3)
MID
14
0(0)
8(57.1)1)
AD
21
4(19.1)
8(38.1)1)
1) 与对照组比较，P<0.01
2.3 直线相关分析
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血清中β-AP与年龄在3组间均无相关关系(P>0.05)，β-AP与病程在MID和AD组也无相关关系(P>0.05)；脑脊液中β-AP与年龄在NC和MID组无相关关系(P>0.05)，而在AD组与年龄有相关关系(r=0.543,P<0.01)，即随着年龄的增长β-AP浓度相应增高，β-AP与病程在MID和AD组均无相关关系(P>0.05)。
3 讨论
β-AP是由其前体蛋白APP衍化而来，目前研究指出大量的β-AP是加速淀粉沉积的必要条件，淀粉斑的结构依赖于β-AP的产生和清除，脑脊液淀粉样蛋白的水平可部分反映β-AP的产生和清除的平衡关系[5]。在以往的研究中发现，脑脊液和血清中均可测到β-AP，只是含量有所不同，在AD的改变，报告也不一致[5～9]。
我们的结果显示，血清中β-AP有AD>NC>MID的趋势，三组测定值存在较大的重叠，三组阳性率比较无显著性差异(P>0.05)，并且β-AP与年龄和病程均无相关关系，提示单独测定血清中β-AP难以明确区分痴呆患者和正常对照；脑脊液β-AP有AD>MID>NC的趋势，AD和MID的测定值明显高于对照组，三组测定的阳性率AD组和MID与NC组的差别具有统计学意义(P<0.05)，而AD和MID组比较无明显差异(P>0.05)，在AD组β-AP与年龄呈正相关，与病程无相关关系，其它二组与年龄和病程均无相关关系。与部分文献报道AD组β-AP浓度随痴呆程度加重相应降低的结果不同[7～9]，而与Cools等人的报道相一致[5，6]。在他们的报道中脑脊液β-AP浓度是血清3倍，而我们的结果显示血清β-AP的浓度较高。在他们的方法中使用的均是单克隆抗体，并且已将脑脊液进行了浓缩，血清和脑脊液中的总蛋白含量是不同的，而我们的方法中第二抗体为兔多抗β-AP，并且没有将脑脊液浓缩。从实验技术及理论上讲，测定血清和脑脊液中β-AP应在同样的条件下进行，血清和脑脊液中蛋白含量差值达数百倍，过高的蛋白必然会影响酶联反应，因而我们采用了将血清总蛋白稀释成与脑脊液总蛋白相同水平后再进行β-AP测定，受到的干扰会更少些，可比性会更强些，同时我们又将稀释血清中测定的值，按稀释倍数换算成原血清β-AP含量，这可能是导致我们测得血清中β-AP含量高于脑脊液中的原因。总之，我们认为，将血清稀释到与脑脊液总蛋白相当水平，再进行二者的β-AP测定显得更加合理些。由于同时测定血清和脑脊液β-AP的报道相对较少，究竟血清和脑脊液中β-AP处于怎样的水平有待确定，而单纯测定脑脊液中β-AP可为痴呆提供诊断依据，但作为AD的特异性诊断指标尚待进一步探讨。
, 百拇医药
卫生部课题资助基金(批准号：94-1-246)
参考文献
1 Joachim CL, Mori H, Selkoe DJ.Amyloid β-protein depostion in tissues other than brain in Alzheimer's disease. Nature, 1989, 341(9):226
2 Mecocci P, Parnetti L, Reboldi GP, et al. Blood-brain-barrier in a geriatic population:barrer function indegenaration and vascular dementias. Acta Neurol Scand, 1991, 84(3):210
3 Mckhann G, Drachman D,Folstein M, et al. Clinical diagnosis of Alzhemer's disease:Report of the NINCDS-ADRDA work group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's disease. Neurology, 1984, 34(7):939
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4 高素荣.阿尔茨海默病性痴呆.见：高素荣，袁锦楣，主编.痴呆诊疗学.北京：北京科学技术出版社，1998.33～78
5 Nakaumra T, Shoji M, Harigaya Y, et al. β-Amyloid protein levels in cerebrospinal fluid are elevated in early-onset Alzheimer's disease. Ann Neurol, 1994, 36(6):903
6 Van Gool WA, Schenk DB, Bolhuis PA. Concentrations of β-Amyloid protein in cerebrospinal fluid increase with age in patients free from neurodegeneration disease. Neurosci lett, 1994, 172(3):122
, 百拇医药
7 Pirttila P, Kim KS, Mehta PD, et al. Soluble amyloid β-protein in the cerebrospinal fluid from patients with Alzheimer's disease, vascular dementia and controls. J Neurol Sci, 1994, 127(7):90
8 Motter R, Vigo-Pelfrey C, Kholodenko D, et al. Reduction of β-amyloid peptide42 in the cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer's disease. Ann Neurol,1995, 38(4):643
9 Nitsh RM, Rebeck W, Deng M, et al. Cerebrospinal fluid levels of amyloid protein in Alzheimer's disease:Inverse correlation with severity of dementia and effect of Apolipoprotein E genotype. Ann Neurol, 1995, 37(4):512
(1998-04-06收稿), http://www.100md.com