压力超负荷后大鼠心肌核仁组成区嗜银蛋白的动态变化及其意义
作者：冯兵 陈意生 何作云 周晓波 黄敏
单位：400037 重庆，第三军医大学新桥医院心内科(第一作者现工作于北京军事医学科学院放射医学研究所)
关键词：
中华物理医学与康复杂志990214
【摘 要】 目的 探讨用核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)染色反映压力超负荷后早期心肌肥大的可能性。方法 作心肌AgNORs染色并作图像分析进行相对定量，分析其与心肌肥大进程的关系。结果 随着大鼠血压的升高，左室重量指数于手术5 d开始显著增大(P<0.05)，并持续升高。超微结构显示术后1 d心肌细胞肌浆网逐渐扩张，术后5 d尤以核周和肌膜下明显。线粒体立体计量显示，仅线粒体数密度N在术后5 d时显著增多(P<0.05)，与心肌肥大相关；AgNORs平均颗粒数N、颗粒面积和积分光密度IOD在术后1 d开始出现显著变化，即N显著升高，A、IOD显著降低，这种改变持续至术后30 d。结论 AgNORs染色可反映心肌细胞核活性早期变化，是显示心肌肥大启动的敏感形态学方法。
, http://www.100md.com
压力超负荷 心肌肥大 核仁组成区嗜银蛋白
【中图号】 R318.01
Significance of dynamic changes of AgNORs in rat
heart following pressure overload
FENG Bing,CHENG Yisheng,HE Zuoyun,et al.
Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037
【Abstract】 Objective To determine the possibility of AgNORs in revealing the early response of cardiac hypertrophy due to pressure overload.Methods After AgNORs staining,image analysis were done on progression of cardiac hypertrophy .Results Accompanying the elevation of arterial pressure,the left ventricular mass index increased significantly and continuously (P<0.05). The sarcoplasmic reticulum enlarged gradually at 1 day,and it was obvious about the nucleous and under the membrane.The number of mitochandria elevated markedly at 5 days after operation (P<0.05).The mean number of AgNORs granules (N) increased,area of granules and integral optioal density (IOD) decreased strikingly at 1 day,and it was kept till 30 days after operation.Conclusions AgNORs staining could reveal the early changes of the activity of cardiac nucleous, and it is a sensitive morphological method to demonstrate the initiation of cardiac hypertrophy.
, http://www.100md.com
【Keywords】 Pressure overload Cardiac hypertrophy AgNORs
已经明确，压力超负荷是引起心肌肥大的独立致病因素[1,2]。心肌肥大的实质是心肌细胞核内核糖体大量合成，提高蛋白质合成速率，增加细胞内蛋白质绝对含量，形态上表现为心肌细胞体积增大。过去整体实验采用的反映心肌肥大的指标为心脏肥大指数或测量心肌细胞大小，准确性较差，而且很不敏感。为此，我们试用了核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)染色，发现这种方法可以反映压力超负荷后心肌细胞核活性的早期变化。
1 材 料 与 方 法
1.1 动物模型及实验分组
选用本校实验动物中心提供的健康、雄性Wistar大鼠56只，体质量(151±27) g。将大鼠随机分为3组，且各组均设8个时相点亚组，即对照组(control group,CG,24只，各时点亚组设3只大鼠)、手术组(operation group,OG,32只，各时点亚组为4只)。参照黄生宁等[3]法复制腹主动脉部分缩窄大鼠高血压模型，分别在术后10、30 min,1、4 h,1、5、10、30 d取材。
, http://www.100md.com
1.2 大鼠血压及左心室重量指数的测定
大鼠称重麻醉后，右颈总动脉插管连接二导生理记录仪记录动脉收缩压(SAP)、舒张压(DAP)后，放血处死，迅速取出心脏以预冷的生理盐水洗净血液，滤纸吸干后，称取左心室重量，计算左心室重量指数LVMI(left ventricular mass index)。
1.3 待心肌线超微结构观察及粒体立体定量观察
1.3.1 心肌超微结构观察：采用Philips CM-10型电镜观察记录。
1.3.2 常规透射电镜取材、固定、包埋、定位后,顺肌纤维方向作超薄切片，用Philips CM-10型，电镜观察后，每例切片随机拍取3张照片。采用MD20型真彩色图像分析仪进行线粒体立体计量。照片摄入图象分析系统定标后,测定单位体积内线粒体数量(N)、线粒体表面积密度(A)。线粒体体密度(volume density,Vv): 为线粒体的体积(Vmt)与参照系体积之比(Vref),根据Delesse原理：二维剖面图象上两种结构截面积比，等于它们在空间的体积比，即Vv=Vmt/Vref=Amt/Aref线粒体体积/肌原纤维体积比值(Vv/Vm):方法同前。
, 百拇医药
1.4 心肌核仁组成区嗜银蛋白染色
染色程序按文献[4]方法进行，采用MD20型真彩色图像分析仪进行图象分析。测定条件：物镜放大倍数40×,分别随机选取5个视野，测出每个心肌细胞所含颗粒数(N),每个颗粒的面积(A)与积分光密度(IOD)。
1.5 统计学处理
所有数据均以均数±标准差(
±s)表示，采用本校数学教研室的SPMR统计软件进行组间t检验，以P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 大鼠血压的变化
见表1。腹主动脉部分缩窄大鼠动脉收缩压(SAP)、舒张压(DAP)均逐渐升高，在术后4h即显著升高(P<0.05)，以后持续增加，术后30d时SAP达26.7kPa，增加约68%。这一结果与黄生宁等[4]报道基本一致。
, 百拇医药
表1 腹主动脉部分缩窄大鼠血压的变化(kPa,±s) 参数
组别
10 min
30 min
1 h
4 h
1 d
5 d
10 d
30 d
SAP
, 百拇医药
CG
15.9±2.8
15.5±0.3
15.3±0.3
15.7±1.7
16.0±4.4
17.6±1.5
15.7±2.0
17.9±2.1
OG
16.9±2.3
16.9±2.3
, 百拇医药
17.6±3.1
19.6±1.3*
22.5±2.0**
24.0±2.1**
25.7±2.8**
26.7±3.1**
DAP
CG
13.2±1.9
12.8±1.5
13.5±0.9
, 百拇医药
13.5±3.7
13.9±2.3
15.3±1.7
14.3±1.9
14.5±1.5
OG
14.4±1.7
13.5±1.3
14.4±1.5
17.7±1.5*
18.8±2.5**
, 百拇医药 19.6±1.6**
20.4±3.9**
20.3±3.1**
注:OG与CG比较* P<0.05;OG 与CG比较**P<0.01
2.2 压力超负荷大鼠左心室重量指数的变化
见表2。实验发现，随着血压的升高，大鼠左心室重量指数LVMI在术后5 d时即显著高于对照组(P<0.05)，术后30 d时，LVMI已增加约62%。
表2 腹主动脉部分缩窄大鼠左心室重量指数的动态变化(mg/100g,±s) 组 别
, 百拇医药
10 min
30 min
60 min
4 h
1 d
5 d
10 d
30 d
CG
285±21.3
291±21.3
293±18.9
295±20.3
, 百拇医药
275±57.2
299±30.6
310±11.5
348±27.0
OG
289±19.1
290±32.2
299±23.5
305±48.0
301±15.6
389±73.6*
470±74.2**
, http://www.100md.com
505±30.8**
注:OG与CG比较* P<0.05;OG与CG比较** P<0.01；
2.3 压力超负荷大鼠心肌超微结构改变及线粒体立体定量结果的变化(表3)
表3 压力超负荷心肌线粒体立体定量的变化(,N:×103/μm3,A:μm-1,±s) 参数
组别
10 min
30 min
60 min
, http://www.100md.com
4 h
1 d
5 d
10 d
30 d
N
CG
0.795±0.017
0.793±0.011
0.788±0.024
0.782±0.047
0.779±0.037
, 百拇医药
0.781±0.031
0.772±0.069
0.778±0.032
OG
0.763±0.050
0.710±0.026*
0.718±0.033
0.708±0.050*
0.708±0.036*
0.913±0.017*
, 百拇医药
0.870±0.105*
0.860±0.023**
A
CG
0.214±0.002
0.213±0.011
0.211±0.009
0.212±0.010
0.210±0.007
0.214±0.007
0.213±0.001
, 百拇医药
0.211±0.004
OG
0.217±0.001*
0.219±0.001**
0.222±0.002**
0.223±0.002**
0.225±0.002**
0.224±0.002**
0.203±0.003*
, 百拇医药 0.201±0.003*
Vv
CG
0.154±0.005
0.153±0.010
0.155±0.011
0.149±0.012
0.147±0.002
0.145±0.002
0.150±0.009
0.153±0.011
, 百拇医药
OG
0.148±0.008
0.166±0.029
0.183±0.037*
0.182±0.042*
0.168±0.004*
0.169±0.008*
0.161±0.003
0.160±0.007
Vv/Vm
, 百拇医药 CG
0.645±0.003
0.647±0.010
0.643±0.003
0.641±0.001
0.645±0.007
0.648±0.011
0.645±0.011
0.643±0.008
OG
0.657±0.002
0.683±0.002*
, 百拇医药
0.687±0.001*
0.680±0.007
0.650±0.003
0.645±0.004
0.608±0.012
0.466±0.023
注:OG与CG比较*P<0.05;OG与CG比较** P<0.01
2.3.1 电镜观察：术后10 min心肌线粒体开始出现轻度肿胀，术后30 min至4 h，线粒体肿胀加重，表现为大部分线粒体体积增大，线粒体嵴数量减少，有的完全脱落，甚至空泡化。术后1 d开始心肌肌原纤维间及细胞膜下线粒体数量逐渐增多，术后1 d肌浆网逐渐扩张，术后5 d尤以核周和肌膜下明显。术后5 d及此后大鼠心肌细胞横径增大，肌原纤维增生。
, http://www.100md.com
2.3.2 线粒体图像分析结果表明: 线粒体数密度N在术后30 min至1 d暂时降低(P<0.05)，而于5 d后，逐渐升高。线粒体表面积密度A在术后10 min至5 d时均显著大于对照组(P<0.05)，而于10 d和30 d时却小于对照组(P<0.05)。体密度Vv在术后30 min开始增大4 h最大，之后又逐渐降低。线粒体与肌原纤维的体积比在术后30 min至4 h曾有短暂升高，之后降至正常,30 d时略低于正常。1 d前线粒体的变化提示线粒体肿胀变性，仅在术后5 d时线粒体数密度N的变化与心肌肥大反应相关。
2.4 大鼠心肌AgNORs图像分析结果(表4)
表4 压力超负荷大鼠心肌AgNORs图像分析结果(N:μm-3,A:μm-1,±s) 参数
, http://www.100md.com
组别
10 min
30 min
1 h
4 h
1 d
5 d
10 d
30 d
N
CG
1.450±0.088
1.441±0.011
, http://www.100md.com
1.443±0.025
1.449±0.015
1.451±0.037
1.439±0.017
1.442±0.023
1.452±0.036
OG
1.445±0.027
1.443±0.022
1.453±0.021
1.510±0.037
, 百拇医药
1.788±0.033*
1.895±0.064**
1.900±0.029*
2.585±0.087**
A
CG
1.877±0.085
1.871±0.031
1.881±0.023
1.873±0.034
, http://www.100md.com 1.869±0.029
1.873±0.016
1.854±0.109
1.862±0.099
OG
1.768±0.017
1.793±0.025
1.780±0.014
1.563±0.046
1.533±0.044
1.460±0.033**
, 百拇医药
1.212±0.266**
1.315±0.034**
IOD
CG
8.385±0.605
8.392±0.224
8.279±0.313
8.324±0.385
8.298±0.401
8.252±0.118
8.301±0.199
, 百拇医药
8.271±0.193
OG
7.998±0.123
8.038±0.114
7.948±0.044
7.443±0.053
7.310±0.135*
5.572±3.116*
5.572±3.118*
6.170±0.0161**
, http://www.100md.com
注:OG与CG比较* P<0.05; OG与CG比较**P<0.01
2.4.1 AgNORs颗粒的形态与分布: 光镜见胞核呈淡黄色，AgNORs颗粒呈棕褐色,正常心肌细胞内几乎均只含1～2个颗粒，形态规则,呈油滴状。血管内皮细胞,成纤维细胞与此类似。而术后5 d开始可见心肌细胞核内 AgNORs颗粒数逐渐增多，最多可至3～4个，有的为棕褐色的细小颗粒,有的呈融合团块状。增生的成纤维细胞颗粒数增加更明显。
2.4.2 心肌细胞AgNORs图像分析结果表明: N、A、IOD均在术后1 d开始出现显著变化,即N显著升高，而A、IOD显著降低,这种改变持续至30 d。
3 讨 论
过去整体实验采用的心脏肥大指数或测量心肌细胞大小，均只能反映心肌肥大形成与否，不能反映启动时的心肌肥大反应。本研究观察到急性压力超负荷后早期大鼠心肌细胞超微结构和线粒体的立体计量有较为明显的变化，左心室重量指数在术后5 d时也显著升高，与线粒体数密度变化相似，但用电镜观察程序烦锁，费用昂贵。
, http://www.100md.com
由于受放大倍率的限制，在光镜水平观察细胞核的变化非常困难，近年来，肿瘤研究中用核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)染色检测细胞核活性的方法非常简单实用，且可量化。核仁组成区(NORs)是转录核糖体RNA的环状DNA、核仁组成区中的嗜银蛋白如RNA多聚酶I等与核糖体RMA的转录、核糖体的形成及细胞内蛋白质的合成关系密切[5,6]，可应用AgNORs技术来检测心肌细胞的核酸和蛋白代谢活性。本实验试用AgNORs染色在光镜水平观察心肌细胞核活性的变化，获得了肯定的结果，尤其是在腹主动脉部分缩窄术后1 d时心肌细胞核内AgNORs平均颗粒数N即显著增加，随着观察时间延长，N进一步增加而A及IOD逐渐降低。这一结果与国内外仅有的一篇报道[7]一致。与左室重量指数的变化相比，AgNORs染色更能早期反应蛋白质合成功能的变化，与电镜观察相比，前者更简便、经济、实用。
本课题为国家自然科学基金资助项目(No.3960041)
, 百拇医药 参 考 文 献
1 Komuro I,Katoh Y,Kaida T,et al.Mechanical loading stimulates cell hypertrophy and specific gene expression in cultured rat cardiac myocytes.J Biol Chem ,1991,266:1065-1268.
2 Sadoshima J,Jahn L,Takahashi T,et al.Molecular characterization of the stretch-induced adaptation of cultured cardiac cells.J Biol Chem,1992,267:10551-10560.
3 黄生宁，杨鸿，张晨晖,等.大鼠心脏血压超负荷诱导左心室HSP70基因表达.生理学报，1994,46:333-337.
, http://www.100md.com
4 龚志锦，詹熔洲.病理组织制片和染色技术。上海科技出版社，1994,304-307.
5 Xie WQ,Rothblum L.rDNA transcription and cardiac hypertrophy.Trends cardiovasc Med,1993,3:7-11.
6 Robert-Fortei I,Junera HR,Geraud G,et al.Three-dimensional organization of the ribosomal genes and AgNOR proteins cluring interphase and mitosis in Ptkl cells studied by confocal microscopy.Chromosoma,1993,102: 146-157.
7 Horky M,Horsky P,Kolar F.Different onset of nucleolar activation in endocardial cells and cardiomyocytes following pressure overload in rat heart.J Mol Cell Cardiol,1997,29:2475-2481.
(收稿 1998-05-05 修回 1999-01-05), 百拇医药
单位：400037 重庆，第三军医大学新桥医院心内科(第一作者现工作于北京军事医学科学院放射医学研究所)
关键词：
中华物理医学与康复杂志990214
【摘 要】 目的 探讨用核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)染色反映压力超负荷后早期心肌肥大的可能性。方法 作心肌AgNORs染色并作图像分析进行相对定量，分析其与心肌肥大进程的关系。结果 随着大鼠血压的升高，左室重量指数于手术5 d开始显著增大(P<0.05)，并持续升高。超微结构显示术后1 d心肌细胞肌浆网逐渐扩张，术后5 d尤以核周和肌膜下明显。线粒体立体计量显示，仅线粒体数密度N在术后5 d时显著增多(P<0.05)，与心肌肥大相关；AgNORs平均颗粒数N、颗粒面积和积分光密度IOD在术后1 d开始出现显著变化，即N显著升高，A、IOD显著降低，这种改变持续至术后30 d。结论 AgNORs染色可反映心肌细胞核活性早期变化，是显示心肌肥大启动的敏感形态学方法。
, http://www.100md.com
压力超负荷 心肌肥大 核仁组成区嗜银蛋白
【中图号】 R318.01
Significance of dynamic changes of AgNORs in rat
heart following pressure overload
FENG Bing,CHENG Yisheng,HE Zuoyun,et al.
Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037
【Abstract】 Objective To determine the possibility of AgNORs in revealing the early response of cardiac hypertrophy due to pressure overload.Methods After AgNORs staining,image analysis were done on progression of cardiac hypertrophy .Results Accompanying the elevation of arterial pressure,the left ventricular mass index increased significantly and continuously (P<0.05). The sarcoplasmic reticulum enlarged gradually at 1 day,and it was obvious about the nucleous and under the membrane.The number of mitochandria elevated markedly at 5 days after operation (P<0.05).The mean number of AgNORs granules (N) increased,area of granules and integral optioal density (IOD) decreased strikingly at 1 day,and it was kept till 30 days after operation.Conclusions AgNORs staining could reveal the early changes of the activity of cardiac nucleous, and it is a sensitive morphological method to demonstrate the initiation of cardiac hypertrophy.
, http://www.100md.com
【Keywords】 Pressure overload Cardiac hypertrophy AgNORs
已经明确，压力超负荷是引起心肌肥大的独立致病因素[1,2]。心肌肥大的实质是心肌细胞核内核糖体大量合成，提高蛋白质合成速率，增加细胞内蛋白质绝对含量，形态上表现为心肌细胞体积增大。过去整体实验采用的反映心肌肥大的指标为心脏肥大指数或测量心肌细胞大小，准确性较差，而且很不敏感。为此，我们试用了核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)染色，发现这种方法可以反映压力超负荷后心肌细胞核活性的早期变化。
1 材 料 与 方 法
1.1 动物模型及实验分组
选用本校实验动物中心提供的健康、雄性Wistar大鼠56只，体质量(151±27) g。将大鼠随机分为3组，且各组均设8个时相点亚组，即对照组(control group,CG,24只，各时点亚组设3只大鼠)、手术组(operation group,OG,32只，各时点亚组为4只)。参照黄生宁等[3]法复制腹主动脉部分缩窄大鼠高血压模型，分别在术后10、30 min,1、4 h,1、5、10、30 d取材。
, http://www.100md.com
1.2 大鼠血压及左心室重量指数的测定
大鼠称重麻醉后，右颈总动脉插管连接二导生理记录仪记录动脉收缩压(SAP)、舒张压(DAP)后，放血处死，迅速取出心脏以预冷的生理盐水洗净血液，滤纸吸干后，称取左心室重量，计算左心室重量指数LVMI(left ventricular mass index)。
1.3 待心肌线超微结构观察及粒体立体定量观察
1.3.1 心肌超微结构观察：采用Philips CM-10型电镜观察记录。
1.3.2 常规透射电镜取材、固定、包埋、定位后,顺肌纤维方向作超薄切片，用Philips CM-10型，电镜观察后，每例切片随机拍取3张照片。采用MD20型真彩色图像分析仪进行线粒体立体计量。照片摄入图象分析系统定标后,测定单位体积内线粒体数量(N)、线粒体表面积密度(A)。线粒体体密度(volume density,Vv): 为线粒体的体积(Vmt)与参照系体积之比(Vref),根据Delesse原理：二维剖面图象上两种结构截面积比，等于它们在空间的体积比，即Vv=Vmt/Vref=Amt/Aref线粒体体积/肌原纤维体积比值(Vv/Vm):方法同前。
, 百拇医药
1.4 心肌核仁组成区嗜银蛋白染色
染色程序按文献[4]方法进行，采用MD20型真彩色图像分析仪进行图象分析。测定条件：物镜放大倍数40×,分别随机选取5个视野，测出每个心肌细胞所含颗粒数(N),每个颗粒的面积(A)与积分光密度(IOD)。
1.5 统计学处理
所有数据均以均数±标准差(
±s)表示，采用本校数学教研室的SPMR统计软件进行组间t检验，以P<0.05为差异有显著性。2 结 果
2.1 大鼠血压的变化
见表1。腹主动脉部分缩窄大鼠动脉收缩压(SAP)、舒张压(DAP)均逐渐升高，在术后4h即显著升高(P<0.05)，以后持续增加，术后30d时SAP达26.7kPa，增加约68%。这一结果与黄生宁等[4]报道基本一致。
, 百拇医药
表1 腹主动脉部分缩窄大鼠血压的变化(kPa,
±s) 参数组别
10 min
30 min
1 h
4 h
1 d
5 d
10 d
30 d
SAP
, 百拇医药
CG
15.9±2.8
15.5±0.3
15.3±0.3
15.7±1.7
16.0±4.4
17.6±1.5
15.7±2.0
17.9±2.1
OG
16.9±2.3
16.9±2.3
, 百拇医药
17.6±3.1
19.6±1.3*
22.5±2.0**
24.0±2.1**
25.7±2.8**
26.7±3.1**
DAP
CG
13.2±1.9
12.8±1.5
13.5±0.9
, 百拇医药
13.5±3.7
13.9±2.3
15.3±1.7
14.3±1.9
14.5±1.5
OG
14.4±1.7
13.5±1.3
14.4±1.5
17.7±1.5*
18.8±2.5**
, 百拇医药 19.6±1.6**
20.4±3.9**
20.3±3.1**
注:OG与CG比较* P<0.05;OG 与CG比较**P<0.01
2.2 压力超负荷大鼠左心室重量指数的变化
见表2。实验发现，随着血压的升高，大鼠左心室重量指数LVMI在术后5 d时即显著高于对照组(P<0.05)，术后30 d时，LVMI已增加约62%。
表2 腹主动脉部分缩窄大鼠左心室重量指数的动态变化(mg/100g,
±s) 组 别, 百拇医药
10 min
30 min
60 min
4 h
1 d
5 d
10 d
30 d
CG
285±21.3
291±21.3
293±18.9
295±20.3
, 百拇医药
275±57.2
299±30.6
310±11.5
348±27.0
OG
289±19.1
290±32.2
299±23.5
305±48.0
301±15.6
389±73.6*
470±74.2**
, http://www.100md.com
505±30.8**
注:OG与CG比较* P<0.05;OG与CG比较** P<0.01；
2.3 压力超负荷大鼠心肌超微结构改变及线粒体立体定量结果的变化(表3)
表3 压力超负荷心肌线粒体立体定量的变化(,N:×103/μm3,A:μm-1,
±s) 参数组别
10 min
30 min
60 min
, http://www.100md.com
4 h
1 d
5 d
10 d
30 d
N
CG
0.795±0.017
0.793±0.011
0.788±0.024
0.782±0.047
0.779±0.037
, 百拇医药
0.781±0.031
0.772±0.069
0.778±0.032
OG
0.763±0.050
0.710±0.026*
0.718±0.033
0.708±0.050*
0.708±0.036*
0.913±0.017*
, 百拇医药
0.870±0.105*
0.860±0.023**
A
CG
0.214±0.002
0.213±0.011
0.211±0.009
0.212±0.010
0.210±0.007
0.214±0.007
0.213±0.001
, 百拇医药
0.211±0.004
OG
0.217±0.001*
0.219±0.001**
0.222±0.002**
0.223±0.002**
0.225±0.002**
0.224±0.002**
0.203±0.003*
, 百拇医药 0.201±0.003*
Vv
CG
0.154±0.005
0.153±0.010
0.155±0.011
0.149±0.012
0.147±0.002
0.145±0.002
0.150±0.009
0.153±0.011
, 百拇医药
OG
0.148±0.008
0.166±0.029
0.183±0.037*
0.182±0.042*
0.168±0.004*
0.169±0.008*
0.161±0.003
0.160±0.007
Vv/Vm
, 百拇医药 CG
0.645±0.003
0.647±0.010
0.643±0.003
0.641±0.001
0.645±0.007
0.648±0.011
0.645±0.011
0.643±0.008
OG
0.657±0.002
0.683±0.002*
, 百拇医药
0.687±0.001*
0.680±0.007
0.650±0.003
0.645±0.004
0.608±0.012
0.466±0.023
注:OG与CG比较*P<0.05;OG与CG比较** P<0.01
2.3.1 电镜观察：术后10 min心肌线粒体开始出现轻度肿胀，术后30 min至4 h，线粒体肿胀加重，表现为大部分线粒体体积增大，线粒体嵴数量减少，有的完全脱落，甚至空泡化。术后1 d开始心肌肌原纤维间及细胞膜下线粒体数量逐渐增多，术后1 d肌浆网逐渐扩张，术后5 d尤以核周和肌膜下明显。术后5 d及此后大鼠心肌细胞横径增大，肌原纤维增生。
, http://www.100md.com
2.3.2 线粒体图像分析结果表明: 线粒体数密度N在术后30 min至1 d暂时降低(P<0.05)，而于5 d后，逐渐升高。线粒体表面积密度A在术后10 min至5 d时均显著大于对照组(P<0.05)，而于10 d和30 d时却小于对照组(P<0.05)。体密度Vv在术后30 min开始增大4 h最大，之后又逐渐降低。线粒体与肌原纤维的体积比在术后30 min至4 h曾有短暂升高，之后降至正常,30 d时略低于正常。1 d前线粒体的变化提示线粒体肿胀变性，仅在术后5 d时线粒体数密度N的变化与心肌肥大反应相关。
2.4 大鼠心肌AgNORs图像分析结果(表4)
表4 压力超负荷大鼠心肌AgNORs图像分析结果(N:μm-3,A:μm-1,
±s) 参数, http://www.100md.com
组别
10 min
30 min
1 h
4 h
1 d
5 d
10 d
30 d
N
CG
1.450±0.088
1.441±0.011
, http://www.100md.com
1.443±0.025
1.449±0.015
1.451±0.037
1.439±0.017
1.442±0.023
1.452±0.036
OG
1.445±0.027
1.443±0.022
1.453±0.021
1.510±0.037
, 百拇医药
1.788±0.033*
1.895±0.064**
1.900±0.029*
2.585±0.087**
A
CG
1.877±0.085
1.871±0.031
1.881±0.023
1.873±0.034
, http://www.100md.com 1.869±0.029
1.873±0.016
1.854±0.109
1.862±0.099
OG
1.768±0.017
1.793±0.025
1.780±0.014
1.563±0.046
1.533±0.044
1.460±0.033**
, 百拇医药
1.212±0.266**
1.315±0.034**
IOD
CG
8.385±0.605
8.392±0.224
8.279±0.313
8.324±0.385
8.298±0.401
8.252±0.118
8.301±0.199
, 百拇医药
8.271±0.193
OG
7.998±0.123
8.038±0.114
7.948±0.044
7.443±0.053
7.310±0.135*
5.572±3.116*
5.572±3.118*
6.170±0.0161**
, http://www.100md.com
注:OG与CG比较* P<0.05; OG与CG比较**P<0.01
2.4.1 AgNORs颗粒的形态与分布: 光镜见胞核呈淡黄色，AgNORs颗粒呈棕褐色,正常心肌细胞内几乎均只含1～2个颗粒，形态规则,呈油滴状。血管内皮细胞,成纤维细胞与此类似。而术后5 d开始可见心肌细胞核内 AgNORs颗粒数逐渐增多，最多可至3～4个，有的为棕褐色的细小颗粒,有的呈融合团块状。增生的成纤维细胞颗粒数增加更明显。
2.4.2 心肌细胞AgNORs图像分析结果表明: N、A、IOD均在术后1 d开始出现显著变化,即N显著升高，而A、IOD显著降低,这种改变持续至30 d。
3 讨 论
过去整体实验采用的心脏肥大指数或测量心肌细胞大小，均只能反映心肌肥大形成与否，不能反映启动时的心肌肥大反应。本研究观察到急性压力超负荷后早期大鼠心肌细胞超微结构和线粒体的立体计量有较为明显的变化，左心室重量指数在术后5 d时也显著升高，与线粒体数密度变化相似，但用电镜观察程序烦锁，费用昂贵。
, http://www.100md.com
由于受放大倍率的限制，在光镜水平观察细胞核的变化非常困难，近年来，肿瘤研究中用核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)染色检测细胞核活性的方法非常简单实用，且可量化。核仁组成区(NORs)是转录核糖体RNA的环状DNA、核仁组成区中的嗜银蛋白如RNA多聚酶I等与核糖体RMA的转录、核糖体的形成及细胞内蛋白质的合成关系密切[5,6]，可应用AgNORs技术来检测心肌细胞的核酸和蛋白代谢活性。本实验试用AgNORs染色在光镜水平观察心肌细胞核活性的变化，获得了肯定的结果，尤其是在腹主动脉部分缩窄术后1 d时心肌细胞核内AgNORs平均颗粒数N即显著增加，随着观察时间延长，N进一步增加而A及IOD逐渐降低。这一结果与国内外仅有的一篇报道[7]一致。与左室重量指数的变化相比，AgNORs染色更能早期反应蛋白质合成功能的变化，与电镜观察相比，前者更简便、经济、实用。
本课题为国家自然科学基金资助项目(No.3960041)
, 百拇医药 参 考 文 献
1 Komuro I,Katoh Y,Kaida T,et al.Mechanical loading stimulates cell hypertrophy and specific gene expression in cultured rat cardiac myocytes.J Biol Chem ,1991,266:1065-1268.
2 Sadoshima J,Jahn L,Takahashi T,et al.Molecular characterization of the stretch-induced adaptation of cultured cardiac cells.J Biol Chem,1992,267:10551-10560.
3 黄生宁，杨鸿，张晨晖,等.大鼠心脏血压超负荷诱导左心室HSP70基因表达.生理学报，1994,46:333-337.
, http://www.100md.com
4 龚志锦，詹熔洲.病理组织制片和染色技术。上海科技出版社，1994,304-307.
5 Xie WQ,Rothblum L.rDNA transcription and cardiac hypertrophy.Trends cardiovasc Med,1993,3:7-11.
6 Robert-Fortei I,Junera HR,Geraud G,et al.Three-dimensional organization of the ribosomal genes and AgNOR proteins cluring interphase and mitosis in Ptkl cells studied by confocal microscopy.Chromosoma,1993,102: 146-157.
7 Horky M,Horsky P,Kolar F.Different onset of nucleolar activation in endocardial cells and cardiomyocytes following pressure overload in rat heart.J Mol Cell Cardiol,1997,29:2475-2481.
(收稿 1998-05-05 修回 1999-01-05), 百拇医药