肺癌患者肺泡巨噬细胞一氧化氮合酶mRNA 表达及其抗肿瘤活性研究
作者：胡成平 李固本 李桂源
单位：胡成平 李固本(湖南医科大学附属湘雅医院(长沙 410008)；李桂源(湖南医科大学肿瘤研究所)
关键词：肺肿瘤；巨噬细胞；iNOS mRNA；一氧化氮
肿瘤990205 目的 了解一氧化氮(NO)在肺癌患者肺泡巨噬细胞(AM)抗肿瘤功能的作用以及AM NO活性。 方法 通过支气管肺泡灌洗(BAL)获取人AM；MTT法观察一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂L-单甲基精氨酸(LNMMA)对AM细胞毒功能的影响；镀铜镉还原——Griess法检测AM培养上清液、支气管肺泡灌洗液(BALF)中NO含量；RT-PCR技术测定AM iNOS mRNA表达。 结果 (1)在LNMMA存在条件下，肺癌患者AM细胞毒作用明显减弱(43% vs 21%,P<0.001)。(2)肺癌患者荷瘤侧肺BALF及AM培养上清液中NO含量均明显低于非荷瘤侧肺(P<0.05，P<0.01)，更低于对照组(P<0.001，P<0.01)。(3)AM表达iNOS mRNA，肺癌组(41%)明显低于对照组(78%，P<0.05)。(4)经粒一巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激后肺癌患者AM细胞毒作用增强，iNOA mRNA表达增加(41% vs 68%，P<0.01)且NO生成增多(63 nmol/L vs 85 nmol/L,P<0.001)，但后者仍低于对照组(P<0.05，P<0.01)。 结论 NO在肺癌患者AM介导的抗肿瘤效应中起着重要作用；肺癌患者AM生成NO的能力低下，反映肿瘤局部AM抗肿瘤功能可能存在某些缺陷；GM-CSF可激活肺癌患者AM，使其功能增强。
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EXPRESSION OF NITRIC OXIDE SYNTHASE mRNA
AND ANTITUMOR ACTIVITY OF ALVEOLAR MACROPHAGES
FROM LUNG CANCER PATIENTS
Hu Chengping,Li Guben,Li Guiyuan.Xiangya Hospital,Hunan Medical University,Changsha 410008
Objective：The role of nitric oxide(NO)as an effector of alveolar macrophages(AMs) mediated tumoricidal activity and the mRNA expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) on AMs were investigated.Methods：AMs were obtained from 27 patients with primary lung cancer and 18 control cases with nonmalignant pulmonary diseases by bronchoalveolar lavage (BAL). The tumoricidal effect of AM was compared by using MTT in the presence or absence of NG-monomethyl-L-arginine(LNMMA).Nitrite and nitrate(NO-2/NO-3)in original BAL fluid (BALF) and cell free supernatant were measured. AMs were analyzed for mRNA expression of iNOS by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).Results：On the presence of LNMMA the cytotoxicity exhibited by AMs significantly decreased(P<0.001).The level of NO-2/NO-3 was lower in both BALF and supernatants from the tumor bearing lung than from nontumor-bearing lung P<0.01，P<0.05 ,and was much lower than control P<0.001,P<0.01.The iNOS mRNA expressed in AMs from 9/22(41%) patients with lung cancer and 14/18(78%) controls(P<0.005).After treating with GM-CSF,lung cancer AMs demonstrated enhanced cytotoxicity (P<0.001) and increased expression rates in iNOS mRNA.The level of NO-2/NO-3 in cell free supernatants was significantly increased (P<0.001).However the expression rates and levels of NO-2/NO-3 were still lower in lung cancer patients than in control.Conclusion：NO plays an important role in AM mediated tumor cell cytotoxicity.There may be existed some defective AMs in tumor region. The expression of iNOS mRNA of AMs can be increased and cytotoxicity of AMs can be enhanced in vitro by GM-CSF stimulation.
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Key words Pulmonary neoplasm Macrophage iNOS mRNA Nitric oxide
活化的巨噬细胞(M)分泌一氧化氧(NO)，而NO又可介导M的抗肿瘤效应，已被越来越多的动物研究证实[1]。然而，关于人肺泡巨噬细胞(AM)合成分泌NO的状况及NO在人AM抗肿瘤中的作用，国外报道甚少，国内目前尚未见报道。因此，本项工作从整体、细胞、分子三个不同水平研究肺癌患者AM NO活性以及NO介导AM细胞毒活性，旨在为肺部肿瘤免疫及临床治疗开辟新的途径。
材料与方法
1.研究对象 肺癌患者27例均经病理学证实，其中鳞癌16例、腺癌7例、小细胞未分化癌4例。男22例，女5例。年龄40岁～75岁，平均58岁。对照组18例，其中15例经胸片、CT、纤维支气管镜(纤支镜)检查诊断为支气管炎症，3例无支气管肺疾病。男15例，女3例。年龄23岁～69岁，平均36岁。
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2.靶细胞 选用人肺腺癌细胞株(A59)细胞。
3.AM的获取与培养 在局麻下用纤支镜行支气管肺泡灌洗(BAL)术。肺癌患者根据胸片或CT及纤支镜检查确定荷瘤侧肺、非荷瘤侧肺、灌洗肺段选择右中叶或左舌叶，若该肺段因肿瘤阻塞、明显出血等原因不能灌洗，则选择非荷瘤侧肺。每例患者灌洗总量为150 ml。回收的BAL液(BALF)离心后上清-70℃贮存待测。沉淀细胞用RPMI 1640液重悬，苔盼蓝染色计数活细胞。粘附法去除非粘附细胞，获得纯化的AM，经计数后取等量细胞进行配对研究。一组加用粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)，1 mg/L)，另一组加同体积Hanks液，培养24 h后收集上清-70 ℃贮存待检。AM置液氮冻存。
4.AM细胞毒功能测定 采用MTT比色法[2]。效靶细胞比为10∶1。设4组，即空白对照组，仅含A59细胞；未刺激组，含AM和A59细胞；GM-CSF刺激组，含GM-CSF(1 mg/L)和效靶细胞；脂多糖(LPS)刺激组为阳性对照，效靶细胞加LPS(250 μg/L)。每组10个平行孔，其中5孔加L单甲基精氨酸(LNMMA)300 μmol，另5孔为对照。杀伤率=1-实验孔A/对照孔A×100%。
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5.BAL及AM培养上清液中NO-2/NO-3含量测定 采用镀铜镉还原-Griess法[3]。
6.AM诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达 AM总RNA制备和逆转录分别按GIBCO、Promega公司试剂盒说明书操作。PCR扩增：iNOS基因引物由中科院上海细胞生物学所合成，序列为：上游5′-ACCGAGGCAAACAGCACATTCA-3′，下游5′-GGGTTGGGGGTGTGGTGATGT-3′。内对照选用β-actin基因。50 μl PCR反应体系中含KCl 50 mmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，Tris.HCl 10 mmol/L，dTNPs 0.2 mmol/L，引物各50 pmol，模板cDNA 0.2 μg，Taq酶2.5 U，石蜡油覆盖。PCR反应参数为：94 ℃ 60 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，共35个循环。阴性对照用蒸馏水取代cDNA。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，表达iNOS mRNA(阳性)样品可见2条带，分别为462 bp和284 bp，阴性样品仅见内对照带。
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7.统计学处理 在SPSS/PC+软件包上进行。方差分析比较多组间AM对A59细胞杀伤率差异及多组间BALF、AM培养上清中NO-2/NO-3含量差异的显著性。配对t检验比较刺激与否差异的显著性。χ2检验比较两组AM iNOS mRNA表达阳性率差异的显著性。
结 果
一、NO介导的肺癌患者AM对A59细胞的杀伤作用 经GM-CSF或LPS刺激后肺癌患者AM对A59细胞有明显的杀伤作用，与未刺激组相比差异显著(均为P<0.001)，但加入LNMMA后其杀伤作用明显减弱，差异有高度显著性(P<0.001)(见表1)。
表1 肺癌患者AM对A59细胞的细胞毒作用 组 别
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n
杀伤率(%)(
±s)
无L-NMMA
L-NMMA
未刺激组
25
14.35±4.31
15.78±1.88
GM-CSF刺激组
25
43.52±2.98①
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21.11±2.64②④
LPS刺激组
25
41.59±4.92①
24.38±2.80③④
注：与未刺激组比①P<0.001，②P<0.01，③P<0.05
与无L-NMMA比，④P<0.001
二、BALF中NO-2/NO-3含量 肺癌患者荷瘤侧肺BALF中NO-2/NO-3含量均低于非荷瘤侧肺，更低于对照组，而非荷瘤侧肺与对照组相比差异无显著性(见表2)。
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表2 BALF中NO-2/NO-3含量(nmol/mg白蛋白) 组 别
例数
NO-2/NO-3(±s)
肺癌组 荷瘤侧肺
11
2.47±0.67①②
非荷瘤侧肺
11
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4.65±1.46
对照组
18
5.12±1.11
注：与对照组比①P<0.001，与非荷瘤侧肺比②P<0.01
三、AM培养上清液中NO-2/NO-3含量 AM经体外培养24 h后，其上清液中均可测到NO-2/NO-3，但来自荷瘤侧肺AM的培养上清中，NO-2/NO-3含量远低于非荷瘤侧肺与对照组。若AM经GM-CSF刺激后其培养上清液中NO-2/NO-3含量明显升高(见表3)。然而，非荷瘤侧肺与对照组AM培养上清液NO-2/NO-3水平则无明显差别，P>0.05。
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表3 肺癌及对照组患者AM培养上清液中NO-2/NO-3含量±s 组 别
例数
NO-2/NO-3(nmol/L)
未刺激
GM-CSF刺激
肺癌组
荷瘤侧肺
11
63.37±17.58①②
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85.06±11.22①②③
非荷瘤侧肺
11
85.61±16.70
100.85±15.99④
对照组
18
95.03±21.76
103.28±22.91
注：与对照组比①P<0.01，与非荷瘤侧肺比②P<0.05，与未刺激组比③P<0.001，④P<0.01 四、AM iNOS mRNA表达分析 在无GM-CSF刺激时9/22例(41%)肺癌患者，14/18例(78%)对照组AM出现iNOS电泳带(附图)，两组阳性率差异显著，P<0.005。经GM-CSF刺激后其阳性率两组均有升高，分别为68%(15/22)、100%，差异有统计学意义(P<0.005)。并且与未刺激时相比，肺癌组AM iNOS mRNA表达明显增加P<0.01，而对照组虽有升高但其差异无显著性，P>0.05。
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附图 AM iNOS mRNA RT-PCR电泳结果
M.为标准分子量DNA
1.为肺癌组表达阳性样品；2.为对照组表达阳性样品
3.为肺癌组表达阴性样品；4.为对照组表达阴性样品
5.为蒸馏水对照样品
五、肺癌患者AM培养上清液中NO-2/NO-3含量与肺癌病理类型的关系 在无GM-CSF刺激下鳞癌、腺癌及小细胞未分化癌患者AM培养上清中NO-2/NO-3含量无显著差异。经GM-CSF刺激后鳞癌与小细胞未分化癌NO-2/NO-3水平明显升高，而腺癌则升高不明显(P>0.05)，且低于鳞癌与小细胞未分化癌(表4)。
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表4 不同病理类型肺癌AM培养上清液中NO-2/NO-3浓度 组 别
例数
NO-2/NO-3(nmol/L)(±s)
未刺激
GM-CSF刺激
鳞 癌
14
82.36±14.52
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102.14±13.28③
腺 癌
4
70.60±20.34
80.55±18.01①②
小细胞未分化癌
4
70.58±19.78
94.52±13.56④
注：与鳞癌比较①P<0.05，与小细胞未分化癌比较②P<0.05，与同组未刺激组比③P<0.002，④P<0.05 讨 论
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1991年Denis[4]首先报道人Mφ可以产生NO，Nicholson[5]等也发现结核病患者AM表达iNOS。本实验结果说明肺内有NO存在，同时还发现肺癌患者荷瘤侧肺NO水平低于非荷瘤侧肺，更低于对照组。细胞水平研究表明，肺癌患者荷瘤侧肺AM产生NO的能力明显低于非荷瘤侧肺与对照组。由此可见，肺癌患者整体状态肿瘤局部NO含量下降与细胞水平AM NO生成减少相一致。提示肺癌患者肿瘤局部AM产生NO能力低下可能是造成其NO浓度降低的主要原因之一。
NO的生成必需一氧化氮合酶(NOS)催化，因此，NOS活性高低直接影响NO生成的多少。本实验发现肺癌患者AM iNOS mRNA表达阳性率显著低于对照组，提示肺癌患者AM NOS基因表达减弱。由此推断，肺癌患者细胞水平NO生成能力低下可能与其分子水平iNOS mRNA表达减弱有关。
活化Mφ具有抗肿瘤效应，但其机制尚不完全清楚。自肿瘤坏死因子(TNF)发现以来，人们一直认为它是致靶细胞裂解的主要因子。近年研究发现活化的Mφ在缺乏L-精氨酸或阻断NOS的培养条件下，其细胞毒作用不能表达出来[6]。Higuchi[7]报道活化Mφ产生的NO对P185系细胞有很强的细胞毒性，若从培养基中去除L-精氨酸，其作用则显著受抑，同时伴有NO减少。本实验发现肺癌患者AM经GM-CSF或LPS刺激后，对人肺腺癌细胞株细胞具有明显的细胞毒活性。当在培养基中加入NOS抑制剂时，AM对靶细胞的杀伤率明显减低。说明NO在肺癌患者AM细胞毒效应中具有重要作用，可能也是活化AM抗肿瘤功能机理之一。因此，AM产生NO活性高低在一定程度上反映肺癌患者AM抗肿瘤功能的强弱。本研究结果显示，肺癌患者荷瘤侧肺BALF与AM培养上清中NO含量减少，AM iNOS mRNA表达低下，提示肺癌患者肿瘤局部AM抗肿瘤功能存在缺陷。然而，这种缺陷的机理目前尚不清楚。
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近年研究发现GM-CSF除具有造血刺激作用外，还具杀肿瘤功能，其机理不完全清楚。Hill[8]等将GM-CSF用于Lewis肺癌小鼠，结果发现其腹腔M产生NO明显增加，肿瘤体积明显缩小。本研究显示肺癌患者AM经GM-CSF刺激后，细胞毒活性明显高于未刺激组，同时，iNOS基因表达增强，NO分泌增多，说明肺癌患者AM的NO活性及其细胞毒作用均可被GM-CSF刺激而增强，提示GM-CSF对肿瘤尤其是实体瘤细胞的杀伤作用可能与诱导AM产生NO有关。
肺鳞癌、腺癌、小细胞未分化癌患者AM虽对GM-CSF刺激均有反应，但鳞癌者AM反应最强，腺癌则不明显。可能不同病理类型肺癌患者AM对GM-CSF刺激的反应也存在差异。Bennett[9]对171例肺癌患者癌组织及正常肺组织进行研究发现，肺癌组织中的前列腺素样物质明显高于正常组织，且不同类型肺癌所产生的前列腺素样物质的量差别很大，其中腺癌产生的量最多。本实验中经GM-CSF刺激后腺癌患者AM生成NO的活性明显低于鳞癌与小细胞未分化癌患者，这是否与不同类型肺癌细胞分泌的抑制因子或其他免疫抑制物的量存在差异有关，或者与不同类型肺癌者AM本身膜通道调节与受体表达不同有关，值得进一步研究。
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第一作者简介 胡成平，女，博士，副教授，硕士导师。
参 考 文 献
1 Kimberly JP,Laskin JD,Shuler RL, et al. Enhanced production of nitric oxide by rat alveolar macrophages after inhalation of a pulmonary irritant is associated with increased expression of nitric oxide synthase.J Immunol,1993,151:7196
2 Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival.J Immunolo Med,1983,65:55
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3 茅惠明.血清中硝酸盐的镀铜镉还原测定法.临床检验杂志，1995，13(1)：6
4 Denis M.Tumor necrosis factor and granulocyte macrophage colony stimulating factor stumulate human macrophage to restrict growth of virulent Mycobacterium aviam and to kill avirulent M avium.J Leukoc Biol,1991,49:380
5 Nicholson S,Bonecini Almeida MG,Silva JRL,et al. Inducible nitric oxide synthase in pulmonary alveolar macrophages from patient with tuberculosis.J Exp Med,1996,183(5);2293
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6 Hibbs JB,Taintor RR,Varin Z. Macrophage cytotoxicity:Role of L-arginine deiminase and imino nitrogen oxidation to nitrite.Science,1987,235:473
7 Higuchi M,Higashi N,Taki H, et al. Cytolytic mechanisms of activated macrophages.J Immunolo,1990,144(4):1425
8 Hill ADK,Redmond HP,Austin OM, et al. Granulocyte macrophage colony stimulating factor inhibits tumor growth.Br J Surg,1993,80:1543
9 Bennett A,Carroll MA,Stamford IF, et al. Prostaglandins and human lung carcinomas.Br J Cancer,1982,46:888
(收稿：1998-01-22), 百拇医药
单位：胡成平 李固本(湖南医科大学附属湘雅医院(长沙 410008)；李桂源(湖南医科大学肿瘤研究所)
关键词：肺肿瘤；巨噬细胞；iNOS mRNA；一氧化氮
肿瘤990205 目的 了解一氧化氮(NO)在肺癌患者肺泡巨噬细胞(AM)抗肿瘤功能的作用以及AM NO活性。 方法 通过支气管肺泡灌洗(BAL)获取人AM；MTT法观察一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂L-单甲基精氨酸(LNMMA)对AM细胞毒功能的影响；镀铜镉还原——Griess法检测AM培养上清液、支气管肺泡灌洗液(BALF)中NO含量；RT-PCR技术测定AM iNOS mRNA表达。 结果 (1)在LNMMA存在条件下，肺癌患者AM细胞毒作用明显减弱(43% vs 21%,P<0.001)。(2)肺癌患者荷瘤侧肺BALF及AM培养上清液中NO含量均明显低于非荷瘤侧肺(P<0.05，P<0.01)，更低于对照组(P<0.001，P<0.01)。(3)AM表达iNOS mRNA，肺癌组(41%)明显低于对照组(78%，P<0.05)。(4)经粒一巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激后肺癌患者AM细胞毒作用增强，iNOA mRNA表达增加(41% vs 68%，P<0.01)且NO生成增多(63 nmol/L vs 85 nmol/L,P<0.001)，但后者仍低于对照组(P<0.05，P<0.01)。 结论 NO在肺癌患者AM介导的抗肿瘤效应中起着重要作用；肺癌患者AM生成NO的能力低下，反映肿瘤局部AM抗肿瘤功能可能存在某些缺陷；GM-CSF可激活肺癌患者AM，使其功能增强。
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AND ANTITUMOR ACTIVITY OF ALVEOLAR MACROPHAGES
FROM LUNG CANCER PATIENTS
Hu Chengping,Li Guben,Li Guiyuan.Xiangya Hospital,Hunan Medical University,Changsha 410008
Objective：The role of nitric oxide(NO)as an effector of alveolar macrophages(AMs) mediated tumoricidal activity and the mRNA expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) on AMs were investigated.Methods：AMs were obtained from 27 patients with primary lung cancer and 18 control cases with nonmalignant pulmonary diseases by bronchoalveolar lavage (BAL). The tumoricidal effect of AM was compared by using MTT in the presence or absence of NG-monomethyl-L-arginine(LNMMA).Nitrite and nitrate(NO-2/NO-3)in original BAL fluid (BALF) and cell free supernatant were measured. AMs were analyzed for mRNA expression of iNOS by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).Results：On the presence of LNMMA the cytotoxicity exhibited by AMs significantly decreased(P<0.001).The level of NO-2/NO-3 was lower in both BALF and supernatants from the tumor bearing lung than from nontumor-bearing lung P<0.01，P<0.05 ,and was much lower than control P<0.001,P<0.01.The iNOS mRNA expressed in AMs from 9/22(41%) patients with lung cancer and 14/18(78%) controls(P<0.005).After treating with GM-CSF,lung cancer AMs demonstrated enhanced cytotoxicity (P<0.001) and increased expression rates in iNOS mRNA.The level of NO-2/NO-3 in cell free supernatants was significantly increased (P<0.001).However the expression rates and levels of NO-2/NO-3 were still lower in lung cancer patients than in control.Conclusion：NO plays an important role in AM mediated tumor cell cytotoxicity.There may be existed some defective AMs in tumor region. The expression of iNOS mRNA of AMs can be increased and cytotoxicity of AMs can be enhanced in vitro by GM-CSF stimulation.
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Key words Pulmonary neoplasm Macrophage iNOS mRNA Nitric oxide
活化的巨噬细胞(M)分泌一氧化氧(NO)，而NO又可介导M的抗肿瘤效应，已被越来越多的动物研究证实[1]。然而，关于人肺泡巨噬细胞(AM)合成分泌NO的状况及NO在人AM抗肿瘤中的作用，国外报道甚少，国内目前尚未见报道。因此，本项工作从整体、细胞、分子三个不同水平研究肺癌患者AM NO活性以及NO介导AM细胞毒活性，旨在为肺部肿瘤免疫及临床治疗开辟新的途径。
材料与方法
1.研究对象 肺癌患者27例均经病理学证实，其中鳞癌16例、腺癌7例、小细胞未分化癌4例。男22例，女5例。年龄40岁～75岁，平均58岁。对照组18例，其中15例经胸片、CT、纤维支气管镜(纤支镜)检查诊断为支气管炎症，3例无支气管肺疾病。男15例，女3例。年龄23岁～69岁，平均36岁。
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2.靶细胞 选用人肺腺癌细胞株(A59)细胞。
3.AM的获取与培养 在局麻下用纤支镜行支气管肺泡灌洗(BAL)术。肺癌患者根据胸片或CT及纤支镜检查确定荷瘤侧肺、非荷瘤侧肺、灌洗肺段选择右中叶或左舌叶，若该肺段因肿瘤阻塞、明显出血等原因不能灌洗，则选择非荷瘤侧肺。每例患者灌洗总量为150 ml。回收的BAL液(BALF)离心后上清-70℃贮存待测。沉淀细胞用RPMI 1640液重悬，苔盼蓝染色计数活细胞。粘附法去除非粘附细胞，获得纯化的AM，经计数后取等量细胞进行配对研究。一组加用粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)，1 mg/L)，另一组加同体积Hanks液，培养24 h后收集上清-70 ℃贮存待检。AM置液氮冻存。
4.AM细胞毒功能测定 采用MTT比色法[2]。效靶细胞比为10∶1。设4组，即空白对照组，仅含A59细胞；未刺激组，含AM和A59细胞；GM-CSF刺激组，含GM-CSF(1 mg/L)和效靶细胞；脂多糖(LPS)刺激组为阳性对照，效靶细胞加LPS(250 μg/L)。每组10个平行孔，其中5孔加L单甲基精氨酸(LNMMA)300 μmol，另5孔为对照。杀伤率=1-实验孔A/对照孔A×100%。
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5.BAL及AM培养上清液中NO-2/NO-3含量测定 采用镀铜镉还原-Griess法[3]。
6.AM诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达 AM总RNA制备和逆转录分别按GIBCO、Promega公司试剂盒说明书操作。PCR扩增：iNOS基因引物由中科院上海细胞生物学所合成，序列为：上游5′-ACCGAGGCAAACAGCACATTCA-3′，下游5′-GGGTTGGGGGTGTGGTGATGT-3′。内对照选用β-actin基因。50 μl PCR反应体系中含KCl 50 mmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，Tris.HCl 10 mmol/L，dTNPs 0.2 mmol/L，引物各50 pmol，模板cDNA 0.2 μg，Taq酶2.5 U，石蜡油覆盖。PCR反应参数为：94 ℃ 60 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，共35个循环。阴性对照用蒸馏水取代cDNA。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，表达iNOS mRNA(阳性)样品可见2条带，分别为462 bp和284 bp，阴性样品仅见内对照带。
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7.统计学处理 在SPSS/PC+软件包上进行。方差分析比较多组间AM对A59细胞杀伤率差异及多组间BALF、AM培养上清中NO-2/NO-3含量差异的显著性。配对t检验比较刺激与否差异的显著性。χ2检验比较两组AM iNOS mRNA表达阳性率差异的显著性。
结 果
一、NO介导的肺癌患者AM对A59细胞的杀伤作用 经GM-CSF或LPS刺激后肺癌患者AM对A59细胞有明显的杀伤作用，与未刺激组相比差异显著(均为P<0.001)，但加入LNMMA后其杀伤作用明显减弱，差异有高度显著性(P<0.001)(见表1)。
表1 肺癌患者AM对A59细胞的细胞毒作用 组 别
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n
杀伤率(%)(
±s)无L-NMMA
L-NMMA
未刺激组
25
14.35±4.31
15.78±1.88
GM-CSF刺激组
25
43.52±2.98①
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21.11±2.64②④
LPS刺激组
25
41.59±4.92①
24.38±2.80③④
注：与未刺激组比①P<0.001，②P<0.01，③P<0.05
与无L-NMMA比，④P<0.001
二、BALF中NO-2/NO-3含量 肺癌患者荷瘤侧肺BALF中NO-2/NO-3含量均低于非荷瘤侧肺，更低于对照组，而非荷瘤侧肺与对照组相比差异无显著性(见表2)。
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表2 BALF中NO-2/NO-3含量(nmol/mg白蛋白) 组 别
例数
NO-2/NO-3(
±s)肺癌组 荷瘤侧肺
11
2.47±0.67①②
非荷瘤侧肺
11
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4.65±1.46
对照组
18
5.12±1.11
注：与对照组比①P<0.001，与非荷瘤侧肺比②P<0.01
三、AM培养上清液中NO-2/NO-3含量 AM经体外培养24 h后，其上清液中均可测到NO-2/NO-3，但来自荷瘤侧肺AM的培养上清中，NO-2/NO-3含量远低于非荷瘤侧肺与对照组。若AM经GM-CSF刺激后其培养上清液中NO-2/NO-3含量明显升高(见表3)。然而，非荷瘤侧肺与对照组AM培养上清液NO-2/NO-3水平则无明显差别，P>0.05。
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表3 肺癌及对照组患者AM培养上清液中NO-2/NO-3含量
±s 组 别例数
NO-2/NO-3(nmol/L)
未刺激
GM-CSF刺激
肺癌组
荷瘤侧肺
11
63.37±17.58①②
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85.06±11.22①②③
非荷瘤侧肺
11
85.61±16.70
100.85±15.99④
对照组
18
95.03±21.76
103.28±22.91
注：与对照组比①P<0.01，与非荷瘤侧肺比②P<0.05，与未刺激组比③P<0.001，④P<0.01 四、AM iNOS mRNA表达分析 在无GM-CSF刺激时9/22例(41%)肺癌患者，14/18例(78%)对照组AM出现iNOS电泳带(附图)，两组阳性率差异显著，P<0.005。经GM-CSF刺激后其阳性率两组均有升高，分别为68%(15/22)、100%，差异有统计学意义(P<0.005)。并且与未刺激时相比，肺癌组AM iNOS mRNA表达明显增加P<0.01，而对照组虽有升高但其差异无显著性，P>0.05。
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附图 AM iNOS mRNA RT-PCR电泳结果
M.为标准分子量DNA
1.为肺癌组表达阳性样品；2.为对照组表达阳性样品
3.为肺癌组表达阴性样品；4.为对照组表达阴性样品
5.为蒸馏水对照样品
五、肺癌患者AM培养上清液中NO-2/NO-3含量与肺癌病理类型的关系 在无GM-CSF刺激下鳞癌、腺癌及小细胞未分化癌患者AM培养上清中NO-2/NO-3含量无显著差异。经GM-CSF刺激后鳞癌与小细胞未分化癌NO-2/NO-3水平明显升高，而腺癌则升高不明显(P>0.05)，且低于鳞癌与小细胞未分化癌(表4)。
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表4 不同病理类型肺癌AM培养上清液中NO-2/NO-3浓度 组 别
例数
NO-2/NO-3(nmol/L)(
±s)未刺激
GM-CSF刺激
鳞 癌
14
82.36±14.52
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102.14±13.28③
腺 癌
4
70.60±20.34
80.55±18.01①②
小细胞未分化癌
4
70.58±19.78
94.52±13.56④
注：与鳞癌比较①P<0.05，与小细胞未分化癌比较②P<0.05，与同组未刺激组比③P<0.002，④P<0.05 讨 论
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1991年Denis[4]首先报道人Mφ可以产生NO，Nicholson[5]等也发现结核病患者AM表达iNOS。本实验结果说明肺内有NO存在，同时还发现肺癌患者荷瘤侧肺NO水平低于非荷瘤侧肺，更低于对照组。细胞水平研究表明，肺癌患者荷瘤侧肺AM产生NO的能力明显低于非荷瘤侧肺与对照组。由此可见，肺癌患者整体状态肿瘤局部NO含量下降与细胞水平AM NO生成减少相一致。提示肺癌患者肿瘤局部AM产生NO能力低下可能是造成其NO浓度降低的主要原因之一。
NO的生成必需一氧化氮合酶(NOS)催化，因此，NOS活性高低直接影响NO生成的多少。本实验发现肺癌患者AM iNOS mRNA表达阳性率显著低于对照组，提示肺癌患者AM NOS基因表达减弱。由此推断，肺癌患者细胞水平NO生成能力低下可能与其分子水平iNOS mRNA表达减弱有关。
活化Mφ具有抗肿瘤效应，但其机制尚不完全清楚。自肿瘤坏死因子(TNF)发现以来，人们一直认为它是致靶细胞裂解的主要因子。近年研究发现活化的Mφ在缺乏L-精氨酸或阻断NOS的培养条件下，其细胞毒作用不能表达出来[6]。Higuchi[7]报道活化Mφ产生的NO对P185系细胞有很强的细胞毒性，若从培养基中去除L-精氨酸，其作用则显著受抑，同时伴有NO减少。本实验发现肺癌患者AM经GM-CSF或LPS刺激后，对人肺腺癌细胞株细胞具有明显的细胞毒活性。当在培养基中加入NOS抑制剂时，AM对靶细胞的杀伤率明显减低。说明NO在肺癌患者AM细胞毒效应中具有重要作用，可能也是活化AM抗肿瘤功能机理之一。因此，AM产生NO活性高低在一定程度上反映肺癌患者AM抗肿瘤功能的强弱。本研究结果显示，肺癌患者荷瘤侧肺BALF与AM培养上清中NO含量减少，AM iNOS mRNA表达低下，提示肺癌患者肿瘤局部AM抗肿瘤功能存在缺陷。然而，这种缺陷的机理目前尚不清楚。
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近年研究发现GM-CSF除具有造血刺激作用外，还具杀肿瘤功能，其机理不完全清楚。Hill[8]等将GM-CSF用于Lewis肺癌小鼠，结果发现其腹腔M产生NO明显增加，肿瘤体积明显缩小。本研究显示肺癌患者AM经GM-CSF刺激后，细胞毒活性明显高于未刺激组，同时，iNOS基因表达增强，NO分泌增多，说明肺癌患者AM的NO活性及其细胞毒作用均可被GM-CSF刺激而增强，提示GM-CSF对肿瘤尤其是实体瘤细胞的杀伤作用可能与诱导AM产生NO有关。
肺鳞癌、腺癌、小细胞未分化癌患者AM虽对GM-CSF刺激均有反应，但鳞癌者AM反应最强，腺癌则不明显。可能不同病理类型肺癌患者AM对GM-CSF刺激的反应也存在差异。Bennett[9]对171例肺癌患者癌组织及正常肺组织进行研究发现，肺癌组织中的前列腺素样物质明显高于正常组织，且不同类型肺癌所产生的前列腺素样物质的量差别很大，其中腺癌产生的量最多。本实验中经GM-CSF刺激后腺癌患者AM生成NO的活性明显低于鳞癌与小细胞未分化癌患者，这是否与不同类型肺癌细胞分泌的抑制因子或其他免疫抑制物的量存在差异有关，或者与不同类型肺癌者AM本身膜通道调节与受体表达不同有关，值得进一步研究。
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第一作者简介 胡成平，女，博士，副教授，硕士导师。
参 考 文 献
1 Kimberly JP,Laskin JD,Shuler RL, et al. Enhanced production of nitric oxide by rat alveolar macrophages after inhalation of a pulmonary irritant is associated with increased expression of nitric oxide synthase.J Immunol,1993,151:7196
2 Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival.J Immunolo Med,1983,65:55
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3 茅惠明.血清中硝酸盐的镀铜镉还原测定法.临床检验杂志，1995，13(1)：6
4 Denis M.Tumor necrosis factor and granulocyte macrophage colony stimulating factor stumulate human macrophage to restrict growth of virulent Mycobacterium aviam and to kill avirulent M avium.J Leukoc Biol,1991,49:380
5 Nicholson S,Bonecini Almeida MG,Silva JRL,et al. Inducible nitric oxide synthase in pulmonary alveolar macrophages from patient with tuberculosis.J Exp Med,1996,183(5);2293
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6 Hibbs JB,Taintor RR,Varin Z. Macrophage cytotoxicity:Role of L-arginine deiminase and imino nitrogen oxidation to nitrite.Science,1987,235:473
7 Higuchi M,Higashi N,Taki H, et al. Cytolytic mechanisms of activated macrophages.J Immunolo,1990,144(4):1425
8 Hill ADK,Redmond HP,Austin OM, et al. Granulocyte macrophage colony stimulating factor inhibits tumor growth.Br J Surg,1993,80:1543
9 Bennett A,Carroll MA,Stamford IF, et al. Prostaglandins and human lung carcinomas.Br J Cancer,1982,46:888
(收稿：1998-01-22), 百拇医药